3.1. CD27结构
这个晶体结构CD27–Fab 2177复合物的分辨率为1.8Å。除了CD27的C末端的His标签和Fab重链外,其他地方的电子密度都很好。电子密度表明存在一个N-糖基化位点,位于Asn75,其中N个-模型中包含乙酰氨基葡萄糖部分。与Fab 2177和Fab 2191(PDB入口)三元配合物中的CD27结构进行比较5磅; 奥莫洛娃等。, 2017
),未观察到显著差异。75普通C的r.m.s.dα两种结构中的原子为0.86Ω。
CD27具有由富含半胱氨酸的结构域(CRD)组成的细长的阶梯状结构,每个结构域的长度约为40个残基。残留物1-43形成CRD1,残留物44-85形成CRD2,残渣86-101形成CRD3(全文使用成熟形式的编号)。虽然CRD1和CRD2各含有三个二硫化物,但第三个CRD是不完整的,只含有两个二硫化物:86–100和92–97。(条目CD27_HUMAN的UniProtKB注释错误地将二硫化物分配为86–97和92–100。)
CRD1和CRD2的整体褶皱和二硫模式是TNFR超家族(Banner)的典型特征等。, 1993
; 奈史密斯和斯普朗,1998年
). 每个CRD由三个内部二硫化物按照AABCBC模式交联。CD27在TNFR1(PDB条目)结构上的叠加1分机; 奈史密斯等。, 1996
)74个普通C的r.m.s.d.为1.0ºα前两个CRD的原子。虽然这两个结构的核心得到了很好的保存,但回路的U形圈偏离了3-4º,特别是在CD27中出现TNFR1缺失的地方(图1
一). N末端的不同构象可能是由于当前结构中的Fab结合所致。
| 图1 CD27的结构。(一)来自本结构的CD27在TNFR1结构上的叠加(PDB条目1分机). CRD以不同的颜色显示,TNFR1以灰色显示。Asn75(品红)处的二硫化物(绿色)和N-糖基化显示为棒状物。(b条)CD27 ECD与假定的CD70表位(残留物57–68)显示为木棍。Arg58突变导致免疫缺陷。 |
与TNFR1相比,CD27中的CRD3距离CRD2更近(图1
一). CD27和TNFR1的第三个CRD的叠加需要36°的旋转。在比较TNFR超家族不同成员的结构或相同结构的独立副本(奈史密斯等。, 1996
). 观察到配体结合的最大差异为49°对RANK的非绑定形式(刘等。, 2010
). 保守的CX(X)CRD2和CRD3结合处的C基序被认为是使CRD定位在配体结合区域的铰链(Mongkolsapaya等。, 1999
). CD27中相应的残基为Cys84-Ala85-Cys86。
基于与TNFR超家族成员的结构相似性,有可能在CD27结构中确定一个假定的配体结合位点。CD27在CD40与CD40L复合物结构上的叠加(PDB入口第3季度6; 安等。, 2011
)表示CD70表位可能包括CRD2的残留物57–68(图1
b条). 重要的是,这是人类和小鼠CD27之间100%保守的区域,而残基1-101内的序列一致性为79%,ECD中的整体一致性仅为62%。这与人类CD70可以结合小鼠CD27和反之亦然(泰塞拉等。, 1997
).
CD27在两个方面与超家族的其他成员不同。ECD的二硫交联N末端部分(残基1–101)是家族成员中最短的。以下70种残留物可以在没有二硫化物的情况下折叠,或者更有可能不会形成任何三级结构。CD27的另一个区别是在165位存在游离半胱氨酸,即跨膜结构域之前的六个残基。静止T细胞将CD27表达为二硫键同源二聚体(Camerini等。, 1991
)有人认为是Cys165形成了交联。如果是这样,ECD的冗长的非结构化部分可能为分子提供必要的灵活性,以便两条链中的每一条都能结合配体。此外,CD27二聚体的两条链都可以与相同的CD70三聚体结合,为另一条CD27链只留下一个空位。这种情况与sCD70在没有额外交联(Wyzgol)的情况下无法触发CD27相关信号通路的事实相符等。, 2009
).
ECD的膜近端部分包含两个富含脯氨酸的基序PX(X)P(P)X(X)P(P)X(X)其中一个紧跟在CRD3之后,跨越残基102–107(PLPNPS),另一个跨越残基118–123(PHPQPT)。富含脯氨酸的基序在细胞的许多方面介导分子间的相互作用免疫应答,包括抗原识别、细胞-细胞通信和信号传递(Freund等。, 2008
). 许多参与淋巴细胞活化的适配蛋白具有特定的蛋白质结构域,如SH3和WW结构域,可选择性识别伴侣体内富含脯氨酸的区域(Macias等。, 2002
). 这种相互作用通常涉及疏水残基,并介导低亲和力的短暂蛋白质-蛋白质相互作用。可以假设CD27也可能有一些伴侣参与调节其共刺激信号,富含脯氨酸的基序代表其结合表位。
A number of mutations in theCD27型已确定导致CD27–CD70相互作用中断并损害免疫力的基因(van Montfrans等。, 2012
; 阿尔卡多尔等。, 2015
). 其中四个,C33Y、R58W、C76Y和R87C(成熟CD27的编号),映射到ECD。取代或引入半胱氨酸残基的突变明显损害了结构的完整性,而结构的完整依赖于正确的二硫键交联。结果是错误折叠的非活性蛋白质。在这方面,R58W突变似乎是中性的,因为它不涉及二硫化物。这种残留物不太可能发挥主要的结构性作用。它位于由二硫化物Cys45–Cys61环化的CRD2的第一环中,不与该CRD或另一CRD的其他结构元件接触。由于Arg58完全暴露,因此用Trp替代它应该不会有问题。对这种突变的病理效应唯一合理的解释是,它破坏了与CD70的相互作用。事实上,Arg58正好位于假定的CD70结合位点区域,本质上支持表位假设(图1
b条).
3.2. CD27–Fab 2177综合体
这个晶体结构CD27–Fab 2177复合物的结合模式揭示了抗体的结合模式(图2
一). Fab 2177在细胞表面远端的分子顶部结合CD27。埋在抗体-抗原界面中的溶剂可及表面积约为700Å2在每个分子上。形状完整性指数为0.80。单克隆抗体表位在CD27上是构象的,包括来自蛋白质链(表位定义为抗体残留物4º内的抗原残留物)。位于表位是His36和Arg37,与抗体的两个酪氨酸残基叠加:轻链的Tyr31(L)和重链的Tryr102(H)(图2
b条). 除这些相互作用外,His36和Arg37还与CDR H3的Asp104(H)和CDR L3的Asn96(L)形成氢键。两个赖氨酸残基位于表位,Lys5和Lys17与Asp34(L)、Asp55(H)和Asp57(H)形成盐桥,并通过其脂肪链与Tyr105(H)、Tyr52(H)进行堆叠相互作用(图2
b条).
| 图2 CD27和复合体中Fab之间的相互作用。(一)结构的带状表示,CD27为黄色,Fab重链为蓝色,Fab轻链为青色。(b条)装箱区域的特写视图。侧链用棒子表示,氢键用虚线表示。 |
轻链共有五个残基和重链共有九个残基与CD27直接接触。所有六个CDR都参与抗原识别,这有点令人惊讶,因为副镜面积相对较小。这可能是由于界面的形状造成的,长CDR L1在界面上形成了包含CD27凸面的单克隆抗体的凹形抗原结合表面(图2
一). 与CD27与两种非配对抗体(PDB入口)三元复合物中相同Fab的结构进行比较5磅; 奥莫洛娃等。, 2017
),未观察到显著差异。231 C的r.m.s.dα可变畴的原子为0.39º。CDR构象更为保守,62℃时的r.m.s.d.为0.28ºα对于所有486个非H原子为0.36Å。
这个表位mAb 2177与CD70的假定结合位点距离较远,表明这两种分子可能同时结合CD27。事实上,mAb 2177并不阻断配体可溶性形式sCD70(Obmolova等。, 2017
). 然而,它确实中和了细胞结合形式的CD70,这很可能是由于其位于受体链顶部而受到空间位阻干扰。Fab与受体轴内联的方向在结构上具有特征的抗肿瘤坏死因子受体超家族抗体中是独特的。通常,它们结合在受体分子一侧的CRD1和CRD2(Fellouse等。, 2005
; 锂等。, 2006
; 亚当斯等。, 2008
; 乔道奇等。, 2012
; 坟墓等。, 2014
; 塔马达等。, 2015
; 亚姆纽克等。, 2016
). 的位置表位在顶部边缘为抗体提供了更容易的通路,这可能是有益的,特别是在肿瘤微环境中。因此,mAb 2177可能被视为CD70存在下的潜在交联剂。
TNFR超家族成员通常通过配体诱导的三聚化或更高阶激活齐聚,导致细胞内信号传递过程的启动(Wajant,2015
). 另一方面,即使在没有配体或其他交联剂(如二级抗体或Fc)的情况下,其中一些抗体也可以被二价单克隆抗体激活γ受体。单克隆抗体激动剂的一种解释假设受体内存在前配体组装域(PLAD),在没有配体的情况下调节聚集(Chan等。, 2000
). CD27中未观察到PLAD;然而,该受体以非典型的二硫键二聚体的形式存在,因此似乎倾向于高阶聚集。尽管如此,所有报道的抗CD27单克隆抗体,包括单克隆抗体2177,本身都是非激动性的(Wajant,2016
)这表明CD27四聚体不足以激活,可能更多的受体链应该聚集在一起以引发信号传导。是否表位位置在受体激活中起任何作用尚待观察。