1.简介

卟啉原脱氨酶（PBGD），也被称为羟甲基双烷合酶（EC 2.5.1.61），催化四吡咯生物合成途径的早期步骤，其中四个单吡咯卟啉原分子被缩合形成线性四吡咯、前尿卟啉原或羟甲基双胺（图1; 约旦，1991年).同位素标记单次翻转研究表明，吡咯形成环A类（图1)首先与酶结合，然后是环B类,C类最后D类PBGD是一种单体蛋白质，分子量在34–44 kDa之间，具体取决于物种（约旦，1991年)。该酶具有二吡咯甲烷辅因子（图2)它通过包含不变半胱氨酸残基的硫醚键与酶共价结合（Jordan&Warren，1987)。辅因子充当引物，在反应完成时辅因子和第一底物分子之间的连接断裂之前，四个卟啉原分子依次连接到该引物上。因此，当反应产物释放时，辅因子仍以共价方式附着在酶上。

图1 卟啉原脱氨酶催化的反应。吡咯卟啉原的四个分子缩合形成线性四吡咯前尿卟啉原（羟甲基双烷）。每个吡咯的乙酸和丙酸侧链分别缩写为A和P，四吡咯产品的四个环用斜体表示为A类,B类,C类和D类.

图2 卟啉原脱氨酶的二吡咯甲烷辅因子通过硫醚键与半胱氨酸残基共价连接到酶。四个底物吡咯线性添加到辅因子，最后，底物和辅因子之间的链接水解释放四吡咯产物羟甲基双烷。

X射线结构拟南芥酶最近被解决了（PDB入口4吨; 罗伯茨等人。, 2013); 在此之前，结构可用于大肠杆菌PBGD[PDB条目1磅/天（路易等人。, 1992, 1996),1千吨（Helliwell等人。, 2003),1小时5（哈德纳等人。, 1999),1分（Helliwell等人。, 1998)和2ypn型（聂等人。, 1999)]和人类酶（PDB条目3等式1和3当量当量; 腮等人。, 2009; 歌曲等人。, 2009)。多肽折叠成三个结构域（1-3），每个结构域的大小大致相同。结构域1和2的一般结构与许多周质结合蛋白极为相似。二吡咯甲烷辅因子附着在域3上的环上，位于域1和域2之间形成的深层活性位点裂口的口部。

革兰氏阳性菌巨大芽孢杆菌由于它在生物技术生产多种物质（包括四吡咯维生素B）中有许多商业应用，因此具有巨大的工业价值₁₂在这里，我们报告了PBGD的表达和结晶巨大双歧杆菌以一种将同步辐射衍射到非常高分辨率的形式。

2.表达和纯化

这个巨大双歧杆菌PBGD基因被克隆到Nde公司我和巴姆使用标准方法将表达载体pET14b的HI限制位点转化为Rosetta（DE3）大肠杆菌细胞（Novagen）。使用500 ml培养物进行表达，在310 K下培养过夜，然后用0.2 mM（M）异丙基β-D类-中对数期1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）。然后将培养物以5000转/分钟的速度离心⁻¹使用Beckman Coulter Avanti J-26 XP超离心机（使用JLA-8.1000转子）进行15分钟，以获得细胞颗粒。然后将从1升培养物中获得的3.75克颗粒重悬于25毫升50毫升中M（M）Tris–HCl缓冲液pH值为8，并使用MSI Soniprep 150仪器在冰上进行超声波处理。以12000转/分的转速离心细胞裂解液⁻¹使用贝克曼JA-25.50转子从上清液中分离细胞碎片。然后将清澈上清液加载到预先平衡的HisTrap HP（GE Healthcare）1 ml色谱柱上，使His-tagged PBGD在用结合缓冲液清洗色谱柱之前结合，以去除杂质。酶用含有500 m的缓冲液洗脱M（M）通过添加凝血酶（每毫克纯化蛋白一单位），然后在室温下过夜培养，去除咪唑和多组氨酸标签。然后通过使先前透析的蛋白质再次通过HisTrap HP 1ml柱，然后通过HiTrap Benzamidine FF 1ml柱（GE Healthcare），去除切割的标签和凝血酶。纯化后的最终产量巨大双歧杆菌PBGD大约为每升细胞培养物10-12毫克。奇怪的是，细胞和纯化的蛋白质有明显的粉红色，尽管经过几周的时间，蛋白质变黄了，可能是由于辅因子的缓慢氧化。

3.结晶

将纯化的天然PBGD浓缩至2.5 mg ml⁻¹使用Vivaspin离心浓缩器，并使用悬挂滴法和分子尺寸结构屏幕I和II对结晶条件进行筛选。大约两周后，在结构屏幕I条件15（0.1）下出现黄色晶体M（M）二甲氨基甲酸钠pH 6.5，0.2M（M）室温下的醋酸镁，20%PEG 8K）（图3)。随后的优化屏幕显示，晶体可以在0.1内重复获得M（M）二甲氨基甲酸钠pH 6.5–6.8，0.2M（M）乙酸镁，25–30%PEG 8K。去除His标签（如上所述）是获得这种酶晶体的必要条件。通过添加约40%的甘油对选定的晶体进行处理(v（v）/v（v）)安装在回路中并与牛津冷冻系统公司的低温冷却器进行闪蒸冷却之前。

图3 晶体巨大双歧杆菌通过悬挂法获得PBGD。它们明显的黄色可能是由二吡咯甲烷辅因子氧化引起的。此处显示的不规则晶体的最长尺寸约为0.3 mm，并被分成较小的碎片以进行数据收集。

4.初步X射线分析

使用钻石光源（英国迪德科特DLS）的I03站收集的X射线数据显示巨大双歧杆菌PBGD晶体具有很高的衍射质量（图4)。使用1°振荡，使用PILATUS 6M-F探测器从温度保持在100 K的单晶中收集190°数据，每个图像的曝光时间为1s（15%透射），晶体到探测器的距离为268.8 mm。入射光束的波长为0.976º。数据处理MOSFLM公司（莱斯利，2006年),SCALA公司（埃文斯，2006年)和中的其他程序中央对手方清算所4套（Winn等人。, 2011)发现这些晶体属于单斜晶系空间组 P（P）2₁2₁2₁，带有单位-细胞参数一= 53.3,b条= 65.8,c（c）= 97.2 Å. 检查相关系数根据Karplus&Diederichs（2012）的建议，针对半数据集强度)和Evans（2012年)，表明衍射数据的分辨率达到d日_最小值=1.46º，整体R（右）_合并6.1%和R（右）_测量6.7%（详见表1)。采用马修斯（1968）的方法)由Kantardjieff&Rupp（2003）实施)据估计，每个晶体中都含有单个PBGD单体非对称单元溶剂含量为53%。利用分子置换程序进行结构分析MOLREP公司（Vagin和Teplyakov，2010年)带有大肠杆菌PBGD（47%身份；PDB入口1磅/天; 路易等人。, 1992)因为搜索模型是成功的精炼的巨大双歧杆菌PBGD结构目前正在使用此高分辨率数据集进行。

表1 的数据收集和处理统计信息巨大双歧杆菌PBGD公司 括号中的值用于外部分辨率外壳。 光束线 I03、DLS 波长（Ω） 0.976 “空间”组 P（P）212121 单位-细胞参数  一(Å) 53.3  b条(Å) 65.8  c（c）(Å) 97.2 马赛克蔓延（°） 0.26 分辨率（Ω） 48.60–1.46 (1.53–1.46) R（右）合并†(%) 6.1 (55.9) R（右）测量‡(%) 6.7 (61.3) 完整性（%） 100.0 (100.0) 平均我/σ(我) 14.4 (3.0) 多重性 6.2（6.0） 观察到的反射次数 378329 (52575) 独特反射次数 60772 (8748) 威尔逊曲线图B类系数（Ω2) 15.8 溶剂含量（%） 53 每个不对称单元的分子数 1 †R（右）合并=. ‡R（右）测量=N个(小时k个我)-1]}1/2，其中〈我(香港特别行政区)〉是N个(香港特别行政区)观察我我(香港特别行政区)每个独特的反射香港特别行政区缩放后。

图4 的衍射图像巨大双歧杆菌使用PILATUS 6M-F探测器在DLS光束线I03上获得的PBGD。从该晶体获得的衍射数据经过处理，分辨率为1.46º。