Shape of α-crystallin analyzed by small-angle neutron scattering

Sugiyama, M.; Fujii, N.; Morimoto, Y.; Otomo, T.; Takata, S.; Misawa, M.; Annaka, M.; Itoh, K.; Mori, K.; Sato, T.; Kurabayashi, S.; Fukunaga, T.

doi:10.1107/S0021889807006838

会议文件

第页，共页
应用
结晶学

国际标准编号：1600-5767

第40卷| 第s1部分| 2007年4月| 页码s200-s204

doi:10.1107/S0021889807006838

的形状α-晶体蛋白的小角中子散射分析

^一日本大阪京都大学反应堆研究所590-0494，^b条高能加速器研究组织，茨城305-0801，日本，^c（c）日本新泻950-2181新泻大学自然科学与技术研究所^d日日本福冈九州大学化学系812-8581
^*通信电子邮件：sugiyama@rri.kyoto-u.ac.jsp

(收到日期：2006年8月16日； 2007年2月8日接受；在线2007年4月6日)

重组人聚集体的大小和形状αA-晶体蛋白和α用小角中子散射和动态光散射研究B-晶体蛋白。在生物活性温度（310 K）下，两种多肽形成大小和形状几乎相同的聚集体。这个αB-晶体蛋白在310 K和288 K下保持几乎相同的大小和形状，而αA晶体蛋白在288 K下出现变形。这一结果表明，在较低温度下，多肽的两种聚集体之间的结构稳定性存在差异。

关键词：αA-晶体蛋白;αB-结晶蛋白;小角中子散射;动态光散射.

1.简介

众所周知，蛋白质的功能与其三维结构密切相关：规则结构产生规则功能。换言之，当蛋白质因错误折叠等原因失去其规则结构时，它就不会正常工作。不规则蛋白质被识别，然后被修复或分解成氨基酸。然而，某些不规则蛋白质在生物体内聚集并积累。长期来看，这些异常聚集物的积累可能会导致严重的疾病，例如变异的克雅氏病（由异常朊病毒引起）、阿尔茨海默病（由β-淀粉样蛋白）等。

关于这些异常蛋白质的聚集，我们有两个问题：异常聚集的触发因素是什么，聚集是如何进行的？为了回答这些问题，我们研究了人类晶状体蛋白晶体蛋白：在紫外线、X射线、，γ-射线照射和低温下，晶体蛋白形成巨大的聚集体。当异常聚集物积聚在人眼晶状体中时，白内障最终形成。

在人眼晶状体中存在三种类型的晶体蛋白，α,β和γ-晶体蛋白。其中，α-晶体蛋白具有伴侣活性，在防止晶体蛋白异常聚集方面起着重要作用。事实上，作为α-晶体蛋白进展异常，高分子量（HMW；大于10⁶ Da）出现。在老年性白内障晶状体中，观察到大量HMW聚集体。因此，我们认为α-晶体蛋白是解决上述问题的关键蛋白。

异常聚集的触发α-晶体蛋白尚不完全为人所知，但它可能与翻译后修饰如脱酰胺有关（沃特等。, 1988 )，外消旋化和异构化（Fujii，Satoh等。, 1994 ; 石桥富井等。, 1994 )，截断（Miesbauer等。, 1994 ; 埃蒙斯和武本，1992年 ; 武本，1995年 )磷酸化（Miesbauer等。, 1994)，氧化（武本，1996一 )，分子内二硫键增加（Takemoto，1996b条 ; 切里安·肖等。, 1999 )和糖基化（Swamy等。, 1993 ). 蛋白质中氨基酸的外消旋和异构化会导致结构上的重大变化，因为不同的侧链取向会导致异常的肽骨架。被截断的亚基、分子内二硫键的增加和高级糖化终产物也可能干扰晶体蛋白的正常封闭堆积结构。因此，这些翻译后修饰可以诱导部分去折叠，导致伴侣样活性降低，继而最终形成白内障。

天然聚集体和异常聚集体的结构信息对揭示人类异常聚集体过程具有重要意义α-经过翻译后修饰的晶体蛋白。然而，这些骨料的结构特征（如尺寸和形状）尚不充分。用于结构调查α-结晶蛋白，第一个问题是获得足够的人类α-第二种是单晶X射线结构分析方法，这是一种最强大的工具，由于结晶α-晶体蛋白目前尚未实现。在我们的工作中，重组人αA-和αB-晶体蛋白，是由α-晶体蛋白在BL21（DE3）pLysS中表达大肠杆菌细胞。此外，采用小角中子散射（SANS）和动态光散射（DLS）方法观察这些亚基聚集体的大小和形状，因为这两种方法都可以揭示溶液中样品的结构信息。

本文首先报道了由重组人组成的聚集体的形状和大小αA-和αB晶体及其结构稳定性取决于温度。

2.实验

2.1. 样品制备

在其原生状态下，α-晶体蛋白是一种水溶性聚集体，分子量约为800kDa。聚集体由两种亚基组成，αA-和α分别含有173和175个氨基酸残基的B-晶体蛋白。由于这两个亚基的分子量约为20 kDaα-晶体蛋白含有约40个亚基。我们为人类做了准备αA-和α表达的B-晶体蛋白大肠杆菌如下一节所述。净化和冷凝后αA-晶体蛋白和αB-晶体蛋白用于DLS测量。此外，在将溶剂（轻水）与重水交换后，用D₂O溶液样品。

2.1.1. 重组人的过度表达αA-和αB-晶体蛋白

含有人类的DNA片段α通过聚合酶链反应（PCR）扩增人胎脑（Clontech，CA）第一链cDNA，获得A-晶体蛋白，其正义引物为5′-CCATGG公司ACGTGACCATCCAG-3′和5′-GGCTGTATCAAAGGAGT-3′的反义引物。sense底漆的设计包括Nco公司I位点和核苷酸序列中的斜体显示限制位点。PCR反应进行了40个变性周期（367K，30s）、退火周期（333K，30S）和延伸周期（345K，60s）。PCR产物经凝胶纯化，并使用pBluescript TA载体（Strategene，CA）亚克隆。这个Nco公司I–巴姆DNA片段的HI消化产物αA晶体蛋白被连接到Nco公司I–巴姆T7表达载体pET-3d的HI位点（诺瓦根，威斯康星州）。

重组人α华盛顿大学J.Mark Petrash赠送的B-crystallin cDNA被亚克隆到Nco公司我/Hin公司载体pET-23d（+）（Novagen）的dIII位点。

αA-和α将B-晶体蛋白质粒插入大肠杆菌菌株BL21（DE3）pLysS，并表达为重组αA-和αB-晶体蛋白。大肠杆菌将转化体在含有50µg ml的10 ml LB培养液中培养12小时⁻¹氨苄西林和30µg ml⁻¹氯霉素。12 h后，将10 ml培养液添加到1 l LB中，并培养约2 h（OD₆₀₀=0.6），之后表示αA-和α通过添加异丙基-1-硫诱导B-晶体蛋白-β-D类-吡喃半乳糖苷（IPTG）的最终浓度为0.3 mM（M）并在298 K下再生长5小时。IPTG诱导后，大肠杆菌通过离心收集细胞并在50m内进行超声处理M（M）Tris–盐酸缓冲液pH 7.8，100 mM（M）氯化钠，1.0 mM（M）EDTA，1.0米M（M）苯甲烷磺酰氟。通过离心将超声制剂分离成可溶性部分和颗粒。将包括蛋白质在内的可溶性组分置于离子交换柱（Q Sepharose Fast Flow，Amersham Biosciences）中，并使用0–1的梯度洗脱M（M）最小3.0 ml NaCl⁻¹.αA-和α在200–300 m范围内回收了B-晶体蛋白M（M）和100–200米M（M）NaCl分数。随后，将样品应用于凝胶过滤HPLC柱（TSK gel-G3000SW，Tohso，Japan）。使用Amicon-Ultra 4柱收集并浓缩空隙体积分数。

2.1.2. 重组人SDS-PAGE和Western blot分析αA-和αB-结晶蛋白

重组人αA-和αB-晶体蛋白表达于大肠杆菌将纯化的晶体溶解在样品缓冲液中（2%十二烷基硫酸钠、6%2-巯基乙醇、10%甘油、0.05M（M）Tris–HCl pH 6.8），并通过SDS–聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS–PAGE）进行分析。分离蛋白用考马斯亮蓝染色法检测。对于Western blot分析，蛋白质被加载并在15%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上运行，转移到聚偏二氟乙烯膜上，在PBS缓冲液中用5%的奶粉封闭，并用抗αA-或αB-晶体蛋白抗体其次是山羊抗兔辣根过氧化物酶偶联二级抗体。通过ECL化学发光检测（Amersham Biosciences）显示免疫反应带。

2.2. 动态光散射

ALV DLS/SLS-5000光散射系统配备ALV-5000多重数字相关器，光源来自单相22 mW He–Ne激光器(λ=632.8 nm）用于DLS实验。在310 K下，在七个不同的散射角（30、45、60、90、120、135和150°）下进行实验αA-和αB-晶体蛋白调整为1.0 mg ml⁻¹.

2.3. 小角中子散射

使用D进行SANS实验₂O解决方案αA-和α使用安装在日本高能加速器研究组织KEK材料结构科学研究所中子科学实验室（KENS）散裂中子源处的小/广角中子衍射仪（SWAN），在310 K和288 K温度下测定B晶体蛋白。样品溶液的SANS强度经过透射、背景散射、细胞散射和缓冲溶液散射的标准校正后，可以得到溶质（蛋白质）的散射。样品浓度为3.0 mg ml⁻¹两种样品的测量时间均为6h。

3.分析

3.1. 动态光散射

A强度-强度-时间相关函数g⁽²⁾(Γ)由DLS光谱仪测量：

$[g^{（2）}（\Gamma）=A\left[1+\beta|g^{（1）}[\tau）|^2\right]，\eqno（1）]$

哪里A类,β和 $[|g^{（1）}（\tau）|]$ 分别是背景、相干因子和归一化电场相关函数（Brown，1996 ). 用约束正则CONTIN方法（Provencher）分析电场相关函数等。, 1978 )，以产生关于特征线宽分布的信息G公司(Γ)来自

$[|g^{（1）}（\tau）|=\int g（\Gamma）\exp（-\Gamma\tau”）{\rm d}\Gamma.\eqno（2）]$

特征线宽的归一化分布函数G公司(Γ)由此获得的结果可用于确定平均表观扩散系数D类_{av（平均值）}

$[D_{\rm av}={{\Gamma}/{q^2}}，\eqno（3）]$

哪里q个= (4πn个/λ)罪(θ/2）是散射矢量的大小，n个是溶剂的折射率，λ是入射光的波长，θ是散射角。在稀释状态下，D类_平均值随浓度线性变化

$[D_{\rm av}=D_0（1+k_{\rma D}c+\cdots），\eqno（4）]$

哪里D类₀是无限稀释时的扩散系数k个_D类是水动力维里系数。斯托克斯-爱因斯坦方程D类₀视水动力半径R（右）_小时:

$[D_0={{kT}/{6\pi\etaR_{rmh}}}，\eqno（5）]$

哪里k个是玻尔兹曼常数η是水在温度下的粘度T型.

3.2. 小角中子散射

为了找到回转半径R（右）_克，我们在低端进行了吉尼亚近似-q个地区：

$[I（Q）=I_0\exp\左（-{{R_{\rm g}^2Q^2}/{3}}\右），\eqno（6）]$

哪里 $[Q=（4\pi/\lambda）\sin（\theta/2）]$ 是散射矢量的大小，λ和θ分别是入射中子波长和散射角。散射强度显示为直线，线的斜率表示R（右）_克²/3关于吉尼尔阴谋[我(问)]与问².

值得研究距离分布函数P（P）(R（右）)找到最佳可比形状。距离分布函数P（P）(R（右）)由散射强度的傅里叶变换给出我(问)如下所述，

$[P（R）={{1}\over{2\pi^2}}\int^{\infty}_{0}我（Q）（QR）\sin（QR）{\rm d}Q.\eqno（7）]$

为了减少傅里叶变换的终止误差，SWAN是一种非常合适的光谱仪，因为它可以在宽范围内观测散射强度问-范围（10⁻³到10⁰ Å⁻¹)同时利用飞行时间谱仪和脉冲中子源的特点。

4.结果和讨论

4.1. 生物活性温度（310 K）下的尺寸和形状

首先，我们将检查DLS测量的结果。图1显示了观测到的强度-强度-时间相关性和特征线宽的分布αA-和αB-晶体蛋白溶液θ= 60° (q个= 1.87 × 10⁷ 米⁻¹). 在每个G公司(Γ)图。所以，在每个样品中，骨料几乎是单分散的，并没有更大分子量的骨料。

图1
DLS测量的典型结果(一)αA晶体蛋白溶液和(b条)αB-晶体蛋白溶液。实心和空心圆圈表示强度-强度-时间相关性克⁽²⁾(Γ)以及特征线宽的分布G公司(Γ)在θ= 60° (q个= 1.87 × 10⁷ 米⁻¹)分别是。两个面板都表明颗粒是单分散的，溶液中没有巨大的聚集体。

图2显示了弛豫速率的角度依赖性(Γ 与 q个²)第页，共页αA-和αB-晶体蛋白聚集体。松弛率Γ与…成比例q个²，如单分散粒子扩散运动所预期的[方程式（3）]]. 平均扩散常数αA-和α发现B-晶体蛋白聚集体为4.74±0.17×10⁻¹¹和4.42±0.17×10⁻¹¹ 米² 秒⁻¹分别是。假设浓度较低，则流体动力半径R（右）_小时属于αA-和α根据方程式（4），B-晶体蛋白聚集体为69.6±2.5和74.7±2.9Ω和（5）分别为；结果表明，骨料的粒径αA晶体蛋白可能略小于αB-晶体蛋白。

图2
310 K下两种骨料松弛速率的角度相关性。填充圆和开放圆表示αA-和αB-晶体蛋白。直线显示了与方程（3）进行最小二乘拟合的结果

SANS为我们提供了溶液中颗粒大小的更直接信息。图3显示散射强度（插图）及其吉尼亚曲线αA-和α310 K下的B-晶体如图所示，在此情况下可以很好地观察到吉尼亚近似问-范围。根据方程式（6），的R（右）_克的值αA-和αB-晶体蛋白分别为51.6±0.2和52.4±0.1Ω。两个骨料之间的尺寸关系与DLS实验结果一致：αA晶体蛋白略小于αB-晶体蛋白。两个特征半径的比值ρ(=R（右）_克/R（右）_小时)为0.74±0.03和0.70±0.03αA-和αB-晶体蛋白聚集体。自ρ对于球体为0.78，可以说这两种晶体的聚集体具有类似于球体的形状。

图3
Guinier图和SANS剖面图（插图）(一)αA-晶体蛋白和(b条)αB-结晶蛋白在310K下聚集。直线显示了与方程（6）拟合的最小二乘结果

为了分析更详细的结构，我们计算了距离分布函数P（P）(R（右）)式（7）.低于0.01°时的散射强度⁻¹根据吉尼尔公式推断[方程式（6）]. 此外，使用观测到的散射强度，直到问-范围（至1.0º⁻¹)为了减少傅里叶变换的终止误差。因此，决议 $[\bigtriangleup R]$ 在P（P）(R（右）)理论上由 $[\bigtrianglup]$ R（右）= 2π/问_最大值≃ 6 Å.

图4显示P（P）(R（右）)对于αA-和α310 K下的B-晶体蛋白聚集体P（P）(R（右）)彼此非常一致，表明αA-和αB-晶体蛋白聚集体几乎相同。然而R（右）-上的节P（P）(R（右）)的αB-晶体蛋白聚集体（～160℃）略长于αA-晶体蛋白聚集体（～145º）。这也与R（右）_克如前所述，在两个骨料之间。

图4
距离分布函数P（P）(R（右）)用方程式（7）计算

)310 K。实心圆圈和空心圆圈表示P（P）(R（右）)的αA-和αB-晶体蛋白聚集体。

考虑到ρ这两种聚集体的比率接近于刚性球体的比率，我们假设αA-和αB晶体蛋白聚集体可能是一个略长的球体。作为第一近似，我们假设形状可以是以下等式的旋转体，

$[\left（{x\over R_{\rm l}}\right）^m+\left。\等式（8）]$

在这里，R（右）_我和R（右）_秒分别为最长轴和最短轴的一半距离，米为控制参数，旋转轴为x轴。例如，形状是球体和圆柱体米=2和 $[m=\infty]$ 分别是。我们找到了最好的折衷方案R（右）和米通过比较P（P）(R（右）)遵循方程式（8）观察到P（P）(R（右）):R（右）_我是从R（右）-剖面图（见图4). 在旋转体假设下，最佳折衷椭圆度第页(=R（右）_秒/R（右）_我)和米对于αA-晶体蛋白骨料，0.65和2.8用于αB-晶体蛋白聚集体。如图5所示,P（P）(R（右）)用旋转体模型计算的结果与实测值吻合较好。

图5
计算和观测的距离分布函数P（P）(R（右）)第页，共页(一)的αA-晶体蛋白和(b条)的αB-晶体蛋白聚集体。实心圆圈显示观察到的P（P）(R（右）).实心曲线表示P（P）(R（右）)根据旋转体假设，根据最佳折衷形状计算（见正文）。虚线曲线表示P（P）(R（右）)具有半径的刚性球体R（右）对应于观察到的R（右）_克: $[R=\sqrt{5/3}R_{\rm g}]$ .

4.2. 低温（288 K）下的结构变形

图6显示了散射强度（插图）和αA-和α288 K下的B-晶体蛋白聚集体。根据方程式（6）,R（右）_克的αA-和α288 K下的B-晶体蛋白聚集体分别为48.0±0.2和51.6±0.2℃。此结果表明αA晶体蛋白聚集体改变其大小，而αB-晶体蛋白聚集体将其从310 K冷却至288 K。

图6
Guinier图和SANS剖面图（插图）(一)αA-晶体蛋白和(b条)α288 K下的B-晶体蛋白聚集体。直线显示了最小二乘法拟合方程（6）的结果

The structural change of the aggregate ofα在距离分布函数中可以更清楚地显示冷却过程中的A晶体蛋白P（P）(R（右）).图7显示P（P）(R（右）)的αA-和α288和310 K温度下的B-晶体蛋白聚集体。P（P）(R（右）)的α288 K下的A晶体蛋白聚集体显示出与其他聚集体显著不同的轮廓：峰值位置从60℃移动到54℃。从减少R（右）_克以及P（P）(R（右）)可以说αA晶体蛋白比αB-冷却结晶（310 K $[\向右长箭头]$ 288 K）。

图7
距离分布函数P（P）(R（右）)用方程式（7）计算

。实心圆和空心圆表示的数据αA-和α288 K和+下的B-晶体蛋白和×表示αA-和αB-晶体蛋白分别在310 K下。

氨基酸序列的一致性在αA-和αB-晶体蛋白。因此，在生物活性条件下（310K）αA-和αB-晶体蛋白聚集体几乎相同，如图3所示和4问题很自然：为什么α-晶体蛋白需要两种类型的可比较亚基才能形成生物活性聚集体？一个可能的答案是α-crystallin使用两种对紫外线辐射和低温等外部诱导损伤具有不同敏感性的多肽来抵抗这些外部应力。事实上，廖等。(2002 )表明在αA-和αB-晶体蛋白通过测量其伴侣活性对抗紫外线和热诱导损伤：他们指出αA-晶体蛋白是一种更好的抗紫外线辐射伴侣αB-结晶蛋白和α晶体蛋白通常是一种更好的伴侣蛋白α生理温度下的A-晶体蛋白。最近的超速离心实验报告称αA晶体蛋白的质量变化比α低温下的B-crystallin（Fujii，2006，私人通信）。关于α图7所示低温下的A-晶体蛋白聚集体，本研究也支持了超离心分析的结果。在这里，很重要的一点是要揭示αA-和α从结构角度来看，B-晶体抗紫外线照射。因此，SANS对两种多肽的紫外线照射聚集体的研究目前正在进行中。

鸣谢

这项工作得到了创造性科学研究拨款（MS编号16GS0417）的部分支持。DLS实验也得到了教育、文化、体育、科学和技术部（MA）的拨款援助（编号17350060）的支持。

工具书类

Brown，W.（1996）。激光散射、原理和发展纽约：克拉伦登出版社。
Cherian-Shaw，M.、Smith，J.B.、Jiang，X.Y.和Abraham，E.C.（1999）。分子细胞生物化学。 199, 163–167.科学网交叉参考公共医学中国科学院
 Emmons，T.和Takemoto，L.（1992年）。Exp.眼科研究。 55, 551–554.交叉参考公共医学中国科学院科学网
 Fujii，N.、Ishibashi，Y.、Satoh，K.、Fujino，M.和Harada，K.（1994年）。生物芯片。生物物理学。学报,1204, 157–163.交叉参考中国科学院公共医学科学网
 Fujii，N.、Satoh，K.、Harada，K.和Ishibashi，Y.（1994年）。生物化学杂志。 116, 663–669.中国科学院公共医学科学网
 Liao，J.-H.，Lee，J.-S.和Chiou，S.-H.（2002）。生物化学。生物物理学。Res.Commun公司。 295, 854–861.科学网交叉参考公共医学中国科学院
 Miesbauer，L.R.、Zhou，X.、Yang，Z.、Sun，Y.、Smith，D.L.和Smith的J.B.（1994）。生物学杂志。化学。 269, 12494–12502.中国科学院公共医学科学网
 Provencher，S.W.、Hendrix，J.、De Mayer，L.和Paulussen，N.（1978年）。化学杂志。物理学。 69, 4273–4276.交叉参考中国科学院科学网
 Swamy，M.S.、Tsai，C.、Abraham，A.和Abrahman，E.C.（1993年）。Exp.眼科研究。 56, 177–185.交叉参考中国科学院公共医学科学网
 Takemoto，L.J.（1995）。货币。眼科研究。 14, 837–841.交叉参考中国科学院公共医学科学网
 Takemoto，L.J.（1996年一).Exp.眼科研究。 62, 499–504.交叉参考中国科学院公共医学科学网
 Takemoto，L.J.（1996）b条).生物化学。生物物理学。Res.Commun公司。 223, 216–220.交叉参考中国科学院公共医学科学网
 Takemoto，L.J.、Horwitz，J.和Emmons，T.（1992年）。货币。眼科研究。 11, 651–655.公共医学中国科学院科学网
 Voorter，C.E.，de Haard-Hoekman，W.A.，van den Oetelaar，P.J.，Bloemendal，H.&de Jong，W.W.（1988）。生物学杂志。化学。 263, 19020–19023.中国科学院公共医学科学网