Expression, purification, crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of the novel modular DNA-binding protein BurrH in its apo form and in complex with its target DNA

Stella, S.; Molina, R.; Bertonatti, C.; Juillerrat, A.; Montoya, G.

doi:10.1107/S2053230X13033037

结晶通信

结构生物学
通信

国际标准编号：2053-230X

第70卷| 第1部分| 2014年1月| 第87-91页

doi:10.1107/S2053230X13033037

表达、纯化、结晶和初步X射线衍射分析新型模块化DNA结合蛋白BurrH的载脂蛋白形式及其与靶DNA的复合物

斯特凡诺·斯特拉,^一 ‡ 拉斐尔·莫利纳,^一 ‡ 克劳迪娅·贝尔托纳蒂,^b条亚历山大·朱利勒拉特 ^b条和吉列尔莫·蒙托亚 ^一 ^*

^一大分子晶体学小组，结构生物学和生物计算计划，西班牙国家癌症研究中心（CNIO），Calle de Melchor Fernández Almagro 3，28029 Madrid，Spain和^b条Cellectis，8 Rue de la Croix Jarry，75013巴黎，法国
^*通信电子邮件：gmontoya@cnio.es

(收到日期：2013年10月15日； 2013年12月5日接受； 2013年12月24日在线)

不同的基因组编辑策略推动了新的DNA靶向分子工具的开发，从而实现了精确的基因修饰。这里，表达、纯化、结晶和初步X射线衍射BurrH，一种新的DNA结合蛋白根霉伯克霍尔德菌，据报道。BurrH的apo形式及其与靶DNA的复合物的结晶实验产生了适合X射线的晶体衍射分析。apo型晶体属于原始六边形空间组 P（P）三₁或其对映体 P（P）三₂，带有单位-细胞参数一=b条= 73.28,c（c）= 268.02 Å,α = β=90，γ= 120°. BurrH–DNA复合物在单斜晶系中结晶空间组 P（P）2₁，带有单位-细胞参数一=70.15，b条= 95.83,c（c）= 76.41 Å,α = γ = 90,β= 109.51°. 自转函数和马修斯系数表明不对称单元载脂蛋白晶体和单斜晶体中的一种蛋白质-DNA复合物。使用同步辐射，晶体衍射到分辨率极限分别为2.21和2.65欧。

关键词：基因靶向;蛋白质-DNA相互作用;伯尔H;根霉伯克霍尔德菌.

1.简介

由于基因组测序技术的进步，以及通过增加、删除或交换基因组中的DNA序列来修改细胞功能的能力，生物技术和医学中新的令人兴奋的可能性正在出现（Perez-Pinera等。, 2012 ). 模块化转录激活物样效应器（TALE；Boch）等工具等。, 2009 ; Bogdanove&Voytas，2011年 ; 莫斯科和博格达诺夫，2009年 )已证明其在生成特定DNA结合蛋白方面的多功能性。设计新特性及其模块化组装的容易程度促进了这些工具的广泛使用，特别是在合成生物学领域。尽管有大量完全测序的细菌基因组可用，但TALE蛋白仅在两种植物病原体中鉴定出来：黄单胞菌属spp.和青枯菌新基因组数据的不断发布促使我们寻找新的模块化DNA结合蛋白。因此，我们寻找在其模块序列中包含差异的DNA结合蛋白。我们在根霉伯克霍尔德菌，一种共生细菌，生活在小孢子根霉，之前已经确定（Schornack等。, 2013 ; 以下简称BurrH；UniProtKB E5AV36_BURRH；基因ID 9979518；基因符号RBRH_01844）。BurrH表示模块化组织；然而，这些模块的序列显示出很少的保守残基。该蛋白包含19个重复序列，能够识别19 bp的DNA目标。在这里，我们报告了其表达、纯化、结晶和初步X射线衍射分析以载脂蛋白的形式和与DNA靶标的复合物表达这种新型模块结构域。

2.材料和方法

2.1. 蛋白质表达和纯化

大肠杆菌用含有BurrH基因编码的pET-24d（+）载体转化BL21（DE3）细胞。表达的多肽链是UniProt E5AV36序列，在C末端有六个组氨酸（81 kDa包括标签）。Luria–Bertani培养基中的蛋白表达测试显示，在310 K时BurrH表达水平较高M（M）异丙基β-D类-1-硫代半乳糖基吡喃糖苷（IPTG），培养2小时，离心收集细胞（9000克在277 K下保持20分钟）。为了制备硒代蛋氨酸取代蛋白，细胞生长在含40µg ml的全硒蛋氨酸培养基（分子尺寸）中⁻¹硒蛋氨酸在310 K下培养。当培养物在600 nm下达到0.8 OD时，用1 mM（M）IPTG 3小时。最后，如前所述，通过离心收集培养物。该颗粒采用闪速冷冻，储存温度为193K。

纯化前，将颗粒重悬在25 mM（M）HEPES–HCl pH值8.0，150 mM（M）氯化钠，0.05%Triton X-100，0.2 mM（M）在2×cOmplete无EDTA片剂（罗氏）存在下的TCEP。细胞通过超声波破碎，裂解液通过40000离心澄清克1小时后，蛋白质主要存在于可溶性部分。净化过程包括三个连续的步骤色谱法步骤。离心后，将上清液涂在在缓冲液中平衡的Ni–NTA琼脂糖柱（Qiagen）上一个（25米M（M）HEPES–HCl pH值8.0，150 mM（M）氯化钠，0.2米M（M）TCEP，1×cOmplete无EDTA片剂，罗氏）。用缓冲液洗涤Ni–NTA柱一个加上5米M（M）咪唑。采用10、25、50和100%缓冲液的阶梯梯度进行洗脱B类（缓冲器一个加1M（M）咪唑）。对应于25%和50%缓冲液的浓缩蛋白质组分B类汇集在一起，应用于与缓冲液平衡的5 ml HiTra肝素HP柱（GE Healthcare）上一个用0–100%缓冲液的线性梯度洗脱蛋白质H（H）（缓冲器一个加1M（M）NaCl），以十列体积计。收集并浓缩富含蛋白质的组分（使用30 kDa截止Centriprep Amicon Ultra设备），然后加载到在缓冲液中平衡的HiLoad 16/60 200 Superdex柱上（GE Healthcare）一个.蛋白质峰被浓缩（使用30 kDa截止Centriprep Amicon Ultra设备），在液氮中闪速冷冻并储存在193 K。蛋白质浓度是使用氨基酸组成计算得出的280 nm处的理论摩尔消光系数来确定的。用SimplyBlue（Invitrogen）染色的超载SDS–PAGE显示出非常纯的蛋白质制剂（图1一).

图1
BurrH的表达和纯化以及蛋白质-DNA复合物的形成。(一)SDS凝胶显示纯化的BurrH蛋白。左侧车道包含分子质量标记（标记单位为kDa）。(b条)SEC–商场色谱图。(c（c）)带移分析。在298 K温度下，将DNA靶与BurrH蛋白孵育1 h。在天然聚丙烯酰胺凝胶上分离混合物。箭头指示对应于游离DNA靶的带。

2.2. 尺寸隔离色谱-多角度激光散射

尺寸隔离色谱-多角度激光光散射（SEC–MALLS）实验在293K下进行，使用Superdex 200 10/300 GL柱（GE Healthcare）连接到DAWN HELEOS光散射检测器和Optilab rEX差分折射率检测器（Wyatt Technology）。柱在缓冲液中平衡一个0.03%(w个/v（v）)NaN公司_三用1 mg ml的BSA样品校准SEC–MALLS系统⁻¹在同一个缓冲区中。100µl BurrH样品（1mg ml）⁻¹在同一缓冲液中以0.5 ml min的流速注入⁻¹。使用阿斯特拉软件（Wyatt）。SEC–MALLS测量表明，该蛋白质是一种单体，实验分子质量为78.6 kDa（图1b条).

2.3. Apo-BurrH样品制备

天然蛋白质和硒代蛋氨酸取代的蛋白质（以下称为SeMet-BurrH）最初均浓缩至12 mg/ml⁻¹对20米进行透析M（M）MES pH 6.0，200 mM（M）氯化钠，5米M（M）277 K下的MgCl。结晶前，通过使用0.2µm截止过滤器（Millipore）过滤，形成并消除浅白色沉淀。蛋白质制剂的最终浓度在8至10 mg ml之间⁻¹过滤后。

2.4. BurrH–DNA复合物形成

BurrH DNA靶点是一个23 bp的钝性双链寡核苷酸（5′-TTAAGAGAGAAATACGTAA-3′）。使用之前为TALE（Boch）描述的RVD代码确定目标序列等。, 2009). 双链DNA从IDT（马德里综合DNA技术公司）购买，并在25m内重新悬浮M（M）HEPES–HCl pH值8.0，150 mM（M）氯化钠。该复合物是通过在5 m的浓度下混合BurrH蛋白和双链蛋白获得的M（M）氯化镁₂蛋白质与DNA摩尔比为1:1.3。将混合物在293 K下培养1 h。BurrH–DNA复合物溶液的最终浓度为8 mg ml⁻¹使用带移分析测试BurrH与寡核苷酸的结合（图1c（c）). 如前所述，将同一缓冲液中的蛋白质与DNA双链孵育并加载到天然聚丙烯酰胺凝胶上。

2.5. 结晶

蛋白质和蛋白质-DNA复合物制备完成后，立即用Cartesian MicroSys机器人（Genomic Solutions）在96孔MRC板上用坐滴法进行结晶筛选。纳米滴由0.2µl蛋白质溶液和0.2µl储液罐溶液组成，并与60µl储液罐体积进行平衡。用于apo-BurrH和BurrH–DNA复合物结晶的初始筛选为Crystal Screen和Crystal Screen 2、Crystal丝reen Cryo和CrystalScreen Lite（汉普顿研究）、JBScreen Classic 1、2、3、4、5、6、7和8（耶拿生物科学）、PACT和蛋白质复合物套件（齐亚根）。在PACT[0.2的条件76下获得apo-BurrH晶体M（M）硫氰酸钾，0.1M（M）双三丙烷pH值7.5，20%(w个/v（v）)PEG 3350]。优化了结晶条件，并在含0.2的储液中生长出最佳衍射晶体M（M）硫氰酸钾，0.1M（M）双三丙烷pH值7.5，20–26%(w个/v（v）)PEG 3350和0.02M（M）六水合氯化钴（II）或0.2M（M）碘化钠作为添加剂（汉普顿研究添加剂筛选条件8和20）。在数据收集之前，采集新鲜晶体并通过向储层溶液中加入28%的乙二醇进行冷冻保护。衍射实验在瑞士光源（SLS，Villigen）和ALBA（巴塞罗那）进行。

最初的晶体后来用吊坠法重现。通过混合1µl储液罐和样品溶液获得2µl液滴，并生成最大尺寸为0.2×0.2×0.025 mm的棒状晶体（图2一). 使用悬滴法获得最佳衍射晶体，并使用0.2M（M）硫氰酸钾，0.1M（M）双三丙烷pH值7.5，22%(w个/v（v）)0.2存在下的PEG 3350M（M）碘化钠。这些晶体在1天后出现，并生长5天。这些样品衍射到2.5º的分辨率（数据未显示）。使用与使载脂蛋白天然蛋白结晶相同的条件结晶载脂蛋白SeMet-BurrH。这些晶体（图2b条)衍射至2.21°分辨率（见表1).

表1
BurrH及其与DNA复合物载脂蛋白形式的数据收集统计

括号中的值表示最外层的分辨率外壳。

	载脂蛋白SeMet-BurrH	BurrH–DNA复合物
“空间”组	P（P）三₁/P（P）三₂	P（P）2₁
单位-细胞参数
一(Å)	73.28	70.15
b条(Å)	73.28	95.83
c（c）(Å)	268.02	76.41
α(°)	90	90
β(°)	90	109.51
γ(°)	120	90
数据收集
温度（K）	100	100
波长（Ω）	0.97974	1
光束线	XS06A，SLS	XS06A，SLS
分辨率（Ω）	46.08–2.21 (2.33–2.21)	47.92–2.65 (2.79–2.65)
总反射	277915（40222）	92439 (13676)
独特的反射	79217 (11699)	27134 (4019)
多重性	3.5 (3.4)	3.4 (3.4)
完整性（%）	98.7 (99.8)	97.7 (99.9)
平均值我/σ(我)	7.0 (2.4)	12.1（1.7）
R（右）_合并†	0.112 (0.42)	0.065 (0.61)

†R（右）_合并定义依据XDS公司（卡布施，2010年

).R（右）_合并= $[\textstyle\sum_｛hkl｝\sum_｛i｝| i_｛i｝（hkl）-\langle i（hkl）\rangle |/]$ $[\textstyle\sum_{hkl}\sum_{i} 我_{i} （香港）]$ .

图2
BurrH结晶。(一)apo形式的BurrH晶体(b条)以apo形式存在的硒代蛋氨酸取代的BurrH晶体(c（c）)天然BurrH晶体与其靶DNA复合。(d日)SDS–PAGE凝胶证实了BurrH–DNA复合物的结晶，并用SimpleBlue安全染色法染色以可视化蛋白质。(e（电子）)SDS-PAGE凝胶证实了用SYBR-Gold染色的BurrH-DNA复合物结晶，以可视化DNA。在这两种凝胶中，通道1、通道2和通道3分别含有BurrH蛋白、DNA靶点和溶解晶体。

对于BurrH–DNA的结晶，仅使用天然蛋白质来重建复合物。在蛋白质复合物套件（Qiagen）[0.2的条件32中检测到初始晶体M（M）氯化钠，0.1M（M）Tris pH 8.0，20%(w个/v（v）)聚乙二醇4000]。对这些晶体进行了优化，使用0.27获得了最佳衍射样品M（M）氯化钠，0.1M（M）Tris–HCl pH值8.2，26%(w个/v（v）)储层溶液中的PEG 4000（图2c（c）). 通过向储液中添加20%乙二醇对晶体进行冷冻保护。这些晶体在5–7天后出现，生长12–15天，衍射到2.65º分辨率（见表1). 为了确认晶体中同时存在蛋白质和DNA，将一些样品在储液中洗涤五到七次，并溶解在SDS负载染料中。使用结晶寡核苷酸和蛋白质作为对照，通过SDS-PAGE对该样品进行分析。之后电泳凝胶被简单蓝色安全染色（Invitrogen）染色以检测蛋白质（图2d日)并用SYBR-Gold（Invitrogen）检测DNA（图2e（电子）). 额外的SYBR-Gold染色带是由于双链DNA靶标在SDS存在下解离所致。

2.6. 数据收集

低温保护晶体在液氮中闪蒸冷却。在PX XS06光束线（SLS，Villigen）和XALOC（ALBA，巴塞罗那）上使用Pilatus 6M探测器收集衍射数据。apo晶体的最佳数据集是用Δφ=0.5°，硒吸收峰（0.97974°波长）。就蛋白质-DNA复合物而言，收集了良好的数据集Δφ=0.5°，1.0°波长。数据处理是使用完成的XDS公司（卡布施，2010年 )以及SCALA公司来自中央对手方清算所4包（Evans，2006 ; 优胜者等。, 2011 ). 表1总结了每种晶体类型的数据收集统计数据.

3.结果和讨论

SeMet-BurrH晶体的apo形式属于空间组 P（P）三₁或P（P）三₂，带有单位-细胞参数一=b条=73.28，c（c）= 268.02 Å,α = β = 90,γ= 120°. 这些对映空间群在此阶段无法区分。马修斯系数(五_M（M）= 2.31 Å^三 Da公司⁻¹; 马修斯，1968年 )和自转函数（Rossmann&Blow，1962 )表明每个不对称单元溶剂含量为52%（图3). 数据完成率为98.7%，多重性为3.5，总体平均值为我/σ(我)第7.0页（图4一). 表1总结了数据集的详细统计信息.

图3
apo-BurrH晶体的自转函数。SFCHECK（SF检查）（迷茫等。, 1999

)以及无意义（埃文斯，2006年

)用于检查数据，表明无平移Patterson峰孪生。我们使用以下公式计算了apo-BurrH晶体的自转函数MOLREP公司（Vagin和Teplyakov，2010年

). 检查赤平投影在χ=180°截面，且在χ= 120°,χ=90°和χ=60°截面。这些峰表明存在双重对称轴，这与马修斯系数数据和其他部分中没有实质性峰一起表明在不对称单元中存在二聚体。

图4
两种晶体类型的X射线衍射图。(一)硒代蛋氨酸取代的apo-BurrH(b条)天然BurrH与DNA复合物。箭头所示的插图分别以2.21和2.65º的分辨率显示反射。

BurrH晶体与其DNA靶的复合物属于空间组 P（P）2₁，带有单位-细胞参数一= 70.15,b条= 95.83,c（c） = 76.41 Å,β= 109.51°. 马修斯系数(五_M（M）= 2.42 Å^三 Da公司⁻¹)和自转功能（数据未显示）表明不对称单元溶剂含量为55%。除了由晶体对称性可以观察到。数据完成率为97.7%，多重数为3.4，总体平均数为我/σ(我)第12.1页（图4b条). 表1总结了数据集的详细统计信息.

这些是这种新型DNA结合蛋白的第一个晶体，它以载脂蛋白形式存在，并与其DNA靶点形成复合物。此外，初步SAD实验为解决相位问题。我们相信这些研究将有助于阐明这种新型DNA结合域识别DNA的分子机制。BurrH可能构成一个新的平台，用于设计具有新特异性的DNA结合蛋白，这可能会改善目前用于生物技术和治疗目的的工具。

脚注

‡这些作者贡献均等。

致谢

我们感谢瑞士光源和ALBA光束线工作人员的支持。这项工作得到了欧盟玛丽·居里“SMARTBREAKER”（2010-276953至SS）、教育部（SB2010-0105至SS）和经济竞争力部（JCI-2011-09308至RM，BFU2011-23815/BMC至GM）、拉蒙地区基金会和马德里自治委员会（CAM-S2010/BMD-2305至GM）的支持。

工具书类

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