1.简介
DNA光解酶是古老且普遍存在的含黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的酶(Essen&Klar,2006)
)利用蓝光能量以序列依赖的方式修复紫外线诱导的DNA损伤。此外,它们构成了任何生物系统中最古老、最保守的DNA修复途径(Mei&Dvornyk,2015)
). DNA光解酶已进化为对两种主要的UV DNA光产物作出反应,即6–4嘧啶–嘧啶二聚体(6–4光产物)和环丁烷嘧啶二聚物(CPD)。因此,DNA光解酶在功能上可分为(6–4)和CPD光解酶(Lucas-Lledó&Lynch,2009
). CPD光解酶在遗传学上可进一步分为I类、II类、cry-DASH和最近的III类(Scherer等。, 2015
). 密切相关的隐花色素主要作为蓝光感光体通过氧化生色团的光依赖性还原(光还原;Geisselbrecht等。, 2012
). 有趣的是,隐色素可以通过光诱导形成磁敏自由基对来发挥磁受体的作用(Ritz等。2000年
).
虽然DNA光解酶在系统发育上差异很大(Kiontke等。, 2011
),它们都共享一个通用的两域拓扑。这两个结构域的元素都参与DNA识别和结合,而每个结构域都有一个单一的捕光辅因子作为发色团(Geisselbrecht等。, 2012
; Kiontke公司等。, 2011
; Mees公司等。, 2004
). DNA光解酶的C末端结构域普遍含有一个减少的FAD辅因子(FADH−)独特的U形构造(Mees等。, 2004
)它既有吸收光的作用,又有催化作用。N末端结构域的辅因子,即所谓的天线发色团,根据系统发育关系而变化(Kiontke等。, 2014
). 天线发色团增加吸收横截面酶的活性。高效的光驱动DNA修复是通过类Förster实现的能量传递从天线辅因子到催化FADH−对蓝光的吸收相对较弱(Essen&Klar,2006
). 在CPD光解酶修复CPD DNA的过程中,FADH−吸收单个蓝色光子,产生激发的FADH−(FADH公司−*). 然后,辅因子将一个电子注入结合的CPD病变,产生一对自由基,即氧化自由基FADH(
)和减少的自由基阴离子损伤
(韦伯,2005年
; Brettel&Byrdin,2010年
).
然后几乎无障碍地分裂成它的组成碱,电子被反传递到
.
所有之前发布的CPD光解酶–DNA共晶结构表明,为了实现最佳FADH−至CPD距离电子转移,组成CPD的两个碱基必须以大约120°的角度从DNA链中翻转出来,从而进入光解酶催化位点(Kiontke等。, 2011
). 与其他DNA修复酶一样(Qi等。, 2009
),CPD光解酶似乎在解封CPD中发挥了积极作用,因为光损伤DNA的构象空间不允许CPD损伤从核苷酸链中自发翻转(Knips&Zacharias,2017
). 此外,已经证明不能从dsDNA中翻转CPD是cry-DASH蛋白的一个共同特征,cry-DASH蛋白作为光裂解酶,仅对单链DNA(Pokorny等。, 2008
). 有趣的是,一些祖先的cry-DASH蛋白确实保留了dsDNA修复活性(Tagua等。, 2015
)这进一步支持在所有其他dsDNA-修复、CPD光解的CPD触发中发挥积极作用。
由于CPD光解酶结合和随后的碱基折叠,CPD引起的自然DNA畸变加剧。含有游离CPD的DNA已经显示出扭结,即DNA主干的急剧弯曲涉及相邻的基板拆垛(Dickerson,1998
),在光损伤时约为30°(Husain等。, 1988
; 公园等。, 2002
). 光解酶结合的CPD DNA进一步扭曲,CPD损伤处的扭结角约为50°(Kiontke等。, 2011
; Mees公司等。, 2004
). 此外,在II类CPD光解中,CPD下游的DNA错位,即横向弯曲,与I类CPD光解酶(Kiontke等。, 2011
). 在I类和II类CPD光解中,由于CPD损伤的脱毛和翻转,沿着DNA链打开的空白空间,即然后,未配对的气泡通过位于连接螺旋线的环内的侧链来稳定α17和α18(Kiontke)等。, 2011
; Mees公司等。, 2004
). II类CPD光解酶稳定DNA链中的气泡通过 π-三种保守氨基酸Arg429、Trp431和Arg441在上述环中的堆积(补充图S1一),以及与不成对的互补碱基的离子相互作用(Kiontke等。, 2011
),而I类CPD光解使用一组不同的相互作用(Essen&Klar,2006
).
这些观察结果已得到证实通过可用的高分辨率共晶与DNA(Pokorny)复合物中I类、II类和cry-DASH CPD光解酶的结构等。, 2008
; Kiontke公司等。2011年
; Mees公司等。, 2004
; Selby&Sancar,2006年
). 然而,主要由于在净化化学合成的天然CPD方面存在挑战,这些配合物共享合成CPD类似物的使用,其中,离子内磷酸二酯键被不带电的甲缩醛部分取代。因此,CPD损伤部位的DNA主干负电荷被消除。然而,如上所述,碱基滑动稳定化涉及带正电荷的氨基酸与CPD主链附近的未配对碱基相互作用。因此,迄今为止描述的CPD结合模式和在催化位点稳定单链DNA的机制是否完全代表了生理光解酶-DNA复合物是值得怀疑的。为了解决这个问题,我们在这里提出第一个共晶的结构马氏甲烷八叠球菌Ⅱ类CPD光解酶(嗯CPDII)与完全天然、含磷酸二酯酶的CPD DNA复合体,分辨率为2.7º。正如预期的那样嗯CPDI-DNA复合物类似于先前发表的含有甲缩醛键的结构(Kiontke等。, 2011
). 一方面,我们在这里显示的数据证实了之前关于顺式–同步器-活性部位内的环丁烷加合物,包括独特的六水簇(6WC)的存在和作用。然而,CPD损伤的结合部位及其对映体在氨基酸侧链和非配对碱的放置以及水合球中表现出细微的差异,这导致了更明显的DNA扭结。这使我们确定了连接螺旋的环α17和α18是一个高度保守的泡状侵入区(BIR),负责非配对泡状稳定和磷酸盐识别。因此,CPD损伤中存在的层内磷酸二酯部分深刻影响了对受损DNA的识别,并且对于II类CPD光解酶中有效的DNA结合至关重要。
2.材料和方法
2.1. 合成和杂交光损伤DNA
具有与先前描述的具有PDB编码的结构相同序列的DNA双链体2xrz(2xrz)(Kiontke等。2011年
)被雇佣。带有序列d(5′-TGCGCAAGCCGAT-3′)的互补非光损伤DNA是从台湾台北基因组有限公司大量订购的。另一方面,单链光损伤DNA是在内部合成的。用于顺式–同步器CPD购自美国弗吉尼亚州斯特林市格伦研究所(Glen Research,Virginia,Sterling)。CPD构建块和核苷磷酰胺盐溶液(格伦研究)安装在应用生物系统3400 DNA合成器上,并根据制造商的说明合成了14-mer,d(5′-ATCGGCT<>TCGCA-3′)。在用硫酚处理固体载体使CPD部分的磷酸二酯内基团脱保护后,进行裂解和脱保护。寡核苷酸通过Gilson分析HPLC系统进行分析和纯化,在该系统上Watersμ安装了Bondasphere C18,5µm,300º色谱柱(3.9×150 mm)。在0.1中以5–13%乙腈的线性梯度运行色谱柱M(M)乙酸三乙酯铵,pH 7.0,历时20分钟。通过蒸发干燥合并的溶液,并使残留物通过NAP-10(GE Healthcare,Buckinghamshire,England)和阳离子交换(AG 50W-X2,Na+表格,Bio-Read Laboratories,Hercules,California,USA)栏。两股钢绞线均在储存缓冲液(100 m)中溶解M(M)Tris–HCl pH 8.0,100 mM(M)NaCl),以1:1摩尔比混合,并通过将溶液加热至95°C,然后在3小时内缓慢降低温度至25°C,在热循环器中进行杂交。
2.2. 蛋白质生产和纯化
蛋白质生产和纯化遵循既定指南(Kiontke等。, 2011
). 简要地,大肠杆菌BL21(DE3)细胞通过一个基于pET-28的构建物进行转化,该构建物包含MM_0852开放阅读框,其编码嗯CPDII(GenBank ID AAM30548.1)。蛋白质产生了通过在25°C的TB培养基中进行自诱导,每升培养物的蛋白质产量超过100 mg。细胞颗粒重新悬浮在缓冲液中(50 mM(M)磷酸盐缓冲液pH 8.0,300 mM(M)NaCl)并溶解。清除细胞碎片后通过第二步离心,将上清液加载到10 ml镍-NTA自包装柱上,洗脱蛋白质通过增加250 mM(M)咪唑至运转缓冲器。作为最后的抛光步骤,将蛋白质装载到尺寸排除色谱法含有Superdex 200的色谱柱与10 m相平衡M(M)Tris–HCl pH 8.0,100米M(M)氯化钠。
2.3. 蛋白质结晶和数据采集
蛋白质-DNA复合物在黑暗和氧化条件下制备(即暴露在空气中),以避免自发DNA修复,方法是将蛋白质溶液与1.25倍摩尔过量的dsDNA混合,使最终蛋白质浓度在6.0至6.5 mg ml之间−1.在黑暗中培养30分钟后,晶体生长通过在由2µl蛋白质–DNA样品溶液和2µ1结晶缓冲液组成的4µl液滴中的蒸汽扩散[0.1M(M)醋酸钠pH值4.6,0.25M(M)硫酸铵,4%(w个/v(v))聚乙二醇4000]。24小时后,用环捕出晶体,并在添加30%的结晶缓冲液中进行低温保护(v(v)/v(v))甘油和数据是在台湾NSRRC的TPS-05A光束线上或日本SPring-8的BL32XU上测量的。
4.讨论
CPD光解酶的功能众所周知(钟,2015
; Brettel&Byrdin,2010年
)特别是由于高分辨率的可用性共晶含有CPD的DNA与CPD光解酶(Kiontke)活性位点结合的结构等。, 2011
; Mees公司等。, 2004
). 然而,这些结构的一个显著缺点是,在所有情况下,共晶体中使用的CPD DNA缺乏自然发生的CPD损伤形式,而是包含一种化学合成的类似物,其中碱之间带负电的离子内磷酸二酯键被中性的甲缩醛部分取代。这种缺乏天然骨架的现象如何影响DNA结合和识别尚不清楚,尽管据推测这种影响很小。我们的第一个CPD光解酶结构,嗯CPDII与天然磷酸二酯酶结合的CPD的复合物显示,在未配对DNA泡如何被II类光解酶稳定方面存在相当大的差异。
由于嘧啶二聚体部分在天然CPD和人工CPD中是相同的,所以毫不奇怪嗯CPDII活性位点能够同样很好地调节两者(图2
). 然而,DNA骨架中的甲缩醛和磷酸二酯基团在体积、疏水性和电荷方面存在明显差异(图2
一)导致CPD碱基滑移后出现的未成对DNA气泡发生显著的结构变化(图2
c(c)).
Arg429、Trp431和Arg441三种氨基酸的存在是通过与两个相邻碱基(Arg429与dA7′或dA8′和Trp431与dC9)和翻转的主链相互作用来堵塞未配对的气泡的关键,即天然CPD中的磷酸二酯或合成CPD类似物中的甲缩醛键(Arg441;图2
). 总的来说,这些氨基酸负责堵塞气泡体积的三分之一左右(表1
,图3
),而其余部分是溶剂可及的。此外,它们的构象以及翻转的CPD的构象负责与光解酶(Kiontke)结合的DNA的特征扭结角等。, 2011
).
稳定DNA畸变也是许多其他DNA结合蛋白的基本特征(沃纳等。, 1996
; Rohs公司等。, 2009
),并被认为是具有以下能力的残留物π-堆叠或带正电荷(卢斯科姆等。, 2001
; 沃纳等。, 1996
). 然而,蛋白质–DNA界面水合作用在畸变稳定中的作用最近成为人们关注的焦点(Schwabe,1997
; 施耐德等。, 2014
; Jayaram和Jain,2004年
; Chong&Ham,2016年
). 人们发现高利用率水具有多种作用,例如润滑作用(Schwabe,1997
),适配器(Halford&Marko,2004
)或者DNA扭曲留下的空白区域被堵塞(罗宾逊等。, 1998
; 陈等。, 2005
). 因此,有趣的是,当比较PDM和FDM′的晶体结构和MD模拟时,CPD上的甲缩醛部分会降低关键稳定水域的占用率,尤其是WA1(图3
c(c)). 在光解酶活性方面,WA1的高占有率非常显著,因为光解酶必须作用于四种可能的底物,即TT和不太常见的CT、TC和CC嘧啶二聚体,因此必须稳定不同的未配对气泡(分别为AA、AG、GA和GG)。在这里,WA1可以作为Arg429和未配对气泡的5′区域之间的高度通用适配器。例如,在存在TC CPD损伤的情况下,Arg429需要与GA未配对气泡中的5′dG相互作用。在这些条件下,Arg429–WA1–5′G相互作用可以很容易地通过三个伙伴之间的位置轻微改变来适应,从而使dG N1、N2和O6完全稳定(补充图S4b条). 因此,这种高度保守的、基于Arg429–WA1的II类机制可能表明,与I类CPD光解酶相比,对不同CPD底物的耐受性更高,其中底物对TT二聚体的特异性很高,未配对气泡的稳定似乎是一种相当非特异性和被动的事情(Essen&Klar,2006
; Kim&Sancar,1991年
).
此外,在我们的模拟中,当我们通过用甲缩醛键取代磷酸二酯来扰动PDM结构时,我们观察到络合物无法将WA1保持在其指定位置(图3
c(c)). 此外,模拟似乎以两种不同的方式对缺少这些水作出反应。它要么保持PDM扭结角,代价是在未配对气泡中有一个大的、不稳定的、溶剂可及的体积(图3
c(c),表1
),如模拟3(补充视频S3)中所示,或其修改了复合体的整体几何结构,接近FDM扭折角(表1
,补充视频S4)。在后一种情况下,DNA几何形状的改变导致Arg429向dA8′方向后退,导致Trp431跟随(图3
,补充图S4)。然后,一个不稳定、摆动的dC9进入未配对气泡,与dA7′发生异常相互作用。生成的未配对气泡小于含有磷酸二酯CPD的模拟中的气泡(表1
). 有趣的是,Arg429、Trp431和Arg441阻塞了较小的体积,但dC9的加入完全弥补了这一点。因此,我们的模拟表明,在存在甲缩醛主链的情况下嗯CPDII–DNA复合体面临着一项看似不可能完成的任务:它可能以完全封闭的未配对空间或相反的空间为代价来维持DNA的生理扭曲(扭结角度),但并非两者兼而有之。
尽管很难证明dC9的抖动行为可能发生在体外,也许正是由于这些变化晶体结构,但不在PDM中晶体结构,在络合物I和络合物II之间观察到两种不同的构象(补充图S5)。此前,这两种构象被假设为对应于封闭(复合物II)和栓接(复合物I)状态(Kiontke等。, 2011
)第二个是真正的活动状态。关键的是,在栓接构象中,由于相对于其互补dG6′的横向位移,FDM中的dC9没有完全配对(补充图S5),而在PDM复合体和FDM结合复合体(复合体II)中Watson–Crick配对完全实现。因此,我们认为,Trp431旋转90°的栓接构象并不代表完全活性的蛋白质,而是解决气泡堵塞问题的构象与存在甲醛CPD骨架时的扭结角。因此,这种构造不能代表嗯CPDII结合其天然底物,但更确切地说,它是酶在面对不寻常底物时可塑性的一个例子。
迄今为止,特定侧链在稳定光解酶-DNA复合物中未配对气泡中的具体作用尚未得到适当解决(Essen&Klar,2006)
). 然而,对所有II类CPD光解酶序列的广泛分析表明,Arg429、Trp431和Arg441的BIR嗯CPDII具有与上述未配对气泡稳定模式一致的显著保护模式(补充图S1b条). 在这两种精氨酸中,只有Arg441是严格保守的,它形成了通向电泳内磷酸二酯骨架的定向盐桥。另一种是Arg429,可以被其他需要空间的残基取代,如谷氨酰胺、蛋氨酸或组氨酸。此外,大多数II类光解酶大多含有对应于Trp431的残基,其次是其他芳香族苯丙氨酸和组氨酸。有趣的是,只有PDM结构显示Trp431 N∊1吲哚部分的原子与Asp428形成氢键(图2
d日)虽然没有直接进入未配对气泡,但它是BIR的一部分。Asp428在所有II类光解中严格保守,并与Arg441形成盐桥(图2
d日以及补充图S1b条). 由此,我们可以推断Asp428、Trp431和Arg441的三联体形成螺栓状下部结构这有助于稳定未配对的泡沫。尽管Arg429可以被其他大量残基取代,至少在II类光解酶中是如此,但它们与未配对碱相互作用的功能在保持未配对气泡稳定性方面仍然至关重要。在I类光解酶中,出现了BIR的另一种保存模式(补充图S1b条),如安CPDI–DNA复合物。有趣的是,在这个含有层内甲缩醛键的结构中,一个保守的BIR残基Arg404是唯一一个通过填充到蛋白质表面而与DNA没有任何相互作用的残基。显然,该残留物可以实现与Arg441相同的功能嗯CPDII通过采用替代的侧链构象来稳定脂内磷酸二酯。
总之,通过结合结构和计算研究,我们在这里研究了II类CPD光解酶结合其天然底物的方式。此外,我们已经表明,虽然先前发表的结构在描述II类CPD光解酶活性位点时是准确的,但整个结合区域并非如此。最后,我们证明了这一点嗯CPDII是一种非特异性的双链DNA结合蛋白,使用的工具与这类蛋白质如何影响DNA超微结构的整体观点一致。通过使我们能够识别迄今为止未被注意到的BIR,这些结果将为进一步研究铺平道路精炼或者重新思考CPD光解酶结合光损伤DNA的结构生物学,即蛋白质-DNA复合物中的外围效应器和水的作用。
5.相关文献
本文的支持信息中引用了以下参考文献:Crooks等。(2004
)和埃森等。(2017
).
致谢
我们要感谢Stephan Kiontke博士对蛋白质纯化和结晶的有益讨论。我们还要感谢Andrew H.-J.Wang教授和Wen-Jin Wu博士在项目设置阶段的有益讨论。此外,我们还感谢大和教授琥珀色-兼容CPD和FADH−这些参数是公开的,川野幸树博士和山本正树教授在我们的同步加速器实验中给予了他们的帮助。此外,我们感谢Gusti Ngurah Putu Eka Putra先生和Po-Hsun Wang先生在样品制备和晶体低温保护方面的帮助。我们感谢台湾国家同步辐射研究中心(NSRRC)对台湾光子源05A微晶照相光束线的束时分配。经日本同步辐射研究所(JASRI;提案2016A2507、2016B2507、2017 A2576和2017B2576)批准,在SPring-8的BL32XU光束线上也进行了同步辐射实验。
资金筹措信息
已确认以下资助:台湾科技部(向台湾蛋白质项目授予编号:MOST105-0210-01-12-01、MOST106-0210-01-15-04和MOST107-0210-01-19-02);材料与器件网络联合研究中心合作研究计划(批准号:20163007和20173008);和空军科学研究办公室(批准号:FA9550-14-1-0409)。
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编号:2052-2525
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