1.简介
Kallistatin是丝氨酸蛋白酶抑制剂（serpin）超家族的一员，特异性抑制人体组织激肽释放酶（Zhou等。, 1992
). Serpins被折叠成亚稳态构象，带有表面暴露的反应中心环（Huber&Carrell，1989）; Gettins，2002年; 欧文等。2000年). 一旦反应环被靶蛋白酶识别并切割，serpin就会发生显著的构象变化，其中反应环被结合到中心的中间β-带有共价连接蛋白酶移位和失活的薄板（亨廷顿等。2000年). 这种从亚稳态到超稳态的独特构象变化，通常称为应力-松弛（S-到R）构象转变，伴随着用于抑制蛋白酶的巨大自由能变化（Huber&Carrell，1989; Gettins，2002年).
卡利司他丁是一种结合肝素的蛇毒蛋白，包括抗凝血酶、蛋白C抑制剂、纤溶酶原激活物抑制剂1、肝素辅因子II和蛋白酶连接蛋白I（Chen等。, 2001; Gettins，2002年; 雷恩等。, 2011; 帕特斯顿等。, 2004). 肝素增强蛇蛋白抑制活性的能力已经得到了很好的研究（Gettins，2002）; 锂等。, 2004; Johnson&Huntington，2003年; 金等。, 1997; 杰缅季耶夫等。, 2004). 例如，肝素与抗凝血酶的结合使其对凝血酶或活化因子X的抑制作用增加了近1000倍。这要么通过模板机制，要么通过肝素与抗凝血酶螺旋D结合的变构机制（Li等。, 2004; 金等。, 1997). 同样，肝素也可以通过与蛋白C抑制剂的螺旋H结合来加速对活化蛋白C的抑制（Huntington&Li，2009). 出乎意料的是，有报道称，肝素阻断了kallistatin和组织激肽释放酶之间的相互作用。肝素结合位点被提议围绕螺旋H和链2β-卡利司他丁C片（陈等。, 2001). 由于这种独特的肝素介导的对kallistatin的抑制作用尚不清楚，而且kallistatin的结构也不清楚，我们已经制备并结晶了人kalli‐statin，作为阐明肝素介介调控机制的第一步。
2.材料和方法
2.1. 高分子生产
kallistatin IMAGE cDNA克隆购自Geneservices，并使用含有BamHI和HindIII位点的基因特异性引物通过PCR扩增氨基酸48-397的编码序列（表1). 随后将该片段克隆到pSumoO3表达载体中。重组序列经DNA测序验证。
| 源生物 | 智人 | | DNA来源 | GenBank L19684.1 | | 正向底漆 | 5′-GTTTGGATCC公司AGCCTCAGAGACTCTG-3′ | | 反向底漆 | 5′-中国民航协会AAGCTT公司ATGGTTTTCGTGGGTCGAC-3′ | | 克隆载体 | 相扑3 | | 表达式向量 | 相扑3 | | 表达式宿主 | 大肠杆菌BL21（DE3） | | 所产生结构的完整氨基酸序列 | SLKIAPANADFAFRFYYLIASETPGKNIFFS PLSISAAYAMLSLGACSHSQILEGLGFNLTLNLPGHGLETRVGSALFLSHNLKFLAKFLNDTMAVYEKLFHTNFYDTVGTIQLINDHVKKETRGKIVDLVSELKKDVLVNYYFKALWEKPFISSRTPKDFYVDENTTVRVMLQDQEHYLHDRYLPCSVLRMDYKGDATVFFILPNQKMREIEEVLTPLNLLRKRNFYKKFLLHLPKFSISGSYVLDQILPRLGFTDLFSWADL SGITKQQKLEASKSFHKATLDEVEAGTEAAAATSFAIKFFSAQTNRHI公司LRFNRPFLVVIFSTSTQSVLFLGKVVDPTK系列 | | |
该结构体在kallistatin的N末端包含一个His-tagged Sumo3。将表达质粒转化为大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞。使用单个菌落接种60 ml LB培养基，在37°C下摇晃培养过夜。然后将培养细胞转移到6 l LB培养基中，并在37°C下摇晃培养4 h，然后将培养温度降至20°C，并用0.25 mM（M）异丙基β-天-1-硫代吡喃半乳糖苷20小时。诱导后，收集细菌，将其重新悬浮，并在150 ml缓冲液中进行超声破碎A类（20米M（M）Tris–HCl pH值7.5，0.5M（M）氯化钠，20米M（M）咪唑）。细菌细胞裂解液随后在20000离心克在4°C下保持30分钟，然后将上清液涂在HisTrap Ni-Sepharose柱上（5 ml）。使用100 ml缓冲液从柱中清洗未结合的细菌蛋白质A类。随后用20–200 m洗脱柱中的目标蛋白M（M）缓冲液中的咪唑梯度A类基于SDS–PAGE分析，将含有融合蛋白的组分合并，然后用SENP2蛋白酶消化，以从融合蛋白中去除Sumo3标签，并生成N端无非天然序列的重组kallistatin。将混合物透析并装入HiTrap SP离子交换柱。卡尔斯他丁用0–1洗脱M（M）10m内的NaCl梯度M（M）MES pH 6.2。在结晶试验之前，收集并浓缩含有卡尔斯他丁的峰。
2.2。结晶
使用Hampton Research的筛选试剂盒（Crystal Screen、Crystal Screen 2、Index HT、PEG/Ion、PEG/Ion 2、SaltRX、Natrix、MembFac和Crystal丝网Cryo），在22°C下通过坐滴蒸汽扩散法在MRC2板中筛选结晶的初始条件。晶体最初从200 nl蛋白质溶液（10 mg ml）的混合物中生长−110米M（M）MES pH 6.2，0.15M（M）NaCl）和200 nl沉淀剂溶液与80µl储层溶液进行平衡。随后使用24孔坐滴板进行优化，晶体在两周内生长到0.2×0.2×0.5 mm的尺寸。结晶总结见表2.
| 方法 | 坐滴式蒸汽扩散 | | 板材类型 | MRC2板，96孔 | | 温度（K） | 295 | | 蛋白质浓度（mg ml−1) | 10 | | 蛋白质溶液的缓冲液成分 | 10米M（M）MES pH 6.2，0.15M（M）氯化钠 | | 储层溶液的组成 | 35%第三种-丁醇 | | 跌落体积和比率 | 0.4微升；0.2:0.2 | | 储液罐容积（µl） | 80 | | |
3.结果和讨论
为了了解kallistatin调节蛋白酶活性的分子机制，我们使用大肠杆菌表达系统。在Ni-Sepharose亲和柱纯化后，用SENP2蛋白酶裂解融合标签，并在阳离子交换柱上进一步纯化kallistatin。如图1所示，Sumo3标签在组分9和10中洗脱，kallistatin洗脱为两个峰（I和II）。将两个峰的蛋白质合并并筛选结晶。两周后，使用30%的蛋白质从峰II中获得棒状晶体第三种-丁醇作为沉淀剂（图2). 这些晶体很容易衍射到2º以上的分辨率，被发现属于空间组 P（P）61，带有单位-细胞参数一= 113.51,b条= 113.51,c（c）= 76.17 Å. 衍射数据统计如表3所示.
| 衍射光源 | BL17U，不锈钢 | | 波长（Ω） | 1.196 | | 温度（K） | 100 | | 探测器 | ADSC Q315 | | 晶体到探测器的距离（mm） | 250 | | 每张图像的旋转范围（°） | 1 | | 总旋转范围（°） | 60 | | 每张图像的曝光时间（s） | 0.5 | | “空间”组 | P（P）61 | | 一,b条,c（c）(Å) | 113.51, 113.51, 76.17 | | α,β,γ(°) | 90.00, 90.00, 120.00 | | 镶嵌度（°） | 0.45 | | 分辨率范围（Ω） | 35.7–1.9 (2.0–1.9) | | 反射总数 | 185915 (26532) | | 独特反射次数 | 44414 (6433) | | 完整性（%） | 99.9 (99.7) | | 多重性 | 4.2 (4.1) | | 〈我/σ(我)〉 | 14（2.5） | | R（右）合并 | 0.043（0.326） | | R（右）测量 | 0.049 (0.374) | | 总体B类Wilson图中的因子（λ2) | 30.1 | | |
![[图1]](hc5193fig1thm.gif)
| 图1
离子交换色谱法纯化重组kallistatin。用SENP2和混合物（lane）裂解Sumo3-kallistatin融合蛋白S公司)已加载到HiTrap SP列中。用NaCl梯度从0到1洗脱蛋白质M（M），测量280 nm波长的吸光度(一). 通过SDS-PAGE分析流出（FT）和洗脱馏分(b条). 将峰I（13和14）和峰II（15-17）的馏分分别合并，并进行结晶试验。车道M（M）包含分子量标记（以kDa标记）。 |
![[图2]](hc5193fig2thm.gif)
| 图2
30%的人kallistatin晶体生长第三种-丁醇属于空间组 P（P）61，带有单位-细胞参数一= 113.51,b条= 113.51,c（c） = 76.17 Å. |
分子替换使用执行相位器（麦考伊等。, 2007). 众所周知，蛇蛋白采用不同的构象，蛋白C抑制剂的模型（亨廷顿等。, 2003; 锂等。, 2007)和甲状腺素结合球蛋白（Zhou等。, 2006)，代表一个松弛的和两个应力的蛇蛋白构象（～47%序列一致性；PDB条目1升8,2ce0码和2小时9)，被选为搜索模型。使用PDB条目搜索得到了一个明确的单一解决方案1升8作为在非对称单元，表明溶剂含量为~60%。作为PDB条目1升8对应于蛋白C抑制剂的松弛构象，其反应环被裂解并插入中心β-板材（亨廷顿等。, 2003)这表明结晶的kallistatin也处于松弛构象。根据以下公式计算的电子密度图相位器证实kallistatin的反应环被整合到中枢β-板A作为中间股（图3). 因此，在表达或随后的纯化和结晶步骤中，kallistatin可能经历了构象变化以形成松弛构象。初步精炼具有REFMAC公司（穆尔舒多夫等。, 2011)使用中的模型相位器给出了一个R（右）工作33%和R（右）自由的37%。进一步精炼解理位点的详细表征正在进行中。
致谢
这项工作得到了国家自然科学基金31170724和31370727的资助。我们感谢上海SSRF BL17U的工作人员在数据收集方面的帮助。
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