Accuracy of molecular mass determination of proteins in solution by small-angle X-ray scattering

Mylonas, E.; Svergun, D.I.

doi:10.1107/S002188980700252X

会议文件

的日志
应用
结晶学

国际标准编号：1600-5767

第40卷| 第s1部分| 2007年4月| 第245-s249页

doi:10.1107/S00218898070025X

小角度X射线散射法测定溶液中蛋白质分子质量的准确性

伊夫斯特拉提奥斯·米洛纳斯 ^一和德米特里·斯维尔贡 ^a、，^b条 ^*

^一德国汉堡22603号汉堡分站欧洲分子生物学实验室^b条俄罗斯莫斯科结晶研究所
^*通信电子邮件：dmitri@embl-hamburg.de

(收到日期：2006年8月16日； 2007年1月17日接受；在线2007年2月17日)

从大分子溶液的小角度X射线散射（SAXS）实验中可以得出的最重要的总体参数之一是溶质的分子质量（MM）。特别是，对于单分散蛋白质溶液，溶质的MM是根据零角处的外推散射强度计算的我(0). 通过SAXS评估MM提供了有关低聚物状态和溶液中无非特异性聚集的宝贵信息。MM的值可以通过与已知MM的蛋白质标准进行比较来估算，也可以通过使用以下公式确定绝对散射强度来估算：，例如在这两种情况下，都需要了解溶质浓度和蛋白质的部分比体积。通过测量13个具有良好特征的球蛋白（MMs范围为13.7至669 kDa），我们分析了可能的系统偏差的来源，并评估了使用SAXS测定MM的准确性。数据表明，所有这些蛋白质具有大约0.7425厘米的部分比体积的大致相同的“有效”值^三克⁻¹结果表明，蛋白质间和水校准均可用于SAXS分子质量测定，大多数情况下误差不超过10%。

关键词：SAXS公司;绝对校准;分子质量;部分比容;水的散射.

1.简介

从大分子溶液的小角度散射数据中得出的最直接的参数之一是溶质的分子质量（MM）。尽管小角度X射线散射（SAXS）的精确度低于，例如在测定MM时，前一种方法允许在溶液中进行更接近自然状态的测量。SAXS最常见的应用之一是测定生物分子的低聚物状态(例如蛋白质或大分子复合物）或监测聚集或降解过程，这可以通过评估MM值轻松完成。

对于单分散蛋白质溶液，与MM直接相关的特征参数是零角强度我（0）可以使用吉尼尔近似值轻松计算（吉尼尔，1939 )或间接转型计划（格拉特，1977年 ; 斯维尔贡，1992年 ). 因为不可能直接测量蛋白质的绝对强度（Russell，1983 )，必须采用二级标准。在SAXS中，通常使用分子量已知的标准蛋白质，如溶菌酶[例如哈梅尔等。(2002 )]，牛血清白蛋白[例如佩图霍夫等。(2003 )]或葡萄糖异构酶（Kozak，2005 ). 或者，从卢波伦（Kratky，1964）等二级标准散射 )或水（Orthaber等。, 2000 )可用于获得溶质在绝对标度上的散射，然后计算MM。

对于校准，了解溶质浓度(c（c）)和蛋白质的部分比容( $[\bar v]$ )至关重要。当使用标准蛋白质时，通常假设 $[\bar v]$ 标准蛋白质值和实际测量的蛋白质值相同。根据这一假设，这两种蛋白质的分子质量之比与它们的分子质量之比相同我（0）s根据浓度标准化。用水时 $[\bar v]$ 值显式地进入方程来计算MM，实际上，后一个值对 $[\bar v]$ （费金和斯维尔根，1987年 ). 实际上，在MM测定中，浓度和部分比体积的不准确性往往比计算精度的误差更大我（0）本身。

本文对SAXS中MM测定的准确性进行了系统研究。通过测量表征良好的商用蛋白质溶液（涵盖13.7至669 kDa范围广泛的MMs）来确定我（0）值。分析了系统误差的可能来源，并采用重复测量来最小化测量溶质浓度和推断的误差我（0）值。根据这些结果，提出了溶液中球形蛋白的部分比体积的“最佳”值。

2.材料和方法

2.1. 蛋白质制备和浓度测定

蛋白质核糖核酸酶A、糜蛋白酶原A、卵清蛋白、醛缩酶、过氧化氢酶和甲状腺球蛋白是GE Healthcare的LMW（低分子量）和HMW（高分子量）凝胶过滤校准试剂盒的一部分（产品代码分别为17-0442-01和17-0441-01）。碳酸酐酶、乙醇脱氢酶、，β-淀粉酶和脱铁蛋白是Sigma（产品代码MWGF 1000）分子量为29000–700000的试剂盒的一部分。蛋清中的溶菌酶来自Fluka（产品代码62971），BSA H2型来自Gerbu Biotechtick（产品代码1064），葡萄糖异构酶来自Hampton Research（产品代码HR7-100）。除脱铁蛋白和葡萄糖异构酶外，所有蛋白质均呈粉末状，溶解在低盐缓冲液中或溶解后透析过夜。将去铁蛋白和葡萄糖异构酶通宵透析到适当的缓冲液中。使用的缓冲器为100 mM（M）Tris 100米M（M）NaCl，pH 7.5，除溶菌酶外的所有蛋白质（40 mM（M）乙酸50 mM（M）NaCl pH 4.0），BSA（50 mM（M）HEPES pH值7.5）和葡萄糖异构酶（100 mM（M）Tris 1米M（M）氯化镁₂pH值8.0）。溶质浓度通过使用Eppendorf分光光度计（在6M（M）氯化胍缓冲液）或纳米滴ND-1000分光光度计（在正常透析缓冲液中）。重复测量吸收以提高准确性；蛋白质的天然状态和变性状态的测量结果没有显著差异。使用在线工具计算蛋白质的消光系数保护参数（Gasteiger公司等。, 2005 ).

2.2. 部分比体积测定

浓度为5和10 mg ml的蛋白质溶液⁻¹制备合适的缓冲液，并在安东·帕尔DMA 5000密度计上进行测量。 $[\bar v]$ 可以使用以下公式计算

$[{\barv}={{1}\over{d_{rmbuff}}}（1-{d_}\rmp}-d{rmbuff}}\over{c}}）]$

哪里d日_浅黄色是缓冲器的密度，d日_第页是蛋白质溶液的密度c（c）是蛋白质浓度。一个免费程序，塞登特普（菲罗等。, 1995–2006 )用于基于蛋白质的氨基酸组成计算部分比体积。该程序预测 $[\bar v]$ 对于298 K，但这些值被调整为测量的实际温度（288 K），并且校正不超过1%。不同作者报告的实验值（Durchschlag，1986 ; 珀金斯，1986年 ; 哈帕斯等。, 1994 )也使用了。

2.3. SAXS数据收集和处理

上述蛋白质溶液的同步辐射X射线散射数据在EMBL（DESY，汉堡）的X33束线处收集（Koch&Bordas，1983 )使用MAR345成像探测器。在288 K下，测量散射模式，暴露时间为2-5分钟。溶质的浓度约为2-5 mg ml⁻¹对于MM>50 kDa和约5-12 mg ml的蛋白质⁻¹对于MM<50 kDa的蛋白质。样品到探测器的距离为2.7 m，覆盖的散射矢量模数范围为0.09<秒<5纳米⁻¹[秒= 4π罪(θ)/λ，其中2θ是散射角和λ=0.15 nm是X射线波长]。恒定的水散射是通过在293 K下从充满蒸馏水的空试管中减去散射来确定的。在六个单独的实验阶段重复测量蛋白质和水散射，并将结果平均。

使用标准程序处理数据，并使用程序包根据浓度进行标准化原始的（科纳列夫等。, 2003 ). 前向散射我（0）和回转半径R（右）_克使用吉尼尔近似值进行评估（吉尼尔，1939)假设角度很小(秒< 1.3R（右）_克)强度表示为我(秒) =我（0）经验[−(新加坡特别行政区_克)²/3]. 此外，我（0）s和R（右）_克s以及最大尺寸D类_最大值和原子间距离分布函数第页(第页)使用间接转换包计算GNOM公司（斯维尔贡，1992年). 使用该程序与已知的高分辨率模型进行了比较CRYSOL公司（斯维尔贡等。, 1995 )通过调整颗粒的排除体积和水化层的对比度，符合实验强度。

2.4. 分子质量计算

2.4.1. 蛋白质校准

使用标准蛋白质校准简单配方时

$[{\rm-MM}_{\rm-p}=I（0$

使用，其中我(0)_第页和我(0)_标准分别是研究蛋白质和标准蛋白质在零角的散射强度，MM_第页和MM_标准是相应的分子质量c（c）_第页和c（c）_标准是浓度。这里，预期分子质量与我（0）根据浓度归一化，计算每个蛋白质。然后，确定这些比率的平均值，排除异常值(即蛋白质与其余蛋白质偏离太多）。随后，将此值与我（0）s通过蛋白质间的相互校准给出了MMs。基本上，这个程序计算每个蛋白质的MM，并将所有其他蛋白质视为校准物，因为我们知道它们的实际MM。

2.4.2. 绝对的我（0）用水测定

计算前向散射我（0）在绝对标度下，水的已知散射为1.632×10⁻² 厘米⁻¹在288 K时使用（Orthaber等。, 2000). 通过划分相对我蛋白质的（0）s与水的实验恒定散射，然后乘以水的绝对散射，得到我绝对标度下蛋白质的（0）s。为了计算kDa中的分子质量（MM），我们使用了以下公式（Feigin&Svergun，1987; 奥塔贝尔等。, 2000)毫米=[N个_A类我(0)/c（c）]/Δρ_M（M）²，其中我(0)/c（c）是根据浓度归一化的前向散射，Δρ_M（M）= [ρ_{M、保护}− (ρ_解决 $[\bar v]$ )]第页_o（o）是每质量的散射对比度，N个_A类= 6.023 × 10²³ 摩尔⁻¹是阿伏伽德罗数字，ρ_{M、保护}= 3.22 × 10²³ 例如⁻¹是每质量干蛋白质的电子数，ρ_解决= 3.34 × 10²³ e厘米⁻³是每体积水溶剂中的电子数， $[\bar v]$ 是蛋白质的部分比体积第页_o（o）= 2.8179 × 10⁻¹³cm是电子的散射长度。

3.结果

图1显示了从蛋白质数据库（PDB；Bernstein等。, 1977 ). 晶体模型的PDB代码如表1所示（甲状腺球蛋白没有同源结构）。在大多数情况下，根据晶体学模型计算的曲线拟合得相当好，但也存在一些异常值（拟合以虚线显示），这表明晶体中蛋白质的晶体结构或低聚物组成与溶液中的不同。表1总结回转半径(R（右）_克)和我（0）s（针对浓度和水散射进行归一化后的绝对尺度），使用Guinier外推法（结果代表六个独立实验阶段的平均值）。这个我（0）和R（右）_克计算值GNOM公司（未显示）非常相似。观察到与之前报告的其他蛋白质的值非常一致，例如葡萄糖异构酶（Kozak，2005)和溶菌酶（Orthaber等。, 2000).

表1
所研究蛋白质的实验和计算结构参数

蛋白质	MM（千达）	使用的PDB	防抱死制动系统我(0)/c（c）(10⁻² 厘米² 毫克⁻¹)	R（右）_克（纳米）	MM（毫米）₁（千Da）	MM（毫米）₂（千Da）	MM（毫米）_三（千Da）	Δ₁(%)	Δ₂(%)	Δ_三(%)
核糖核酸酶A	13.7	1层3	1.00 ± 0.05	1.58 ± 0.04	10.3	13.9	10	−24.6	1.4	−27.0
溶菌酶	14.3	1LYZ公司	1.03 ± 0.06	1.43 ± 0.04	11.2	14.3	11.1	−21.9	0	−22.7
胰凝乳蛋白酶原	25	2加仑	1.85 ± 0.03	1.85 ± 0.01	22.9	25.7	23.4	−8.3	2.6	−6.4
碳酸酐酶	29	1V9E型	2.39 ± 0.15	2.08 ± 0.03	30.8	33.1	29.4	6.4	14.2	1.5
卵清蛋白	45	1个OVA	3.21 ± 0.08	2.66 ± 0.04	41.9	44.6	46	−6.8	−1.0	2.2
英国标准协会	66	1个N5U	4.84 ± 0.13	2.99 ± 0.08	60.4	67.1	62.2	−8.5	1.7	−5.7
乙醇脱氢酶	150	1JVB公司	6.24 ± 0.26	3.27 ± 0.03	85.3	86.4	92.6	−43.1	−42.4	−38.3
醛缩酶	158	1南非兰特	11.16 ± 0.70	3.51 ± 0.13	144	155	150	−8.7	−2.2	−5.2
葡萄糖异构酶	173	1个负载	11.58 ± 0.24	3.25 ± 0.07	137	160	–	−20.6	−7.2	–
β-淀粉酶	200	1层2	13.53 ± 1.32	4.22 ± 0.04	174	187	–	−12.9	−6.3	–
过氧化氢酶	232	4BLC公司	15.85 ± 0.40	3.84 ± 0.13	187	220	197	−19.5	−5.4	−15.2
载脂蛋白	440	国际能源监管局	25.91 ± 2.56	7.05 ± 0.21	324	359	345	−26.3	−18.4	−21.6
甲状腺球蛋白	669	–	53.01 ± 1.88	7.56 ± 0.19	622	734	–	−7.0	9.7	–
平均								16.5	8.7	14.6
符号：MM₁和Δ₁计算方法为 $[\bar v]$ 根据序列预测的值（表2)，毫米₂和Δ₂计算方法为 $[\bar v]$ =0.7425厘米^三克⁻¹和MM_三和Δ_三使用报告的实验值计算 $[\bar v]$ （见表2). 底部一行中的平均值是根据偏差的绝对值计算得出的。

图1
实验散射和拟合。实验数据显示为带有误差条的点，晶体模型的拟合由CRYSOL公司（斯维尔贡等。, 1995

)显示为实线。用虚线显示的离群值拟合及其曲线用粗体编号。散射强度的对数(我)绘制为散射矢量模量的函数秒; 拟合沿对数轴适当偏移，以便更好地显示。（1）核糖核酸酶A，（2）溶菌酶，（3）糜蛋白酶原A，（4）碳酸酐酶，（5）卵清蛋白，（6）牛血清白蛋白，（7）乙醇脱氢酶，（8）醛缩酶，（9）葡萄糖异构酶，（10）β-淀粉酶、（11）过氧化氢酶、（12）脱铁蛋白和（13）甲状腺球蛋白（后者无高分辨率模型）。对异常值（碳酸酐酶、乙醇脱氢酶、脱铁蛋白）进行了划线。

最初，我们通过相互校准来评估结果的总体一致性。三种蛋白质（碳酸酐酶、乙醇脱氢酶和脱铁蛋白）在计算的MMs和预期的MMs之间显示出显著的偏差，而其余十种蛋白质是自洽的，与预期的MM/我(0). 如图1所示根据前三种蛋白质的晶体结构计算出的散射模式得出的曲线与实验数据有显著偏差。考虑到这些偏差，这三种蛋白质的寡聚状态可能与晶体结构预期的不同(例如但也不能排除非特定聚集和杂质。因此，这三种蛋白质被从进一步的分析中省略，在忽略这三个异常值后，预期和计算的MM之间的平均偏差为8.7%。

表2第三列部分比体积由氨基酸组成计算得出（Durchschlag，1986; 珀金斯，1986年; 哈帕斯等。, 1994). 图2给出了使用这些值计算出的MM和表1可以看出，对于大多数蛋白质来说，MMs都被大大低估了。事实上，对于其中五种蛋白质，偏差超过20%，没有一个MM在预期值的5%以内（计算值和预期值之间的总差异为16.5%）。使用Durchschlag（1986）公布的一致实验值时)，珀金斯（1986)和哈帕兹等。(1994)（表2，第四列；对于三种蛋白质，没有这样的值），得到了类似的结果，总差异为14.6%（图2). 我们还测量了 $[\bar v]$ 在Anton Paar密度计上对所有蛋白质进行实验，如材料和方法但由于每次测量都需要大量（2 ml）样品，因此很难进行可靠的实验测定。在单个密度测量之间观察到显著偏差，对于许多样品 $[\bar v]$ 因此无法进行可靠评估。值得注意的是，在所有情况下，当获得可再现值时，它们都大大超过了氨基酸序列预测的值（见表2).

表2
部分特定卷( $[\bar v]$ )（厘米^三克⁻¹)蛋白质的

蛋白质	试验这项工作	计算塞登特普	以前的实验报告
核糖核酸酶A	0.73 ± 0.01	0.7072	0.703
溶菌酶	–	0.7133	0.712
胰凝乳蛋白酶原	0.76 ± 0.01	0.7296	0.732
碳酸酐酶	–	0.7345	0.729
卵清蛋白	0.75 ± 0.01	0.7357	0.746
英国标准协会	0.74 ± 0.02	0.7305	0.734
乙醇脱氢酶	–	0.7411	0.750
醛缩酶	–	0.7347	0.739
葡萄糖异构酶	–	0.7246	–
β-淀粉酶	0.75 ± 0.03	0.7343	–
过氧化氢酶	–	0.7239	0.730
载脂蛋白	–	0.7309	0.738
甲状腺球蛋白	–	0.7234	–

图2
不同蛋白质的MMs比较。下部面板显示计算值与预期MM的比率。对异常值（碳酸酐酶、乙醇脱氢酶、脱铁蛋白）进行了划线。

通常的做法是假设大多数球状蛋白的部分比体积具有相似的值[约0.74 cm^三克⁻¹;例如费金和斯维尔根（1987)]. 该值远高于所有蛋白质的计算值（除乙醇脱氢酶外），因此计算的MMs将更接近理论值。因此，我们优化了 $[\bar v]$ 所有十种蛋白质的计算MMs与预期MMs之间的偏差最小，这在使用相互校准程序时是一致的。平均值为0.7425厘米^三克⁻¹，非常接近上述球状蛋白的经验共同值。表1中给出的计算MMs与使用预测的MM计算的值相比，与预期MM的一致性要好得多 $[\bar v]$ ，平均偏差下降至8.7%（并非意外，达到了通过联校程序获得的偏差）。

4.结论和讨论

上述结果表明，SAXS能够提供误差在10%左右的MM估计值，前提是测量溶质浓度的准确度为5-10%，通常在分光光度实验中可以实现。这个精度范围足以可靠地测定蛋白质的低聚物状态(例如单体与二聚体）。标准蛋白质和水校准的使用具有相同的精确度，这两种方法很容易互换。特别是，最常用于校准的蛋白质溶菌酶和牛血清白蛋白与预期值的偏差分别为0和1.7%，可以安全地用作标准。相互校准和水校准都需要额外的测量（在第一种情况下是标准蛋白质测量，在第二种情况下则是空白样品室），因此采用一种或另一种方法比较方便。

另一个有趣的结果，尽管可能并不意外，是溶液中的球状蛋白似乎具有约0.7425厘米的常见“有效”部分比体积^三克⁻¹比大多数氨基酸衍生物（Philo等。, 1995–2006)或早期报道的实验（Durchschlag，1986; 珀金斯，1986年; 哈帕斯等。, 1994)部分特定卷。事实上，使用（较小的）氨基酸衍生体积得出的MM估计值与序列的预期值以及我们对 $[\bar v]$ 建议它们应该高于预测值。此外，基于氨基酸数据的计算值对纯水中的蛋白质有效，缓冲液中的助溶剂也可能影响部分比体积。这意味着，理想情况下，它们应该在用于SAXS实验的缓冲区中确定。测量的主要困难 $[\bar v]$ 使用密度计进行可靠的实验测定需要几十毫克蛋白质。通常，蛋白质表达和纯化的产量不允许有足够数量的蛋白质用于密度测量，因此很难期望实验值在大多数实际研究中可用。因此，我们建议“有效”值为0.7425厘米^三克⁻¹，对于大多数球状蛋白来说，这应该提供足够好的准确度（平均在10%以内）。

致谢

我们要感谢Jan Skov Pedersen和软凝聚物质物理化学小组（奥胡斯大学化学系）的工作人员给我们机会进行密度测量，以确定部分比体积。

工具书类

Bernstein，F.C.，Koetzle，T.F.，Williams，G.J.B.，Meyer，E.F.Jr，Brice，M.D.，Rodgers，J.R.，Kennard，O.，Shimanouchi，T.&Tasumi，M.（1977年）。分子生物学杂志。 112, 535–542.CSD公司交叉参考中国科学院公共医学科学网
 Durchschlag，H.（1986年）。生物化学和生物技术热力学数据由H.-J.Hinz编辑，第45页。柏林：Springer-Verlag。
Feigin，L.A.和Svergun，D.I.（1987）。小角度X射线和中子散射结构分析纽约：Plenum出版社。
Gasteiger，E.、Hoogland，C.、Gattiker，A.、Duvaud，S.、Wilkins，M.R.、Appel，R.D.和Bairoch A.（2005）。ExPASy服务器上的蛋白质鉴定和分析工具在里面蛋白质组学协议手册由J.M.Walker编辑，第571-607页。美国托托瓦：Humana出版社。
Glatter，O.（1977年）。J.应用。克里斯特。 10, 415–421.交叉参考 IUCr日志科学之网
 Guinier，A.（1939年）。安·物理。(巴黎),12, 161–237.中国科学院
 Hammel，M.、Kriechbaum，M.，Gries，A.、Kostner，G.M.、Laggner，P.和Prassl，R.（2002）。分子生物学杂志。 321, 85–97.科学网交叉参考公共医学中国科学院
 Harpaz，Y.、Gerstein，M.和Chothia，C.（1994年）。结构,2, 641–649.交叉参考中国科学院公共医学科学网
 Koch，M.H.J.和Bordas，J.（1983年）。编号。仪器。方法,208, 461–469.交叉参考中国科学院科学网
 Konarev，P.V.、Volkov，V.V.、Sokolova，A.V.、Koch，M.H.J.和Svergun，D.I.（2003）。J.应用。克里斯特。 36, 1277–1282.科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志
 Kozak，M.（2005）。J.应用。克里斯特。 38, 555–558.科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志
 Kratky，O.（1964年）。费森尤斯J.分析。化学。 201, 161–194.交叉参考中国科学院科学网
 Orthaber，D.、Bergmann，A.和Glatter，O.（2000年）。J.应用。克里斯特。 33, 218–225.科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志
 Perkins，S.J.（1986年）。欧洲生物化学杂志。 157, 169–180.交叉参考中国科学院公共医学科学网
 Petoukhov，M.V.、Svergun，D.I.、Konarev，P.V.、Ravasio，S.、van den Heuvel，R.H.、Curti，B.和Vanoni，M.A.（2003）。生物学杂志。化学。 278, 29933–29939.科学网交叉参考公共医学中国科学院
 Philo，J.、Hayes，D.B.和Laue，T.（1995-2006）。塞登特普,https://www.jphilo.mailway.com/.
罗素·T（1983）。J.应用。克里斯特。 16, 473–478.交叉参考中国科学院科学网 IUCr日志
 Svergun，D.I.（1992）。J.应用。克里斯特。 25, 495–503.交叉参考科学网 IUCr日志
 Svergun，D.I.，Barberato，C.&Koch，M.H.J.（1995）。J.应用。克里斯特。 28, 768–773.交叉参考中国科学院科学网 IUCr日志