Three-dimensional rotation electron diffraction: software RED for automated data collection and data processing

Wan, W.; Sun, J.; Su, J.; Hovmöller, S.; Zou, X.

doi:10.1107/S0021889813027714

研究论文

的日志
应用
结晶学

国际标准编号：1600-5767

第46卷| 第6部分| 2013年12月| 第1863-1873页

https://doi.org/10.107/S0021889813027714

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三维旋转电子衍射：软件红色用于自动化数据收集和数据处理

魏婉,^一 ^* 孙俊良,^一 ^* 杰苏,^一斯文·霍莫勒 ^一和邹晓东 ^一 ^*

^一瑞典斯德哥尔摩大学材料与环境化学系无机与结构化学与Berzelii中心EXSELENT多孔材料研究中心，瑞典斯德哥尔SE-106 91 Arrhenius实验室
^*通信电子邮件：wei.wan@mmk.su.se,junliang.sun@mmk.su.se,xzou@mmk.su.se

(2013年6月24日收到； 2013年10月9日接受； 2013年11月15日在线)

描述了旋转电子衍射（RED）数据自动采集和处理的计算机程序包的实现。该软件包包含两个计算机程序：红色数据收集和红色数据处理。这个红色数据采集程序控制透射电子显微镜和相机。电子束以精细步长（0.05–0.20°）倾斜与测角仪以粗步长（2.0–3.0°）围绕公共倾斜轴倾斜相结合，这使得电子束与晶体之间在较大倾斜范围内实现精细的相对倾斜。在光束倾斜和测角仪倾斜的每个组合处收集电子衍射（ED）帧。这个红色数据处理程序处理由红色数据收集程序或其他方法。它包括ED帧的偏移校正、单个ED帧中衍射点的峰值搜索以及将这些衍射点识别为三维反射。单位-细胞参数由三维反射的位置确定倒易空间。所有反射都被索引，最后是一个带有香港特别行政区输出指数和强度。数据处理程序还包括一个可视化工具，用于查看和分析从ED帧重建的三维互易晶格。描述了实现的细节。使用软件进行数据收集和数据处理红色使用煅烧的沸石样品silicalite-1进行了证明。具有72个独特原子的煅烧硅藻土-1的结构可以通过常规直接方法从RED数据中求解。

关键词：旋转电子衍射;电子衍射层析成像;三维电子衍射;结构分析;电子衍射;计算机程序。

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1.简介

利用X射线、中子或电子可以实现单晶衍射。虽然前两者一直都是定量的和三维的，但直到最近，电子衍射（ED）主要是在二维进行的。结构确定由于几个原因，电子晶体学并不是一种传统的方法。直到最近，对于三维结构测定，有必要手动收集少量电子衍射图案（通常在照相胶片上），每一个都沿分区轴([100], [110], [111], [120]等。). 这是一项非常耗时的工作，只能由训练有素的技术人员完成。虽然可以用这种方法确定非常复杂的结构，例如ν-AlFeCr（邹等。, 2003 )由于有129个独特的原子，收集、处理和分析这些数据需要数月甚至数年的时间。这使得这项技术不如X射线和中子衍射，几十年来，X射线和射线衍射都是在数小时或数天内自动完成的。随着CCD摄像机和计算机控制的电子显微镜的出现，情况发生了变化。现在，在现代透射电子显微镜上，大约一小时内就可以或多或少地自动收集数千个ED帧。

目前有两种方法用于收集三维电子衍射数据：自动衍射层析成像（ADT），由美因茨（Kolb）的Kolb小组开发等。, 2007 , 2008 , 2011 )和旋转电子衍射（RED）方法，由Hovmöller和Zou的小组在斯德哥尔摩开发（Hovmóller，2008 ; 张等。, 2010 ). ADT的原理已在一系列出版物中进行了描述（Kolb等。, 2007, 2008, 2011). ADT使用角度计倾斜的离散步长（通常为1°步长）覆盖大部分互易空间（科尔布等。, 2010 ; 戈列利克等。, 2011 , 2012 )它通常与连续进动相结合，以填充离散测角仪倾斜位置之间的空间。当与进动相结合时，ADT的几何形状对应于用于X射线衍射的无屏进动方法（Xuong等。, 1968 ; Xuong&Freer，1971年 ). ADT使用专用硬件进行进动和扫描透射电子显微术用于晶体跟踪（Kolb等。, 2011). RED将离散的测角仪倾斜步长（通常为2–3°）与非常精细的光束倾斜步长相结合，通常为0.05–0.20°。RED方法的几何形状类似于单晶X射线衍射的旋转方法（Arndt&Wonacott，1977）; Dauter，1999年 ). 旋转法的几何结构比进动法简单，这可能有助于数据处理和分析。RED方法的一个重要优点是，数据采集可以完全由软件控制，并在传统的透射电子显微镜上进行，无需任何额外硬件。该方法适用于选区电子衍射（SAED）和纳米衍射。ADT和RED方法都被越来越多的实验室用作常规技术。已经用RED方法求解了50多个结构，包括已知和未知结构（Martínez-Franco等。, 2013 ; 苏等。, 2013 ; 威尔哈马尔等。, 2013 ; 张等。, 2013 ). 今天，从小到几十纳米的晶体中收集基本上完整的三维电子衍射数据已经成为常规工作，这些晶体比在同步辐射光源上研究的要小几个数量级。由于无需校准晶体，数据采集变得非常简单快捷。

我们之前报告过RED方法用于数据收集（张等。, 2010)在那里，透射电子显微镜、晶体倾斜和CCD相机由Gatan的脚本控制数字缩微摄影(https://www.gatan.com/imaging/dig_micrograph.php（网址：https://www.gatan.com/imaging/dig_micrograph.php）). 在这里我们展示红色数据采集软件，用于控制透射电子显微镜和相机。我们还介绍了红色数据处理程序，处理从红色数据采集程序或其他方法。最后，我们以煅烧过的沸石样品硅藻土-1为例，说明了用RED收集和处理三维电子衍射数据集的过程以及从RED数据中获得硅藻土1的结构解。硅石-1是SiO最复杂的多晶型之一₂它具有MFI沸石骨架类型，并包含三维孔隙系统（Flanigen等。, 1978 )这对于分离和选择性催化来说很有趣。

2红色数据收集

RED方法的概念如图1所示.电子束以精细步长（0.05–0.20°）倾斜与测角仪以粗步长（2.0–3.0°）围绕公共倾斜轴倾斜相结合，这使得电子束和晶体之间可以在较大的倾斜范围内实现精细的相对倾斜。在光束倾斜和测角仪倾斜的每个组合处收集ED帧。每个ED帧是埃瓦尔德球体具有倒易空间。RED数据采集通过重复以下两个步骤完成：（1）使用±范围内的光束倾斜来采集ED帧α(α≃1.0–2.0°），步长为0.05–0.20°，（2）将晶体围绕倾斜轴旋转2α。

图1
旋转电子衍射（RED）方法概念的示意图。RED数据（单个ED帧）通过结合光束倾斜和测角仪倾斜来收集。通过三维重建，可以获得倒数空间中反射的强度和位置，并可以可视化。在进一步的数据处理后，确定单位单元并对反射进行索引。合成物香港特别行政区然后列表用于确定晶体的原子结构。这里使用的示例是沸石硅分子筛-1。

原则上，可以通过保持光束固定并使用显微镜上的角度计仅倾斜晶体来收集RED数据。然而，在实践中，由于测角仪的倾斜是通过机械齿轮实现的，因此倾斜的最小步长限制在0.1°左右。当测角仪以其最小倾斜步长使用时，它通常不能顺利进行倾斜。例如，它可能会在某些步骤中保持静止，或在其他一些步骤中跳大步。另一方面，显微镜中的光束倾斜由电流在光束倾斜偏转器中。这些可以以非常精细和精确的步骤进行更改，使光束倾斜控制可以降低到0.001°以下。光束倾斜的限制是最大可靠（线性）倾斜通常在3°以内。接近极限时，光束倾斜可能不精确，用于去扫描的偏转器（补偿因光束倾斜引起的图像和衍射偏移）可能无法保持图像或电子衍射静止。实际上，由于测角仪倾斜精度低，通常设置光束倾斜范围以确保相邻光束倾斜序列之间有重叠的帧。例如，如果一组21个ED帧以0.10°光束倾斜步长（从−1.00到+1.00°）在每个测角仪倾斜2.0°时被记录，则这组21个ED帧中的最后一个ED帧将与测角仪倾斜度后下一组的第一个ED帧相同。

这个红色数据采集程序用于通过控制光束扫描和测角仪倾斜度自动采集三维ED数据，以及在给定的光束倾斜度和测角器倾斜度组合下记录ED帧。以前的实现是使用Gatan实现的数字缩微摄影脚本，以及技术细节和过程在早期的一篇论文中进行了描述（张等。, 2010). 现在使用C++创建了一个新的实现。这是一个在外部运行的独立程序数字缩微摄影（有关技术细节，请参见支持信息¹). 新设计在数据收集方面遵循与前一设计类似的程序（张等。, 2010)，如图2所示，但包括更丰富和改进的功能。重新设计了用于确定光束倾斜和图像偏移偏转器相对强度的校准程序（见附录A类详细说明）。这个红色数据采集程序只在Windows上工作，因为它需要与仅在Windows上运行的相机和显微镜软件交互。

图2
显示使用SAED模式并由红色数据采集程序。

程序的图形用户界面如图3所示用户可以定义光束和测角仪舞台倾斜步骤、光束倾斜范围和曝光时间（图S1a）。测角仪的实际倾斜角通常与预期倾斜角略有不同。这个红色数据采集程序从透射电子显微镜读取测角仪的实际倾斜角度。光束倾斜和实际晶体倾斜角度与ED帧一起自动保存。在一次数据采集运行中，可以采集具有不同曝光时间的多系列RED数据，例如0.5、1.0和2.0 s。当强度溢出时，这很有帮助。曝光时间较短的ED帧可以提取出强反射，而曝光时间较长的ED帧则可以提取出弱反射。这个红色数据采集程序可以在SAED或纳米衍射模式下运行。对于SAED模式，该程序包括一个在图像和衍射模式之间自动切换透射电子显微镜的功能，使跟踪晶体变得容易，并在必要时补偿漂移。对于纳米衍射模式，使用离焦ED帧在衍射模式下进行晶体跟踪，其中使用直射光束中的晶体图像。晶体跟踪后，衍射焦点被设置为一个固定值，该值将在整个数据采集过程中使用。可以自动保存每个角度计倾斜角度下的晶体图像，并用于电子断层扫描，以重建晶体形态。连同重建的倒格子，可以索引不同的晶体面。晶体尺寸和形态可能有助于校正吸收和动力学效应。

图3
的图形用户界面红色数据采集程序。

三。红色数据处理

为了获得完整的数据集，红色通常在大的倾斜范围内运行，倾斜步长很细，例如±70°，步长为0.10°。这样的RED数据集包含1400多个ED帧。手动逐一处理这些ED帧以提取晶体信息是不现实的。相反，必须使用计算机程序。红色数据处理专门用于处理以上述方式收集的ED数据，例如来自红色数据采集程序。然而红色数据处理程序不限于处理来自红色数据采集程序。通过旋转晶体或光束收集的任何电子衍射数据都可以进行处理，无论是手动还是使用软件自动完成。

这个红色数据处理程序对数据采集程序采集的ED数据进行处理，并提取有用的信息，例如单位细胞参数和衍射强度。这些可以用作单晶衍射数据从头算结构解决方案和精细化。原始RED数据通常由数百个ED帧组成，这些帧是倒易点阵使用埃瓦尔德球体。数据处理涉及三维重建倒易点阵从这些二维ED帧，识别三维反射，确定单位电池，索引反射并提取强度。这个红色数据处理程序在Windows和Linux下运行，其在Windows下的图形用户界面如图4所示图5给出了完整数据处理序列的流程图下面将详细描述每个步骤。

图4
的图形用户界面红色数据处理程序。它显示了重建的三维倒易点阵对于从1472个单独的ED框架获得的煅烧硅酸盐-1。这个香港0,香港1和香港 $[\上一行]$ 图层分别用绿色、红色和蓝色标记。

图5
显示使用红色数据处理程序。

3.1. ED帧和数据输入

使用红色数据采集程序包含纯文本格式的信息文件和MRC格式的ED帧的原始数据文件（Crowther等。, 1996 ). 信息文件在红色数据收集。它包括电子波长、倾斜轴的方向、，互易空间采样（每倒数Ω的像素数，用像素*Ω表示）、各个帧的文件名以及相应的测角仪倾斜度、光束倾斜度和组合倾斜度。在这里，它充当数据处理程序的输入文件。对于通过除红色软件中，需要准备一个单独的信息文件。

3.2. 移位校正

通常可以观察到，在数据采集过程中，直射光束（以及整个衍射图样）会稍微移动其位置。使用直射光束周围用户定义的小区域的互相关，分别为每个ED帧找到直射光束通过数据集的偏移（图6). 偏移通常在几个像素内，并在数据处理中根据每帧到亚像素的精度进行校正红色。最终数据质量不受此班次的影响。为了优化直射光束整体对准的精度，在校正了帧的相应偏移后，在帧和所有先前帧的总和之间进行互相关。该方案采用了为高分辨率开发的图像处理方法透射电子显微镜（TEM）显微照片（Wan等。, 2012 ). 由于强对比度的特征主导了互相关，因此在每个ED帧中，直射光束始终是用户定义区域中最强的，这一点很重要。否则，互相关可能会给出错误的结果。

图6
的移位校正窗口红色数据处理程序。选择覆盖直射光束的256×256像素区域进行互相关计算。

3.3. 峰值搜索

寻峰是识别ED帧中衍射点的过程。这些将在以后用于互易空间重建和单位细胞测定。衍射斑点的强度将被提取用于结构溶液。重要的是，在高背景和低背景中拾取所有反射，包括强反射和弱反射，并抑制噪声峰值。这是计算机视觉领域中常见的斑点检测问题（Lowe，2004 ). ED帧包含强度和背景在大范围内变化的斑点。我们测试了各种斑点识别算法，没有发现任何一种算法能够满足ED数据的要求。因此，我们开发了以下算法来识别ED帧中的衍射点。

中采用的寻峰算法红色数据处理如下。在第一步中，将原始ED帧与具有相对大的标准偏差（通常超过十个像素）的高斯函数进行卷积。生成的帧具有强烈模糊的对比度，并用作背景帧。在第二步中，原始ED帧与另一个具有相对较小标准偏差（通常为0.5–2.0像素）的高斯函数进行卷积。原始ED帧的对比度或多或少会得到保留，但噪音会降低。合成框架用作衍射框架。在第三步中，逐像素比较步骤1中的背景帧和步骤2中的衍射帧。如果衍射框中的强度比背景框中相应位置的强度高出用户定义的阈值，则认为这些像素属于衍射点。最后，在每个ED帧中由彼此靠近的像素组成的组被视为单个衍射点。每组中强度最高的像素的位置被视为衍射点的最终位置（图7). 每个衍射点的位置存储为x个,年和帧编号，其中x个和年是二维ED框架上衍射点的坐标。

图7
中的峰值搜索设置红色数据处理程序(一)和峰值搜索结果示例(c（c）)从硅藻土-1数据集中的ED帧(b条). 所有可见峰(b条)被检测到红色并用十字标记(c（c）). 峰值和背景半径(即高斯函数的标准偏差）以及峰值-背景阈值可以由用户定义。

3.4. 峰值强度提取

在确定衍射点的位置后，评估每个衍射点的强度。如果控制曝光时间和光束强度，使CCD框架中不会溢出（可能直接光束除外），则所有衍射点的形状基本相同，但强度不同。然后可以通过获取计数最高的像素或对每个反射的所有像素进行积分来提取衍射点的强度。之前已经研究过根据ED模式进行准确的强度评估（邹等。, 1993一 ,b条 ).

在红色数据处理程序，包括两种提取ED帧中衍射点强度的方法。一种是从高斯平滑衍射帧中提取上述衍射点最终位置的强度。提取的强度是衍射点最终位置及其周围像素的加权平均强度（对于使用标准偏差为一个像素的高斯函数进行平滑，这接近于中心像素的64%加上最近四个像素的9%）。强度提取的另一种选择是通过简单的二维积分。使用比衍射点稍大的圆形窗口（由用户定义）来掩盖衍射点。圆形窗口被放大了几个像素，两个圆之间区域的平均强度被用作衍射点的背景。内圈中每个像素的强度都会降低平均背景水平。然后将内圈中所有像素的背景重影强度之和作为衍射光斑的最终强度。

3.5.相互作用空间重建和可视化

为了重建三维互易空间从二维ED帧中，需要校正埃瓦尔德球体。峰搜索给出了每个ED帧中许多衍射点的二维位置，如下所示 $[\bf或]$ 如图8所示。然后将二维衍射点反向投影到埃瓦尔德球体恢复反射与埃瓦尔德球体， $[{\bf或}^\prime]$ 。 $[{\bf或}^\prime]$ 然后根据相应ED框架的倾斜角度围绕倾斜轴旋转，以获得衍射点的最终三维位置倒易空间。对框架中发现的所有衍射点执行此操作，结果是重建三维互易空间可以通过红色程序。用户可以使用可视化工具检查三维衍射点，并对倒易晶格的不同层进行二维切割。

图8
衍射点的反投影R（右）以衍射模式埃瓦尔德球体在R（右）′.O（运行）是衍射图案的中心O（运行）'埃瓦尔德球体的中心。

可以查看三维倒易点阵沿任何方向，包括主单元-细胞轴。反射组可以用不同的颜色标记并选择显示，如图4所示.二维切片可以垂直于任意方向切割。二维切片的目视检查香港0,小时0我, 0kl等。对于空间群的确定非常有用。用于查找可能的反射统计信息象称为系统消光也由给出红色之后单位电池已发现，反射已被索引。可以切割以下部分小时1我,小时2我,香港3等等，即不通过反射000的部分。这尤其有趣，因为使用传统的电子衍射技术（如SAED和进动）无法获得此类截面。

3.6.精炼倾斜轴的方向

晶体绕其旋转的轴的方向必须预先确定，因为在数据采集期间，需要将光束设置为垂直于该轴进行扫描。重建三维时也需要此信息互易空间来自RED数据中的ED帧。倾斜轴可以通过倾斜晶体并沿着劳厄圆的中心来确定（张等。, 2010). 在随后的数据处理过程中，可以提高测定的准确性。在ADT中，倾斜轴的方向是通过检查互易空间假设不同的方向（Kolb等。, 2009 ). RED中采用了类似的思想来找到初始倾斜轴。需要从衍射良好的晶体中收集数据集（生成高分辨率数据），只需使用角度计倾斜。相互作用空间首先使用随机试验倾斜轴定向来重建并可视化。如果试验倾斜轴偏离真实倾斜轴几度以上，则重建的反射晶格将出现弯曲，如图9所示(一). 然后小步改变方向倒易点阵可视化和检查。当反射晶格笔直时，可以找到倾斜轴方向（图9b条). 根据我们的经验，使用此方法可以以约1.0°的精度找到方向。对于相同配置的特定显微镜，倾斜轴方向不会随时间而改变。一旦找到，它可以用于未来的重建。当相机长度或衍射焦点改变时，由于ED图案的旋转，ED框架中的倾斜轴可能会旋转几度。原则上，应在每个相机长度和焦距配置下执行上述程序。实际上，对于SAED，不同数据集之间的衍射焦点变化通常很小，ED图案没有明显的旋转。因此，在不同的相机长度下校准旋转就足够了。对于纳米光束衍射，衍射焦点可能发生更大的变化。在这种情况下，可以在几个衍射焦点（最好在不同的相机长度）处校准旋转，并针对数据采集中使用的任何焦点进行插值。

图9
硅分子筛-1的三维倒易晶格重建(一)错误指定的倾斜轴方向（42.5°）和(b条)正确的倾斜轴方向（48.5°）。请注意，当倾斜轴方向错误时，反射行会弯曲，如所示(一). 这可用于优化倾斜轴方向。

倾斜轴方向的误差不仅会导致重建反射位置的误差，即弯曲反射晶格，但也用于单位-细胞测定，因为使用了反射的位置（见下文）。实验表明，使用RED数据，可以获得精度良好的单位-单位参数（单位-单位长度和角度通常优于1%）（Su等。, 2013). 即使倾斜轴方向偏离了±2°，单元间尺寸也几乎保持不变。弯曲的反射晶格也可能会在索引中造成问题，因为反射不完全遵循倒数基向量。在红色在数据处理中，索引时考虑了晶格的弯曲，尽管有一些弯曲，仍然可以找到正确的反射指数，这将在后面讨论。

3.7. 峰值合并和强度积分

由于倾斜步长通常较小，大多数反射将与埃瓦尔德球体在几个连续的ED帧上。当这些衍射点被转换成三维后，它们将彼此靠近，形成一个属于同一反射的群。在峰值合并步骤中，程序将识别这组衍射点并将其合并为一个反射。该程序使用二维ED框架和三维ED框架中衍射点之间的距离互易空间以确定衍射斑是否属于同一反射，并使用衍射斑组之间的距离来分离反射。

在一组衍射斑合并成一个反射后，将确定其强度和三维位置。反射的最终三维位置是属于反射的衍射点所有位置的强度加权平均位置。有两个选项可以确定最终强度。如果采样足够精细（通常为～0.1°倾斜步长），所有反射都会出现在几个连续的ED帧上。用户可以选择从具有最高值（默认值）的衍射框中选取强度，或在衍射框上进行三维积分。三维积分是通过在相邻点之间的倒数差向量上积分衍射点的强度来完成的：

$[I（{\bf K}）=\textstyle\sum\limits_I{I_I}$

哪里我(K（K）)是反射的综合强度K（K）。我_我(K（K）)是镜框上衍射点的强度我和ΔK（K）_我=K（K）_我−K（K）_我−1是衍射点与框架的三维位置之差我和我− 1. $[{我}_{i} （｛\bf K｝）]$ 可以是衍射点的最大值，也可以是衍射框中衍射点的二维积分强度。

如果晶体很薄，或包含平面无序，例如堆叠断层和/或孪生，反射将被拉长倒易空间。在极端情况下，反射甚至可以通过条纹连接。在这种情况下，程序将无法识别（分离）衍射点的反射。在以下情况下，可以手动选择并排除程序中的条纹互易空间是可视化的，只留下靠近反射中心的衍射点。在无序的情况下，合并反射可能不具有完整结构解的准确强度，但通常至少足以在以下步骤中确定单元-细胞。条纹和漫反射强度对于研究晶体中的无序或短程有序很有用。我们目前正在研究处理无序产生的条纹和漫散射的方法。

3.8. 单位-细胞测定

在此步骤中，程序将查找三个可用于索引所有反射的倒数基向量。在红色，一种类似于基于密度的聚类算法的方法DBSCAN公司被采纳（施利特等。, 2012 ). 通过计算合并反射的位置差向量并识别三个最短的非共面差向量，找到倒数基向量。由于反射位置中的个别错误，位置差向量在可视化时将显示为孤立的云，而不是一个聚合点，云中的每个点对应一个差向量。在每个云内平均三个最短的非共面差分向量，以获得最终的倒数基向量。由这些基向量定义的单元是还原单元，可能无法反映晶体的最高对称性。这个红色程序提供了转换单位电池，使用用户定义的方向矩阵。在各种晶体计算机程序中，可以很容易地使用从简化单元单元中识别更高对称性的功能，例如计算晶体学工具箱（Grosse Kunstleve）等。, 2002 ;https://cctbx.sourceforge.net网址/).

3.9. 编制索引

反射的索引原则上可以通过在倒数基向量上分解反射的位置向量来完成。合成成分给出了指数小时,k个和我反射。在实验数据中，由于重建位置的误差，反射波通常不严格遵循由基向量定义的晶格。例如，晶格可能看起来弯曲，通常在高分辨率区域更弯曲。因此，反射的索引将是十进制数而不是整数。这个红色该程序使用用户定义的阈值，只保留索引在该阈值内的反射，拒绝偏离晶格太多的反射。任何指标的默认阈值为±0.1小时,k个和我。可以为设置不同的阈值小时,k个和我如果单位间距相差很大，则分别为。反思香港特别行政区偏离整数值超过阈值的指数可能是反射之间的噪声峰值。这样的反射将从反射的最终列表中排除。其余反射的最终指数四舍五入为整数（见表1). 对于非公度调制结构甚至准晶体，可以保持反射的非整数指数。

表1
反射表摘自由红色数据处理软件

该表包含带小数的索引(高、低。)以及取整后(香港特别行政区)，强度(我)，的天间距、强度达到最大值的ED帧编号（帧编号）以及反射的坐标(x个,年)在ED框架中。完整列表包含所有反射天间距≤0.83º。注意Friedel反射对(香港特别行政区和−小时−k个−我)相隔几帧，强度非常相似。

小时。	k。	l、。	小时	k个	我	我	天(Å)	框架编号。	x个	年
−0.97	0.95	−0.01	−1	1	0	2733.5	11.42	931	601	448
0.99	−0.99	0.03	1	−1	0	2727.3	10.97	932	679	475
−0.04	1.01	−0.97	0	1	−1	2636	11.32	985	603	479
0.02	−1.00	1.01	0	−1	1	2657.4	10.86	985	679	442
−0.03	1.02	1.01	0	1	1	1368.8	11.26	400	604	440
−0.00	−0.97	−1.01	0	−1	−1	1194	11.07	401	675	485
1.03	1	0.03	1	1	0	311.1	11.14	30	598	468
−1.03	−0.97	0.02	−1	−1	0	335.7	10.96	32	682	460
1.96	0.01	−0.00	2	0	0	1938.3	10.27	1403	668	496
−1.98	−0.01	0.01	−2	0	0	1852	10.10	1404	621	416
0.02	0.03	−1.96	0	0	−2	548.9	10.25	148	644	508
−0.02	0	2	0	0	2	519.3	9.87	146	635	416
0.98	−0.99	−1.01	1	−1	−1	1216.3	9.84	711	676	493
−0.99	0.99	1	−1	1	1	1161.6	9.82	710	606	429
−1.00	−0.97	−0.98	−1	−1	−1	475.9	9.83	75	682	482
1.01	0.99	1	1	1	1	408.2	9.68	73	594	444
−1.00	1	−1.01	−1	1	−1	1171.5	9.82	1225	598	457
1	−1.00	1.01	1	−1	1	1389.1	9.61	1228	695	457
1.99	−0.01	−1.02	2	0	−1	227.2	9.07	1142	657	508
−1.97	0	1.01	−2	0	1	237.2	9.03	1141	636	407

为了考虑反射晶格的弯曲，由于倾斜轴方向的确定误差或镜头和相机的畸变，采用了自适应分度算法。索引从低分辨率反射开始，低分辨率反射与基向量定义的晶格的位置通常只有很小的偏差。当索引指向高分辨率反射时，它使用与被索引反射相邻的索引反射作为新位置原点，而不是倒格子。由于局部弯曲通常较小，该分度方案能够承受相对较大的弯曲，包括在高分辨率下看到的螺旋变形。根据我们的经验红色软件一直都是正确的，即使是对于大的单元-单元尺寸和高指数。

3.10. 数据和HKL列表输出

索引后，反射的索引和强度以标准HKLF4格式输出到HKL文件SHELX公司（谢尔德里克，2008年 ). 该文件可用作标准X射线结构解决方案的输入精炼程序。程序中还提供了有关反射的丰富信息，包括小数索引和四舍五入后的索引、强度、分辨率、强度达到最大值的ED帧数以及ED帧中反射的坐标，如表1所示。

4.应用红色对硅藻土-1的讨论

这里我们展示了一个应用红色硅藻土-1的数据采集和处理。煅烧硅酸盐-1在环境条件下为单斜晶系空间组 P（P）2₁/n个和单位电池一=19.879，b条= 20.107,c（c）=13.369º和β=90.67°，具有24个对称感应Si和48个对称感应O位置（Vankoningsveld等。, 1990 ). Silicalite-1通常以孪晶形式生长，是单晶X射线衍射解决的最复杂的沸石之一。将煅烧后的硅藻土-1晶体分散在无水乙醇中，并通过超声波处理2分钟。在透射电子显微镜观察之前，将悬浮液滴转移到碳涂层铜格栅上并在空气中干燥。

三维RED数据的采集由红色JEOL JEM2100 LaB上的数据采集程序₆200 kV透射电子显微镜。ED帧由12位Gatan ES500W Erlangshen相机记录，相机侧装在35 mm的端口上。电子束的倾斜轴设置在与测角仪倾斜轴相同的方向，并由红色软件。尺寸为0.8×0.4×0.2µm的晶体（图10)使用选定的区域光圈选择。晶体大小是根据在不同角度的测角仪上拍摄的图像估计的。将晶体高度调整到常心高度，以使晶体倾斜期间的晶体偏移最小化。光束倾斜步长为0.10°，测角仪步长为2.0°。我们建议光束倾斜范围略大于舞台倾斜，以覆盖可能的缺失角度。光束倾斜范围为±1.10°，允许在每个晶体倾斜处有几个重叠的ED帧。每个ED帧的曝光时间为0.5秒。晶体可以具有任意方向，不需要对晶体方向进行任何对齐。每次晶体倾斜后监测晶体的位置，必要时手动调整。使用单倾斜层析成像支架，在56分钟内收集了整个RED数据集（1472 ED帧），涵盖−65.3至+64.2°的倾斜范围。使用红色数据处理程序，包括峰值搜索、强度提取、单位细胞测定和反射索引。重建的三维倒易点阵硅藻土-1和主带轴切片如图11所示。

图10
煅烧硅藻土-1晶体的低放大TEM图像，用于演示红色数据收集和处理软件。

图11
(一)三维倒易点阵根据RED数据重建的煅烧硅藻土-1和(b条)–(天)从重建的三维图像中切割出的二维切片倒易点阵显示(b条)0个肯尼亚, (c（c）)小时0我和(c（c）)香港0个平面。

硅藻土-1的结构是通过这个三维RED数据集的“像素”强度的最大值来求解的直接方法通过2011年新加坡元（布拉等。, 2012 ). 所有的硅和氧原子都位于合理的位置。最终结构精炼已使用SHELXL97型程序（Sheldrick，2008)通过最小化F类²使用全矩阵技术。所有的硅和氧原子都是各向同性的。详细研究结构测定使用RED方法对煅烧硅藻土-1进行测试，包括倾斜范围、倾斜步长和分辨率对单位-细胞参数测定的影响，以及结构溶液和精细化，在另一篇文章中介绍（苏等。, 2013). 结晶数据和结构细节精炼表2总结了使用RED数据的情况。

表2
煅烧硅藻土-1的结晶数据和结构细节精炼使用RED数据

化学配方	硅₂₄O（运行）₄₈
配方重量	1442.16
温度（K）	298
波长（Ω）	0.0251
晶体系统	单诊所
“空间”组	P（P）2₁/n个
单位电池（Ω，°）	一= 20.02,b条= 20.25,c（c）= 13.35,α= 90.13,β= 90.74,γ=90.03
体积（Å^三)	5411
Z轴	4
密度（计算）（Mg m⁻³)	1.769
F类(000)	940
晶体尺寸（µm）†	0.8 × 0.4 × 0.2
水晶色	无色的
倾斜范围（°）	-65.3至64.2
倾斜步长（°）	0.10
框架数量	1472
分辨率（Ω）	1.05
完整性	0.968
收集的反思	13221
独特的反射	4870
独特的反射[我> 2σ(我)]‡	1833
优化的参数	290
R（右）_整数(我)	0.338
最终R（右）(我)指数[我> 2σ(我)]‡	R（右）₁= 0.318,水风险₂= 0.571
R（右）(我)索引（所有数据）	R（右）₁= 0.408,水风险₂= 0.633

†根据在不同测角仪倾斜角度下拍摄的TEM图像估计晶体尺寸。
‡σ(我)计算为强度的平方根我。

典型的数据采集包括以0.10°光束倾斜步长采集约1400个ED帧（在−70至+70°范围内）。每帧曝光时间为0.5秒，晶体位移每2°手动调整一次，整个数据采集大约需要60分钟。数据处理需要0.5−3小时香港特别行政区然后将指数和强度用作标准程序的输入，这些程序是为从单晶X射线数据中求解晶体结构而开发的，例如SHELX公司,统计资料记录或超级翻转（Palatinus&Chapuis，2007年 ). 在大多数情况下，正确的晶体结构在分钟内找到。因此，RED将收集数据和通过单晶电子衍射解算晶体的整个过程所花费的时间从数周或数月减少到数小时。

ADT和RED提供的数据质量足以常规解决多达100个独特原子的复杂晶体结构。到目前为止，通过三维电子衍射解决的大多数结构都是无机的（蒋等。, 2011 ; 马丁内斯·佛朗哥等。, 2013)，因为辐射损伤对有机分子来说更为严重。然而，一些有机或无机-有机杂化结构（Kolb等。, 2010; 戈列利克等。, 2012; 贝卢西等。, 2012 ; 张等。, 2013)和金属-有机框架（Feyand等。, 2012 ; 威尔哈马尔等。, 2013)也得到了解决。

除了辐射损伤问题外，与X射线和中子相比，电子晶体学的原始衍射数据质量仍然较低。虽然电子衍射通常超过1.0º分辨率（有时达到0.5º），但电子衍射与X射线衍射相比，对称相关反射的强度差异更大，如表2所示这是一个重要的问题，目前正在进行工作，以找出这个问题的原因，以便制定程序来纠正扭曲衍射强度的各种因素。我们相信，旋转方法的简单几何学将有助于此类工作。

5.结论

我们提供红色数据采集程序，用于控制透射电子显微镜和相机进行自动三维电子衍射数据采集。精细光束倾斜与粗略测角仪倾斜相结合，以允许埃瓦尔德球体进行三维采样倒易空间。在SAED模式或纳米衍射模式下，一小时内可以采集1000多个ED帧。我们还介绍了红色数据处理程序，处理从红色数据采集程序或其他方法，例如ADT。三维倒易点阵可以通过红色软件。可以确定单位-细胞参数并对衍射点进行索引。反射列表及其天提供了值和强度，可以用于从头算 结构测定未知晶体。该软件是为广泛的用户群体设计的，旨在简单、用户友好和易于学习。

电子晶体学终于达到了成熟的水平，达到了与X射线和中子晶体学类似的水平。对于单晶X射线衍射太小而粉末衍射太复杂的晶体，可以使用RED方法进行常规求解。RED方法特别适用于研究粉末衍射困难的多个复杂相（包括未知新相）的样品。单个粉末颗粒的尺寸小于几十纳米，被电子视为单晶，尽管对于单晶X射线衍射来说太小了。我们相信RED和ADT方法将标志着结晶学的新时代。

附录A

光束倾斜和图像偏移偏转器的校准

这个红色数据采集程序使用光束倾斜偏转器来倾斜电子束，并使用两个像移（IS）偏转器IS1和IS2来恢复图像和衍射图案。为了确保在应用光束倾斜时，图像和衍射图案几乎是静止的，对IS1和IS2的电流应用正确的变化非常重要。因此，不同偏转器在图像偏移和衍射图案偏移方面的影响，即必须确定电流变化量与成像量和衍射位移量之间的关系。这是在两个校准过程中完成的，一个在衍射模式下，另一个在图像模式下。在衍射模式下，改变光束倾斜偏转器和两个像移偏转器的电流，每次改变一个，并记录衍射图案的相应偏移。在图像模式下，两个图像偏移偏转器的电流每次改变一个，并记录相应的图像偏移。光束倾斜偏转器不在图像模式下进行测试，因为在透射电子显微镜正确对准后，光束倾斜不会引起图像偏移。电流变化和偏移（衍射图案和图像）之间的比率被保存，并将用于去扫描（图S1b）。每个导流板都有x个和年组件；因此，电流的变化可以写成向量：

$[\Delta{\bf I}=\left（\matrix{\Delta I}_{x}\cr{\Delta-I}_{y}}\right）.\eqno（2）]$

图像或衍射位移也可以写为包含x个和年方向：

$[{\bf R}=\左（{\矩阵{{R_x}}\cr{{Ry}}\cr}}\右）.\eqno（3）]$

光束倾斜、IS1和IS2偏转器中电流的变化以及相应的衍射位移可以用2×2矩阵表示M（M）:

$[\eqalign{{\bf R}}_{\rm BT}^{\rm-差异}&={米}_{\rm BT}^{\rm-Diff}{\Delta{\bf I}}{\rm-BT}，\cr{{\bf-R}}{{\rm-IS1}^{\rm-Deff}&={米}_{\rm IS1}^{\rm-Diff}{\Delta{\bf-I}}_{\rm-IS1}，\cr{{\bf R}}__{\rm-IS2}^{\rm-Deff}&={米}_｛\rm IS2｝^｛\rm Diff｝｛\Delta｛\bf I｝｝_｛\rm IS2｝，｝\eqno（4）]$

其中下标BT表示光束倾斜。偏转器中电流的变化和相应的图像偏移可以以类似的方式进行关联：

$[\eqalign{{\bf R}}_{\rm IS1}^{\rm-Img}&={米}_{\rm IS1}^{\rm-Img}{\Delta{\bf I}}_{\rm-SS1}，\cr{{\bf-R}}__{\rm-IS2}^{\rm-Imag}&={米}_{\rm IS2}^{\rm-Img}{\Delta{\bf I}}_{\rm-SS2}.}\等式（5）]$

对于图像去扫描 $[{\增量{\bf I}}_{\rm IS1}]$ 和 $[{\增量{\bf I}}_{\rm IS2}]$ 将被设置为整体图像偏移为零：

$[{{\bf R}}_{\rm整体}^{\rm-Img}={{\ff R}{_{\rma IS1}^{\rm-Imag}+{{\bf R}}_{\rm-IS2}^{\ rm-Img}={米}_{\rm IS1}^{\rm-Img}{\Delta{\bf I}}_{\rm-SS1}+{米}_{\rm IS2}^{\rm-Img}{\Delta{\bf I}}_{\rm-SS2}=0。\等式（6）]$

比率也可以表示为矩阵：

$[{\增量{\bf I}}_{\rm IS2}={米}_{\rm IS}{\Delta{\bf I}}_{\rm-IS1}，\eqno（7）]$

哪里

$[{M_{\rm IS}}=-{\左（{M__{\rma IS2}^{\rm-Img}}\right）^{-1}}M_{\ rm IS1}^{\ rm-Imag}.\eqno（8）]$

校准后，四个矩阵，M（M）_是,M（M）_英国电信^差异,M（M）_{国际标准协会1}^差异和M（M）_{国际标准2}^差异确定，然后用于光束倾斜的去扫描。

对于衍射扫描 $[{\增量{\bf I}}_{\rm IS1}]$ 和 $[{\增量{\bf I}}_{\rm IS2}]$ 需要为给定的 $[｛\Delta｛\bf I｝｝_｛\rm BT｝]$ 为了将衍射图案的总偏移保持为零：

$[\eqaligno{{\bf R}}{\rm整体}^{\rm-Diff}&={{\ff R}{\rm-BT}^{\rm Diff}+{\bf-R}}{\rma-IS1}^{\ rm-Diff}+{\ bf R{}}{米}_{\rm BT}^{\rm-Diff}{\Delta{\bf I}}_{\rm-BT}+{米}_{\rm IS1}^{\rm-Diff}{\Delta{\bf I}}_{\rm-IS1}+{米}_{\rm IS2}^{\rm-Diff}{\Delta{\bf I}}_{\rm-IS2}=0.&(9)}]$

线性方程组的求解（7）和（9）给予 $[{\增量{\bf I}}_{\rm IS1}]$ 和 $[{\增量{\bf I}}_{\rm IS2}]$ 。

根据我们的经验，透射电子显微镜足够稳定，这些值只需测定一次并存储在计算机中。然后可以为每个RED数据收集加载它们，并在很长一段时间（几个月）内使用。

支持信息

RED数据采集程序的软件实现和图形用户界面的技术细节。内政部：https://doi.org/10.107/S0021889813027714/nb5079sup1.pdf

脚注

¹本文的支持信息可从IUCr电子档案中获得（参考：NB5079型). 期刊背面描述了访问此材料的服务。

致谢

该项目由瑞典研究委员会（VR）、瑞典创新系统政府机构（VINNOVA）、戈兰·古斯塔夫松基金会以及克努特和爱丽丝·沃伦伯格基金会通过项目赠款3DEM-NATUR提供支持。EM设施由Knut和Alice Wallenberg基金会支持。作者感谢刘雷锋提供了滑石-1样品。

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