2.1. HPLC-轴

所有化学品均为Merck的试剂级化学品（VWR International，Milan，Italy；https://www.merckmillipore.com/)除非另有说明，否则所有溶液的制备均使用双蒸馏水或MilliQ水。对于HPLC-SAXS，使用的缓冲液为TBS[Tris缓冲盐水；三（羟甲基）氨基甲烷50 mM（M），氯化钠104米M（M），抑肽酶每毫升10个激肽释放酶抑制剂单位（KIU），pH 7.4]。抑肽酶和牛血清白蛋白（BSA；>10岁的科恩组分V样本）来自西格玛-奥尔德里奇（美国密苏里州圣路易斯；https://www.sigmaaldrich.com/sigma-aldrich/home.html). 浓缩在全长材料中的人血浆FG部分（hpHMW-FG）被纯化，并如前所述进行表征（Cardinali等。, 2010). 在两个7.8×300mm填充羟基化聚甲基丙烯酸酯颗粒（TSK G4000PW）的柱上进行SE-HPLC_特大号、10µm尺寸、500μm孔径和G3000PW_特大号，6µm大小，200μm孔径，Tosoh Bioscience，日本东京；https://www.tosohbioscience.com/)串联连接，由填充G3000PW树脂（Tosoh）的6×40 mm保护柱进行保护。同步加速器SOLEIL的SWING光束线安捷伦色谱系统（David&Pérez，2009）)在0.35 ml min下操作⁻¹流速。将色谱柱和SAXS流动池保持在293.2±0.1 K。将BSA溶解在9 mg ml⁻¹在TBS中，以12000 r min的速度进行中心过滤⁻¹然后将超过0.22µm的醋酸纤维素过滤器（Costar Spin-X，Sigma–Aldrich）和60µl（两次重复）注入SE柱中。hpHMW-FG浓度为17.3 mg ml⁻¹在TBS中，离心过滤后，将20或50µl注入SE柱中。SAXS数据(λ=1.03º），在～4 m样品-探测器距离处收集q个范围为0.0023–0.2750Å⁻¹，归一化为传输光束的强度，使用本地专用程序在SWING光束线上减去背景狐步舞，并使用水在美国-索马里SAS模块。消光系数(E类²⁸⁰)和部分特定卷()计算方法为宣传片（斯波托诺等。, 1997). 对于BSA，E类²⁸⁰=0.65毫升毫克⁻¹ 厘米⁻¹和=0.733毫升克⁻¹对于注射的hpHMW-FG样品，计算值时考虑了固有的多分散性（Raynal等。, 2013)、和是E类²⁸⁰=1.55毫升毫克⁻¹ 厘米⁻¹和=0.715毫升克⁻¹.聚丙烯酰胺凝胶样品分析电泳如前所述，在不含或含尿素的十二烷基硫酸钠（SDS）存在下进行（PAGE）和western印迹，然后进行密度测定（Cardinali等。, 2010).

2.2. 软件实施

这个美国-索马里已经描述了技术规范（Brookes、Demeler、Rosano和Rocco，2010, 2012). 当前软件是用C类++利用Qt（数量）(https://qt-project.org/). 该代码是多平台的，具有可用于Linux、Mac OSX和Windows的二进制文件。源代码可用通过一个wiki集成的subversion存储库，可以从主美国-索马里网页。目前的用户群包括全球约700名注册的个人研究人员和56个注册的实验室。

3.1. 主面板

的新GUI美国-索马里SAS模块如图1所示(一). 它分为两半，上半部分用于往复空间操作，下半部分用于实际空间操作。在往复空间操作中，我(q个)与q相比SAXS和SANS曲线可以根据原子级结构计算，也可以通过显式水合作用计算（应外部提供；参见例如。普瓦特万等。, 2011)使用德拜方程（Glatter&Kratky，1982)以及用球谐函数计算的变量（Stuhrmann，1970; 斯图尔曼等。, 1977; 斯维尔根和斯图尔曼，1991年)或隐性水合作用，如冰霜（斯维尔贡等。, 1995),克莱森（斯维尔贡等。, 1998)以及基于FoXS系列概念（Schneidman-Duhovny等。, 2010). 吉尼亚分析可以在手动或半自动模式下进行。还提供了一个具有执行缓冲区减法、归一化和曲线连接功能的主要数据缩减实用程序（将在未来的出版物中介绍）。此外，我们还开发了一种用于处理HPLC-SAXS数据的新模块，允许对毛细污垢引起的虚假背景强度进行一阶校正，并将高斯分解应用于非基线分辨率的SAXS峰（见下文和补充材料¹). 在实际空间部分，P（P）(第页)与r相比对于SAXS和SANS方法，这些曲线都可以直接从原子级结构计算出来，并与通过倒数空间数据的傅里叶逆变换得到的数据进行比较。为了帮助理解大分子中残基的分布如何影响P（P）(第页)与r相比分布式，开发了一种新的工具，允许可视化（使用RasMol公司; Sayle&Milner-White，1995年)其残留物根据其对特定距离范围的贡献进行颜色编码。在图1中(b条)，BSA结构被可视化，用颜色编码以显示哪些残基对P（P）(第页)与r相比曲线在45-55º范围内（黄色到蓝色降序排列；灰色，无贡献）。使用非负最小二乘拟合程序，可以对所有合成曲线进行排序或组合，以使用实验得出的数据得出最佳拟合曲线。倒数和实际空间曲线也可以从低分辨率的珠子模型开始计算。最后，通过使用离散的分子动力学（Ding&Dokholyan，2006年; 多霍良等。, 1998)在几个超级计算机集群上远程运行的实用程序。补充材料包含对美国-索马里SAS模块的许多功能。

图1 (一)更新的GUI美国-索马里SAS模块主面板。在图形窗口中我(q个)与q相比和P（P）(第页)与r相比根据BSA计算的曲线晶体结构 4f5秒（布雅茨，2012年)使用冰霜和美国-索马里分别显示了内部SAXS方法。(b条)的快照RasMol公司-产生的BSA结构，残留物有助于选择P（P）(第页)与r相比范围为45–55º，按重要性递减的顺序从黄色到蓝色进行颜色编码。

3.2. 这个美国-索马里HPLC-SAXS和其他模块

生物大分子SAXS的一个相对较新的进展是洗脱液从高效液相色谱柱（主要是SE-HPLC）到流通式SAXS毛细管，在色谱分离（马修等。, 2004; David&Pérez，2009年). 这通常允许分离采集SAXS数据的纯、基本上是单分散的样本。然而，物种之间的基线分辨率并不总是能够实现的，并且/或者可能会出现其他问题，例如毛细管污染，这使得分析和解释数据都很困难。为了解决这些问题，我们开发了一个“高效液相色谱”模块，其中包含补充材料中详细描述的一些功能。所有美国-索马里SAS模块的可用选项，可通过按下主面板底部的“打开选项面板”按钮进行访问（图1一和S1），也在补充材料中进行了描述（图S4–S11）。

4.1. 测试美国-索马里带有BSA数据的HPLC-SAXS模块

在hpHMW-FG样品之前运行一个含有大量二聚体和三聚体的相对粗糙的旧BSA样品，主要是为了测试色谱柱的效率。然后使用在此BSA样本上获取的SE-HPLC-SAXS数据验证美国-索马里HPLC-SAXS模块和从典型处理过程中拍摄的许多图像用于补充材料中，以描述模块（图S12-S15、S19、S21、S22和S24-S30）。由于典型的HPLC-SAXS实验产生了一系列我(q个)与q相比以某个时间间隔（“帧”）收集的数据可以插入到二维矩阵中，其中每行对应一个帧编号（或时间值），列包含强度我(q个)及其在不同散射角下的相关标准偏差q个。换位生成另一个矩阵，其中直线对应于q个值，并且每列包含强度我(t吨)（及其关联的SD）对应于每个帧编号（或时间值）。如图S13所示我(t吨)与t相比色谱图显示，在蛋白质峰后，基线可能不会恢复到初始值[注意，缓冲区贡献首先通过平均柱空隙体积之前的许多帧来评估，已经从SAXS中减去我(q个)与q相比每帧的数据]。这很可能是由于强X射线束聚集在毛细血管细胞壁上的生物物质所致。虽然这类问题优先在实验层面上处理（见下文注2），但这并不总是可能的。在这种情况下，作为第一近似值，我们可以假设沉积在毛细管上的物质随时间线性增加。这允许为每个q个-价值色谱图（见图S14），然后可以减去（见图S15）。如有必要，可对该基线提交数据集进行高斯分解（见图S19、S21、S22和S24-S27）。SVD也可以在原始图像上执行，如果执行了基线减法，则可以在重建图像上执行我(q个)与q相比数据集，例如，用于确定分解每个峰值应使用多少高斯数（参见hpHMW-FG部分；在这种非常简单的情况下不需要）。重要的是，每个高斯函数在“族”中的位置和宽度(即总的来说是高斯人q个-在时间或帧域中拟合特定色谱峰的值色谱图）必须具有相同的值，并且只拟合振幅。这是通过首先在q个-值色谱图（见图S21、S22和S24），可选SD加权（推荐），然后将其全局应用于所有q个-值色谱图（见图S25-S26）。在图S25中，第130帧至第150帧周围残差的非随机分布来自色谱图的尾端，这些色谱图没有用纯高斯函数很好地拟合。在未来的发展中，将引入能够处理倾斜轮廓的修正高斯函数。

浓度监测数据（吸光度或折射率然后，可以在重新缩放和时间偏移（如有必要）后进行分解，以便与SAXS数据进行适当对齐（见图S28和S29）。分解是使用相同数量的高斯系数来进行的，高斯系数用于拟合每个q个-价值色谱图，保持其宽度不变，如有必要，只允许其位置发生微小变化（2-4%），以补偿潜在的偏差，并调整振幅（图S30）。注意，如果浓度和SAXS探测器之间出现明显的频带展宽，则不可能在高斯宽度不变的情况下拟合浓度信号。为了解决这个问题，将实施频带展宽校正程序。

在基线校正后（如有必要）或高斯分解后，可以反向生成我(q个)与q相比通过数据矩阵的反向变换，每个帧中每个高斯的数据集。直接从高斯生成数据会生成平滑的数据集，这可能会隐藏潜在的问题。因此美国-索马里HPLC-SAXS模块根据每个高斯函数对曲线中特定点的贡献，以原始曲线的百分比形式生成数据我(t吨)与t相比曲线，并且SD也按比例分配。最后，如果浓度曲线及其高斯分解与我(t吨)与t相比数据，可以计算每个结果的分数浓度我(q个)与q相比分解帧。通过输入消光系数（或dn个/d日c，如果是折射率（参见图S31），模块将其与每个结果关联我(q个)与q相比框架。计算〈M（M）〉_w个, 〈M（M）/L（左）〉_{w个/z（z）}和〈M（M）/A类〉_{w个/z（z）}，在这个阶段，部分比体积也可以与每个高斯函数相关联（图S31），并同样结转至结果我(q个)与q相比框架。如果实验数据包含多个物种，则可以为每个高斯输入不同的值，但对于具有多个构象或不同缔合状态的单个物种的更一般情况，可以将其设置为相等的值。

为了演示基线校正和高斯分解的性能，我们选择了BSA的一个区域色谱图三聚体和二聚体没有很好地分离。在图2中，我们显示了色谱框架#70的基线校正高斯分解结果（见图S26），生成了我(q个)与q相比以原始曲线的百分比计算的帧。注意基线减法是如何消除原始数据在q个< 0.01 Å⁻¹以及峰#3没有任何显著贡献。如果重新添加基线，“高斯和”曲线（绿色）将完全叠加在原始帧上（为清晰起见，未显示）。浓度，q个范围、拟合标准误差和衍生[〈R（右）_克²〉_z（z）]^1/2和〈M（M）〉_w个原始帧和基线分帧#70的值，以及分解后的高斯峰值（G-pk）#1和#2的值，如表1所示也可以将其与顶部获得的值进行比较色谱法两个组件的峰值框架（见图S26），#50和#81。此外，还分析了BSA单体#125的顶峰框架。第一个观察结果是，对于前两个峰值，单独进行基线减法或随后进行高斯分解都会得到〈M（M）〉_w个值低于从未处理帧导出的值。这是可以理解的，因为在Guinier的分析中，明显的好转处于非常低的水平q个原始帧中的值（见图S12）在q个用于线性回归的范围。第二个观察结果是BSA单体M（M）〉_w个值，～75–77 000 g mol⁻¹，比序列推导的66 283 g mol高约15%⁻¹。平均峰值#3的前十帧产生了更好的统计数据，但没有显著改变这些值（数据未显示）。这一结果得到了〈M（M）〉_w个BSA二聚体的值（表1，第81帧），比预期值约132 600 g mol高6–15%⁻¹，部分也处于三聚体水平（表1，框架#50），然而，其中存在的材料量非常低，因此很难确定正确的〈M（M）〉_w个特别是，对于帧#50，生成的〈M（M）〉_w个从基线提交和G-pk#1我(q个)曲线差异很大，两者都不同于未处理帧的结果〈M（M）〉_w个这表明在这个噪音很大的低强度区域，基线减法不充分。在不久的将来将实施更先进、更灵活的基线减法例程。至于一般情况M（M）〉_w个众所周知，血清白蛋白可以结合多种配体(例如彼得斯，1985年; 法萨诺等。, 2005)使用相对粗糙（例如，未消耗脂肪酸）的旧BSA原料，因为我们主要感兴趣的是有足够的三聚体和二聚体用于柱效率测试。因此，在M（M）〉_w个这一水平并不令人惊讶，也可能是全球灭绝系数变化和部分比体积推定的BSA-配体复合物。由于BSA测试的目的不是为了检查〈的准确性M（M）〉_w个确定在我们的设置中，此问题没有进一步调查。至于构象参数，对于主单体顶峰框架#125，外推[〈R（右）_克²〉_z（z）]^1/2来自未处理、基线提取和G-pk#3数据的值与27.7º的值非常一致，可以使用冰霜来自BSA三维结构（Bujacz，2012). 更重要的是，对于帧#70，其中G-pks#1和#2都有重要贡献，分解产生[〈R（右）_克²〉_z（z）]^1/2与从顶部峰值处理的帧#50和#81导出的值非常接近的值，而未处理或基线提交的帧如预期的那样仅产生这两个值的平均值。鉴于该地区数据的低强度水平，我们发现该结果非常令人满意。

表1 根据无基线减法（bas.sub.）和高斯分解（G-pk）的BSA SE-HPLC-SAXS数据的吉尼亚分析得出的参数 括号中的值是线性回归标准偏差得出的最低有效数字的不确定性。 G-Pk框架 c（毫克毫升−1) [〈R（右）克2〉z（z）]1/2(Å) 〈M（M）〉w个（克摩尔−1) q个最小值(Å−1) q个最大值(Å−1) Fit St.Er公司。† 70号机架，原装 0.090 46.7 (8) 183300 (2200) 0.0103 0.0282 0.0435 第70帧，基本。附属的。 0.090 41.2 (11) 148300 (2100) 0.0078 0.0282 0.0588 机架#70，G-pk#1 0.024 50.7 (17) 159800 (3100) 0.0101 0.0282 0.0660 机架#70，G-pk#2 0.069 38.2 (12) 139400 (1900) 0.0091 0.0282 0.0496 第50帧，原始 0.044 49.2 (45) 235500 (10600) 0.0124 0.0212 0.0768 框架#50，基本。附属的。 0.044 51.1 (23) 180000 (4800) 0.0078 0.0245 0.0975 框架#50，G-pk#1 0.040 50.6 (25) 194800（5900） 0.0101 0.0245 0.0898 第81帧，原件 0.173 41.7 (6) 152100 (1400) 0.0144 0.0310 0.0284 第81帧，基本。附属的。 0.173 40.5 (5) 139600（900） 0.0103 0.0282 0.0231 第81帧，G-pk#2 0.160 39.7 (5) 141500 (900) 0.0103 0.0282 0.0363 125号机架，原装 1.008 28.1 (3) 77200 (300) 0.0146 0.0315 0.0098 125号框架，基本。附属的。 1.008 27.2 (4) 75300 (300) 0.0124 0.0282 0.0116 机架#125，G-pk#3 0.982 27.2 (4) 77300 (300) 0.0124 0.0282 0.0116 †，其中s.d.是与每个数据点相关的标准偏差，DOF是自由度线性拟合。这提供了一个与标准偏差大小无关的理想值。

图2 SE-HPLC-SAXS BSA分析的原始帧#70（顶部，黑色方块）（见图S26），所得结果之和我(q个)与q相比高斯（绿色方块）的反向生成，以及贡献我(q个)与q相比峰#2（二聚体；品红色方块）和峰#1（三聚体；红色方块）的单个高斯数。高斯峰#3（单体；底部，蓝色方块）对该帧没有显著影响。

总结本节我(t吨)与t相比转换首先通过可视化毛细污垢证据来演示，然后是基线校正和高斯分解的基本原理我(q个)与q相比已实施恢复并成功测试。然而，进一步的改进，特别是基线减法和浓度监测数据的处理，可能是有益的。

4.2. 纤维蛋白原HPLC-SAXS

hpHMW-FG制剂的SE-HPLC-SAXS存在几个问题。首先，该FG部分有强烈的聚集趋势，尤其是在冻融操作期间。即使在高速离心和中心过滤后，仍存在大的聚集物，并在HPLC柱的空隙体积附近形成宽峰洗脱，如图3中的UV轨迹所示其次是一个次要的非基线再溶解物种，主峰在最大值之后出现一个突出的路肩。此外，尽管采取了所有常见的预防措施，但在运行过程中，毛细污染的情况与BSA运行的补充材料中所示的情况类似（见图S13）。如果没有基线校正和高斯分解，就很难从这次运行中提取高质量的数据。²

图3 （主面板）hpHMW-FG（20µl，17.3 mg ml）SE-HPLC-SAXS分析的UV色谱图−1TBS中注射）。（插图）SDS/尿素–从SAXS设置断开后，对起始材料（注射）和重复运行中收集的部分进行PAGE分析（100µl，～9 mg ml−1注射）。分数显示在主面板的底部。测定了它们的浓度，并在10×8 cm 1.5的孔中装入等量的未还原样品（对于组分2-7为-1.9µg，但对于组分1和8仅为-1.2µg）mm厚3.2%T–5%C聚丙烯酰胺SDS/尿素凝胶，电泳，考马斯蓝染色，并进行密度分析（见Cardinali等。, 2010). 每条车道底部报告了两个主要波段的分数浓度，以%表示。

基线定义和减法（未显示）后，进行SVD和高斯分析。对重建的我(q个)与q相比数据集，以避免拟合基线漂移。如图4所示(一)，至少有四个组成部分，可能是五个，正在对数据做出相关贡献。然而，最终发现，六个高斯人是产生一个相当合适的我(t吨)与t相比色谱图。在图4中(b条)，单个q个显示了价值，五个“主要”G-pk（#1–4，#6）的贡献显而易见。然而，如果没有小的G-pk（#5）位于主色谱峰下的两个主要G-pk之间（#4和#6），则拟合效果明显较差（数据未显示）。全局拟合和全局高斯运算的结果为所有峰值生成了非常好的高斯拟合我(t吨)与t相比检查的色谱图(q个范围0.00302–0.170º⁻¹，高于此噪声占主导地位），如图5所示注意，当考虑到噪声存在时，残差是如何非常低的（大多在2个SD内），尤其是在非常低的情况下q个值，并且分布均匀（色谱图的最开始和结束处除外）。然而，必须指出的是，考虑到高斯分析的性质，以及在这种情况下使用的高斯数，可以找到许多替代解决方案，这些解决方案也适合数据，甚至可能更好。在这种情况下，重复多次操作，并根据总均方根偏差和残差分布选择结果。紫外线色谱图，在重新缩放和时间偏移之后，也使用相同的六个高斯函数进行了很好的分解，保持了相同的宽度，并且只允许在为我(t吨)与t相比数据（未显示）。因此，可以反向生成一系列我(q个)与q相比所有六个G-pk的相关样本浓度框架。

图4 (一)前十个奇异值的图与基线重构SVD分析的值数我(q个)与q相比对于hpHMW-FG SE-HPLC-SAXS数据集(q个= 0.0030–0.170 Å−1). (b条)（上图）单个我(t吨)与t相比 色谱图对于q个= 0.0058 Å−1（青色），带有六个拟合高斯曲线（绿色曲线，从左到右编号为1-6）。黄色曲线是高斯曲线的总和。（下图）拟合相关的简化残差。

图5 （上图）hpHMW FG SE-HPLC-SAXS数据的全局高斯图[664我(t吨)与t相比数据集来自q个= 0.0030 Å−1到q个= 0.170 Å−1]. 使用六个高斯拟合数据，其中心和宽度分别由垂直的蓝色和洋红色线条以及绿色水平条表示。（下图）拟合相关的简化残差。

然后确定每个G-pk的前10–20帧，并根据其相关分数浓度进行归一化并取平均值。所有数据随后导出到主美国-索马里用于整体和横截面吉尼亚分析，其结果如图6所示转换后我(q个)数据到我*(q个)（参见补充材料中的§1.3.5），并在表2中以数字形式报告如图6所示(一)，六个高斯峰产生了干净的数据，在定义适当的标准偏差后，可以使用标准偏差加权和自动剔除异常值（设置为±2标准偏差）的整体吉尼亚方法进行分析（见图S9q个²范围。对于G-pks#1–3，线性范围仅在非常低的情况下才明显q个²值（也受q个_最大值R（右）_克<1.3规则）。在图6中(b条)强度范围在11.5和14.0[ln（g mol）之间的放大⁻¹)]为了更好地检查G-pks#4（蓝色）、#5（洋红色）和#6（黑色）的总体吉尼亚曲线，其中主色谱峰被分解。这个横截面吉尼亚数据如图6所示(c)和6(d日)（为了清楚起见，这些面板中省略了次要的G-pk#5数据）。首先考虑主峰分量（图6d日; G-pks#4，蓝色，#6，黑色），数据显示线性范围扩大，下降幅度很低q个棒状分子的预期值；两条曲线之间的微小垂直偏移表明M（M）/L（左）峰值分量之间的比率（见表2). 有趣的是，所有低聚物曲线（图6c，G-pks#1–3）显示了一个共同的线性区域，与主峰分量具有相同的斜率和非常相似的截距，但G-pks#1（青色）和#2（红色）也在非常低的水平上显示出显著的上升q个可以用直线独立拟合的值，而G-pk#3没有。

图6 (一)在[我*(q个)]与q相比2图5所示的hpHMW-FG SE-HPLC-SAXS数据分解所得的所有六个高斯峰的平均和浓度/标准化顶峰框架的吉尼亚图线性回归（直线）中包含的数据用填充符号表示。所有线性回归均采用SD加权，在定义适当的q个2范围，受q个最大值R（右）克<1.3规则。(b条)G-pks#4（蓝色）、#5（洋红色）和#6（黑色）的吉尼亚曲线以扩大的比例显示。(c), (d日)交叉截面在[气*(q个)]与q相比2同一数据的吉尼亚曲线(一)和(b条)（为了清楚起见，省略了G-pk#5，所有数据集只显示了一半的实际点，并且在非物理条件下延长了回归线q个2<0值，而q个2=0轴显示为垂直灰色线）。拟合了两个线性区域，均受q个最大值R（右）c<1规则，适用于G-pks#1和#2[(c)，下部q个2范围，虚线；较高的q个2-范围，实线]，一个用于所有其他[实线；G-pk#3(c)；G-pks#4和#6(d日)].

数值结果如表2所示现在可以检查了。即使在某些峰的平均浓度很低的情况下，数据及其统计数据都似乎非常好或非常好。如表2所示是对预平均值进行吉尼亚分析的结果我(q个)与q相比数据集，但通过单独分析每个帧，然后对导出的参数（未显示数据）进行加权平均，可以获得类似的结果。第一个明显奇怪的结果是G-pk#2和G-pk#3几乎相等[〈R（右）_克²〉_z（z）]^1/2值，包含具有完全不同〈的材料M（M）〉_w个值，G-pk#2接近FG七聚体和G-pk#3，随后洗脱，与FG二聚体相容。这一发现的一个可能解释是，G-pk#2包含FG并排聚集体，而G-pk#3包含端到端共价二聚体，通常存在于FG制剂中。这得到了横截面Guinier分析显示R（右）_c²〉_z（z）]^1/2和〈M（M）/L（左）〉_{w个/z（z）}从中间产物导出的值-q个-距离数据，可能是由FG主体散射产生的，以及从低辐射源获得的高出约5–6倍的值-q个-G-pk#2的范围数据，表明仅此样品中FG聚集体在较厚但松散结合的结构中的排列。因此，尽管总体上类似[〈R（右）_克²〉_z（z）]^1/2G-pk#2中存在的较粗骨料比较细骨料（〈d日〉≃50º），拉长但灵活的端对端FG二聚体。至于G-pk#1，它可能包含几种较大并排FG聚集体的混合物。对于在主色谱峰下洗脱的材料，我们的分析表明存在两种不同但非常相似的物种（G-pk#5，用于改进拟合，可能是由于洗脱材料的非纯高斯行为造成的伪影）。从SAXS装置断开连接后，在单独的SE-HPLC运行中收集的非还原样品的SDS/尿素-PAGE分析证实了这一点，如图3所示数据显示了FG（顶带）在所有组分中的完整程度（每个组分跨越～8个SAXS框架），但逐渐受到与其共同洗脱的快速迁移物种（低带）的污染。图3中每个车道底部报告的密度分析结果插图显示，只有一小部分完整的FG不受部分降解形式存在的阻碍而洗脱，两者在大多数部分中的存在量大致相同。令人惊讶的是，在注入的材料中几乎没有下带（图3中最左边的通道插图），含有大部分未降解的FG（主带）以及一些共价聚集体（顶带）和痕量的严重降解物种（微弱的底带）。这表明，新的、较低的条带代表了通过污染蛋白酶的作用或自溶在柱内形成的降解产物，凝胶过滤过程引起的构象变化可能会对其有利（起始材料在洗脱缓冲液中进行了大量透析，成分没有任何明显变化）。用识别A的抗体染色相同组分的还原样品的western blotα-链N末端（未显示数据），并与我们之前的hpHMW-FG分析进行比较（见图1-2和表1Raynal的等。, 2013)，该频带源于长的、大部分非结构化A的C端部分的退化α链。结合所有密度分析，我们可以合理地将顶带分配给具有A的FG物种的同源和异源双分子α610和Aα601链和A的异二聚体α610或Aα601带Aα583条链（总分子量～339 000–335 000；平均的E类²⁸⁰=1.53毫升毫克⁻¹ 厘米⁻¹和=0.715毫升克⁻¹)和包含A的异二聚体的低带α601–答α461和Aα583–年α461（加上A的痕迹α583–年α424和Aα461–甲α424）和Aα583和Aα461个同型二聚体（总分子量～333 000–307 000；平均的E类²⁸⁰=1.58毫升毫克⁻¹ 厘米⁻¹和=0.715毫升克⁻¹). 因此，似乎有一个Aα链条切割低于残渣461或2 Aα在583残基以下切割的链是成为低带的必要条件，但在非还原但变性的条件下，不同物种仅在两个带中聚集的原因仍有待研究。同时，该分析表明，虽然目前在FG单体样品中不可避免地存在相当程度的多分散性，但对于对应于未还原凝胶顶带的材料来说，这个问题要严重得多。因此，主hpHMW-FG HPLC-SAXS峰的高斯分解提供了几乎全长FG的数据，不含低聚物和主要降解产物。在任何情况下，这两个物种在结构上非常相似，如非常接近的R（右）_克²〉_z（z）]^1/2和[〈R（右）_c²〉_z（z）]^1/2表2中报告的值适用于G-pks#4和#6。与降解过程耦合的构象变异性/灵活性可在柱孔内外产生扩散控制的统计分区，从而增强突出的肩部形成。测量值〈的明显差异M（M）〉_w个和〈M（M）/L（左）〉_{w个/z（z）}在G-pks#4和#6之间，在存在更多降解材料时显示出意外的更高值，这可能是由于降解物种之间的优先相互作用，导致明显更高的M（M）〉_w个事实上，当单独分析G-pk#6下降一半的单帧时M（M）〉_w个值很明显。外推到c=0导致了M（M）〉_w个在表2中括号内报告大大低于平均值，并且非常接近基于A的预期值α链退化分析，尽管存在很大的不确定性。重要的是，我们对分解主峰的分析表明，FG a的C末端损失了大量材料α链条不会显著改变其外形尺寸，只是稍微改变其横截面。后者可以根据人类FG结构域的分子排列和近似尺寸进行合理化，如晶体结构（科尔曼等。, 2009)：中心域(R（右）_c²≃ 200 Ų,M（M）≃38 751 Da），两个连接的螺旋线圈区域（每个，R（右）_c²≃ 80 Ų,M（M）≃33 622 Da），两个Bβ-链末端子域（对于每个，R（右）_c² ≃ 380 Ų,M（M）？44 449 Da），两个γ-链末端子域（对于每个，R（右）_c²150Ų,M（M）≃30 105 Da），加上两个Aα-结构未解析的链C末端域(M（M）≃各41 906 Da）。假设合理R（右）_c²≃ 300 Ų对于可能结构松散的Aα-链C末端结构域，平均重量（Hjelm，1985) [〈R（右）_c²〉_w个]^1/2=15.5º结果，与表2相符值。略高[〈R（右）_c²〉_z（z）]^1/2和〈M（M）/L（左）〉_{w个/z（z）}G-pk#6的观测值可能是由于αFG主体上的C区域。