辐射损伤\（\def\h填{\hskip5em}\def\hfil{\hski p3em}\def\eqno#1{\hfil{#1}}\）

的日志 同步加速器 辐射

国际标准编号：1600-5775

第16卷| 第2部分| 2009年3月| 第129-132页

https://doi.org/10.107/S0909049509005238

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用不同方法检测不同条件下蛋白质晶体的辐射损伤

埃尔斯佩思·F·加曼^一*和科林中堂^b条*

^一牛津大学生物化学系分子生物物理实验室，英国牛津OX1 3QU南帕克斯路，以及^b条Diamond光源有限公司，英国牛津郡OX11 0DE迪德科特哈维尔科学与创新校园Diamond House
^*通信电子邮件：elspeth.garman@bioch.ox.ac.uk,colin.nave@diamond.ac.uk

(收到日期：2009年2月10日； 2009年2月12日接受)

过去几年来，蛋白质晶体辐射损伤的研究在几个方面取得了进展。事件校准等基本程序有所改进X射线强度以及计算在具有该强度的已知尺寸和成分的晶体中可能沉积的剂量。人们越来越重视使用其他技术，如光学、拉曼或X射线光谱学补充X射线衍射。不同技术的结果之间的明显差异可以解释为它们对不同的长度尺度或电子状态的变化敏感，而不是对原子的运动敏感。研究在室温和低温下进行，在这两种情况下，都引入了潜在的清除剂分子。这些和其他研究正在全面描述蛋白质晶体在低温和室温下用X射线照射时可能发生的变化。晶体和光谱辐射损伤实验的结果可以与辐射物理和化学领域的其他研究相一致。

关键词： 辐射损伤;蛋白质晶体;拾荒者;显微光谱学.

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在过去几年中，蛋白质晶体学中辐射损伤的理解取得了重大进展，目前正在研究室温和低温下蛋白质晶体的损伤。已经使用了多种技术来补充X射线衍射，并且已经进行了添加清除剂以潜在地减轻辐射损伤的研究。参与这些研究的科学家熟悉辐射损伤的详细机制和后果。然而，大多数晶体学家需要易于理解的指南才能成功实施结构测定在存在潜在严重辐射损伤的情况下，以及有关鉴定由此损伤导致的任何结构文物的建议。本期一篇文章（霍尔顿，2009)是为了满足这一需要而编写的。这也是对辐射损伤研究的有益回顾，其中包括一些有趣的建议，这些建议将从进一步的详细调查中受益。因此，它值得非专业人士和专家阅读。

测量损伤的最相关指标是样品中沉积的吸收剂量（单位质量能量）。这取决于入射光束的特性和该光束在试样中沉积的能量，而能量又由吸收系数样本的数量，即它的组成原子。显然，诸如入射光束“通量”或“强度”等简单术语在科学学科中的定义并不一致。正如霍尔顿（2009）在文章中强调的那样，只有通过仔细定义和一致使用各种术语才能避免潜在的混淆). 样品接收的累积剂量取决于通量（光子mm⁻²)在X射线照射期间由其相关部分接收。通量取决于通量密度（光子⁻¹毫米⁻²)以及曝光时间。这个通量密度同样由光束尺寸确定，并且通量（光子s⁻¹). 不幸的是通量世界各地记录的各种蛋白质晶体学光束线的光束大小并不像需要的那样可靠。表格值可能已经过时，可能是计算而不是测量的，或者根本不可用。一种可靠、方便的测量通量本期中Owen，Holton给出了使用pin二极管的方法等。(2009). 尽管pin二极管会中断光束，但它们可用于在X射线数据采集前后测量光束和/或校准X射线照射期间常用的电离室。为了使这成为一种有效的策略，电离室的值应定期记录在衍射图像标题中，以便可以很容易地转换为通量。光束尺寸本身也不容易定义，除非有一个顶帽轮廓和精确测量的孔径。例如，高斯光束将不均匀地将能量沉积到晶体中，导致例如细胞的差异膨胀和样品中不同程度的特定结构损伤。由于晶体的不同部分受到不同程度的影响，这一现象加剧了辐射损伤引起的问题。最后，需要估计入射光束在晶体中沉积的剂量。该计划的最新发展放射性核素（默里等。, 2004)Paithanhar在本期文章中描述了如何方便地计算高分子晶体学中的这一点等。(2009).

光谱方法越来越多地应用于蛋白质晶体的辐射损伤研究，包括X射线衍射、，X射线光谱学和光学光谱学(例如霍夫等。, 2008). 在本期中，McGeehan的论文等。(2009)和欧文，皮尔逊等。(2009)描述实现此类常规测量的实验安排，以及（共振）拉曼光谱。埃夫斯可用于测量金属配体距离，精确到0.02Ω，因此对金属原子周围原子的微小运动很敏感。X射线光谱学在XANES区域是对氧化状态吸收原子的(例如一个金属原子），发现金属原子可以被极低的X射线吸收剂量还原[例如约3 MGy，减少光系统II（Yano）中50%的MnII中心等。, 2005)]大概是因为他们的高电子亲和力。其他中心的氧化还原状态也会发生快速变化，这些变化可以通过紫外光谱或可见光谱进行监测。红外和拉曼光谱对键断裂和形成、配体结合和构象变化很敏感。最后，X射线衍射仅对原子或原子组的较大运动敏感，是一种监测时间和许多单位细胞平均结构的技术。用不同技术监测辐射损伤时出现的明显差异可以解释为在不同长度尺度上观察到的变化或电子状态的变化。许多由辐射损伤引起的运动，原则上可以通过X射线衍射观察到，在低温下基本上受到抑制。这可能导致错误的结论，即相关原子在氧化状态。同样的考虑也为低温方法成功“抑制”蛋白质晶体中的辐射损伤提供了理由。

蛋白质晶体学中的辐射损伤过程因温度不同而不同(例如室温，100 K，20 K），这取决于是否存在清除剂分子。各种过程的描述可能包括以下事件。

主要事件是光电子的产生，当一个约12keV的光子被轻原子吸收时产生。光电子的路径长度为几微米，对于小晶体来说，光电子可以逃逸，因此造成的损害比所有能量都沉积在晶体中时小（Nave&Hill，2005; Cowan&Nave，2008年). 在晶体中，光电子以非弹性方式散射周围原子，产生数百个光电子二次电子和正电荷中心（奥尼尔等。, 2002). 这些二次电子即使在100K时也可以移动（琼斯等。, 1987). 他们将优先被吸引到高电子亲和力例如，导致金属中心处的还原和原子氧化状态的更普遍变化，从而在整个蛋白质中增加特定的缺电子官能团。许多这些变化可以通过各种光谱技术观察到[例如紫外/可见光谱（Beitlich等。, 2007; 麦基恩等。, 2009)、拉曼（卡彭提尔等。, 2007),XAS公司（科贝特等。, 2007)和EPR（Utschig等。, 2008)]. 当被困在水中时，水合电子（或更普遍的溶剂化电子）具有宽广的光学特性吸收光谱（Ershov和Pikaev，1968年). 水合电子的光谱在X射线照射期间建立起来，但会经历部分衰减（McGeehan等。, 2009)当一些电子重新结合时，光束被关闭(例如带有各种带正电荷的孔）。

Fisher&Devlin（1995）)此前曾研究过低温下质子的迁移率。对于电子和质子来说，隧道机制是克服任何在低温下热振动无法轻易克服的能量屏障的可能方法。质子隧道效应与某些酶反应的机制有关（马斯格拉等。, 2006).

在本期中，Meents等。(2009)假设在肽中观察到的键长变化是由于氨基酸中的氢被提取。这些氢原子可以被提取，例如通过附近产生的自由基，如羟基或其他氢原子，或通过离解电子捕获。

在100K时，其他原子的大幅度运动会受到抑制，因为低温下蛋白质晶体中存在的无定形溶剂是玻璃(即具有液体的结构，但具有刚性结合的原子）。然而，即使在100K时，也会出现局部灵活性，因此可能会发生较小的移动。此类移动是通过X射线衍射和EXAFS公司（与X射线衍射相比，它对较小的原子运动更敏感）。“灵活性”的性质相当不可预测且定义不明确，这意味着很难在残留物的环境之间建立相关性(例如暴露于溶剂或埋地）和损伤敏感性（如果定义为可通过X射线衍射观察到）。这是一个有待更深入探索的领域。最近在100K和150K下辐照乙酰胆碱酯酶晶体的结果表明，这是一个获取蛋白质动态信息的沃土，可以阐明生物功能（Colletier等。, 2008).

在某些情况下，能量屏障可能太高，无法在降低的温度下克服(例如20 K），从而证明在这些较低温度下辐射损伤明显减少。X射线衍射和EXAFS公司（亚诺等。, 2005; 格拉博勒等。, 2006; 科贝特等。, 2007; 正泰（Chinte）等。, 2007; 会见等。, 2007)与100K相比，在7到40K之间的辐射损伤较小。原则上，金属原子可以在周围原子移动最小的情况下减少，并且与100K比较，在40K时可能不会提供额外的保护K.然而，在XANES测量（Corbett）的监测下，观察到了显著的保护（系数为30）等。, 2007). 科贝特的解释等。(2007)是“X射线辐解产生的电子相对于金属位置随机分布，因此只有一小部分可能针对非热反应进行优化”。

为流动性更强的物种（电子和质子）引入清除剂可望减少低温下的辐射损伤，并且有一些证据表明这对特定损伤和非特定损伤（考夫曼等。, 2006; Murray&Garman，2002年; Southworth Davies&Garman，2007年; 霍尔顿，2007; 博雷克等。, 2007). 如上所述，紫外/可见光谱是金属氧化状态的灵敏探针。本期报道的工作（马其顿等。, 2009)，这被用来寻找可能减缓金属蛋白还原速度的清道夫。其中一个候选者被发现是有效的，但仍然不允许从蛋白质的氧化形式中收集完整的衍射数据集。

在室温下，清除剂分子的使用也很有吸引力，因为与低温下相比，它们有可能与更多的流动物种相互作用。最近在室温下进行的研究取得了一些有希望的结果，在两种清除剂存在下强度损失显著降低。有趣的是，与正常观察到的强度相比，清除剂存在时强度随剂量呈线性衰减指数衰减在室温下。本期讨论了这一观察及其对低温下强度衰减机制的影响（巴克等。, 2009).

非特异性损伤是由多个位点的电离和自由基形成增加引起的，而不是早期受损的可识别易损位点。随着剂量的增加，由于许多原子的运动而导致无序增加，导致分辨率降低。这可以称为全球损害。对于整体损伤效应，与室温下的晶体相比，蛋白质晶体在100K下的敏感性变化较小。尚待解决的问题之一是，降低反射强度所需的剂量(例如初始值的一半）与分辨率呈线性关系（豪威尔斯等。, 2005)或最好用线性增加来描述B类剂量系数[如程序中所示最佳（布伦科夫和波波夫，2006年)]. 霍尔顿（2009）对此进行了讨论). 值得注意的是，豪威尔斯的分析所涵盖的分辨率范围比程序中假设的要大得多最佳因此，可能存在一些抽样问题，可以解释这种明显的差异。虽然这两个模型都表明，无法指定一个单独的数字来定义适用于所有分辨率的安全剂量限值，但Owen给出的30 MGy剂量限值指南等。(2006)不过还是有用的。

晶体在低温下发生的许多事件也将在室温下发生，但它们通常会被室温下数据采集期间和之后可能发生的受损和反应物种的大幅度移动所淹没。在这些条件下，损伤（如果定义为衍射实验期间的分辨率损失）很难预测，并且结合诸如放射性核素和最佳变得不那么有用了。在低剂量率（6–10 Gys）下观察到反剂量率效应后⁻¹（索斯沃思-戴维斯等。, 2007)，可以预计在室温下会有一个最佳剂量率。在非常高的剂量率下，未冷却样品中可能会出现较小的温升，从而加速有害物质的扩散。由于即使没有束流也会发生扩散，因此使用较弱的束流收集数据的时间过长可能会导致损伤增加，并且由于其密度较低，流动物种和反应物种的复合率较低。另一个因素，可能是反向剂量率效应的原因，是受损物种重组所需的时间尺度：相对于不利反应的有利反应。

上述对辐射损伤的描述是作者试图总结许多研究人员获得的结果。描述中的某些部分已经确立，而其他部分则不然。