1.简介

用于从生物大分子中生成三维原子级结构信息的主要技术，即X射线晶体学，需要为衍射分析。晶体的生产是费力的，更令人沮丧的是，高度随机性（纽曼等。, 2012). 每年进行数百万次结晶试验，目前检测晶体生长的最佳方法是人工检测；目前，自动图像分析的启动过于复杂。使用人眼识别蛋白质晶体的假阴性率达到20%（Cumbaa&Jurisica，2010）)，总体成功率不到1%（纽曼等。, 2012)这样的假阴性率令人无法忍受。假阴性可能是由于蛋白质分子在晶格（马修斯，1968年)，它包含大的溶剂通道。溶剂通道可以产生具有折射率接近它们生长的母液，使它们在可见光下不可见。假阳性，即结晶试验中的物体被解释为蛋白质晶体，尽管不是这样，但问题较少，但许多晶体学家在这种假线索之后浪费了大量资源。

紫外线照明声称可以降低假阳性和假阴性的发生率。这是一种鉴定蛋白质晶体的较新技术；这是基于这样一种假设，即当晶体形成时，局部蛋白质浓度最大，因此晶体将比周围的溶液“发光”更亮。该技术需要专用硬件和耗材（Dierks等。, 2010; 吉尔，2010)例如配备紫外线的显微镜、低紫外线吸收板和密封件。商业紫外线成像通常使用295nm的紫外线；因此，所得到的UV图像仅由蛋白质的固有色氨酸荧光产生。色氨酸吸收波长为290±5 nm的光，溶剂变色荧光发射为320–350 nm（Permyakov，2012）). 用于识别结晶过程中积极结果的其他技术包括基于染料的荧光系统（Pusey，2011）)手性晶体的二阶非线性成像（SONICC；Kissick等。, 2011).

所有带有芳香侧链的氨基酸都能吸收紫外线；然而，只有色氨酸显示足够高量子效率在290nm处用作荧光探针。同样，二硫键能够吸收紫外光，但在260nm处吸收，然后只能微弱吸收（Schmid，2001). 色氨酸平均占蛋白质残留物的1.09%（Gilis等。, 2001)理论上，该水平足以提供UV成像所需的固有荧光。基于这些概念，在可见光检查下而不是在紫外线照射下观察到的晶体很可能是盐晶体，即使可见光图像照明不良或焦点不集中，或者存在沉淀蛋白的混淆背景，也可以在紫外线图像中区分晶体。研究表明，pH值的变化通常会影响荧光；然而，据报道，色氨酸荧光对pH不敏感（Chen，1973). 不幸的是，有许多已知的物理现象会影响蛋白质的荧光或产生误导性的结果：实验设置可能不合适，蛋白质沉淀物可能发光太亮而无法区分晶体，许多晶体化学物质将吸收发射的光，一些盐具有荧光活性[报春红黄（钠盐）、吖啶黄（盐酸盐）和荧光素黄（锂盐）仅举三个]。

在合作结晶中心（C3；http://www.csiro.au/c3)，我们最近在自动白光（可见）成像中增加了紫外线成像。我们的成像方案包括大约10周内进行的15次可见光检查，并在前四周进行更多检查。第一周后、一个月后和检查期结束时，将进行紫外线检查。在这里，我们展示了我们从数百个受到紫外线照射的样品中观察到的一些结果，特别关注标准结晶测试蛋白质的结果。

2.材料和方法

初始测试涉及从Sigma–Aldrich购买的11种测试蛋白质（见表1用于配制结晶蛋白质的浓度和缓冲液的总结）。这些蛋白质在标准稀疏矩阵屏幕（结构基因组联合中心屏幕，JCSG+，C3内部制造）中设置，并使用紫外线和可见光成像。对所有蛋白质的紫外成像结果进行了比较，重点是可能干扰紫外成像的结晶条件。通过观察在更广泛的768条件屏幕中设置的四个样本，进一步探讨了这一点。此外，由于蛋白质测试集包括三个含有血红素基团的蛋白质，我们有兴趣确定含铁基团对结果图像的影响。作为比较，将血红素（Sigma H3505）溶解在2 mg ml⁻¹在二甲基亚砜（DMSO）中，并与含血红素的蛋白质进行比较。

2.3. 蛋白质-DNA复合物

为了探讨DNA对蛋白质荧光的影响，我们比较了50 mg ml溶菌酶⁻¹50米M（M）Tris pH值8，50 mM（M）相同配方的NaCl补充等摩尔DNA。所用DNA为序列为5′-GCTCTGACAACATGTGCG-3′（分子量6421 Da）的寡核苷酸。溶菌酶和溶菌酶–DNA样本均按照上述方式设置在JCSG+_C3屏幕上。通过溶菌酶和溶菌酶DNA样本中的液滴随机选择10个像素，并使用图像处理程序(GIMP公司)软件包（v.2.8.2）来确定像素的强度。对每个样品的强度值进行平均，并比较两个样品的平均值（图1和2). 如果液滴的图像不均匀（例如，如果液滴中含有块状沉淀物，在生成的UV图像中呈现出明显的明暗模式），则此方法将失效，因此，仅选择具有合理平滑UV图像的液滴进行此分析。我们意识到，这里描述的系统不是真正的DNA-蛋白质复合物，而是包含与DNA复合的DNA结合蛋白相同的成分（核酸和蛋白质）。

图1 蛋白质和蛋白质-DNA混合物的荧光比较。滴液A1–A12（溶菌酶单独，第1行；溶菌酶和DNA，第2行）和滴液B1–B12（溶酶酶单独，第一行；溶酶酶和脱氧核糖核酸，第4行）的UV图像；C–H行未显示。

图2 蛋白质和蛋白质的荧光强度–DNA混合物，其中0为黑色，255为白色（从液滴中随机选择十个像素的平均值），超过80种JCSG+均质条件。由于滴内亮度不均匀，未测量缺失值，例如图1中可见的B11平均值为58.76，标准偏差为14.77。

3.结果和讨论

为了说明与蛋白质晶体鉴定的紫外线成像相关的警告，我们首先观察了稀疏矩阵JCSG+屏幕中11个控制蛋白质的行为。随后，我们将分析扩展到C3屏幕（768个独特的结晶条件），使用四个无关（非对照）蛋白质来定义可能对UV成像产生负面影响的广泛条件。理解观察紫外线荧光必须满足的两个标准很重要：蛋白质必须含有能够吸收激发波长能量的化学基团，发射的能量必须避免分子间和分子内吸收（荧光猝灭）。以下结果和讨论基于这些物理现象。我们的所有结果都是基于对结晶液滴的目视检查，晶体的位置是由紫外线荧光图像中的局部亮点确定的，前提是假设晶体是蛋白质的最浓缩形式。然而，明亮的荧光点并不意味着已经找到晶体，因为蛋白质的其他相也可能导致局部高浓度；特别是，我们发现塌陷的气泡可以导致UV图像中类似于晶体的特征。蛋白质可能在液气界面形成吸收层（PAL）（Yampolskaya&Platikanov，2006）;例如液滴中的气泡）；随着时间的推移，泡沫缩小了，但PAL仍然存在，在自己身上萎缩。结晶液滴本身的表面也可能发生类似的过程；当液滴平衡时，PAL会变成皱纹皮肤。其他混淆阶段可能是相分离，其中蛋白质浓缩成一个相，并形成球晶。假阳性也可归因于蛋白质吸附在无机晶体表面，导致物体在UV图像中发光，但实际上是盐。最后一个病例可能是最难识别的假阳性病例。通过观察荧光的分布，通常可以将盐晶体外壳上吸附的蛋白质与蛋白质晶体区分开来：真正的蛋白质晶体将均匀发光，而表面吸附蛋白质的盐晶体将趋向于更加不规则发光（见图3例如）。

图3 紫外线下的假阳性。(一)结晶实验中破裂气泡的可见光（a1）和紫外线（a2）图片；(b条)a的可见光（b1）和紫外线（b2）图片相分离；(c（c）)球晶的可见光（c1）和紫外线（c2）照片；(d日)可见光（d1）和紫外光（d2）图片，盐晶体与吸附蛋白质（在盐晶体表面）。

在可见光图像检查和蛋白酶K、嗜热菌蛋白酶、载铁蛋白（球粒，弱荧光）、伴刀豆球蛋白A和索马汀的紫外荧光图像检查中，观察到JCSG+中11个对照蛋白中的8个蛋白晶体生长（图4). 在分析过程中，未获得肌红蛋白、血红蛋白和铁蛋白的晶体。测试蛋白质的紫外-可见光谱证实，那些显示荧光晶体的蛋白质的吸光度在290至295 nm之间，而那些不吸收的蛋白质在290到295 nm间nm为不含色氨酸的蛋白质（测量了所有11种测试蛋白质的光谱；图5中仅显示了核糖核酸酶A和嗜热菌蛋白酶的光谱一和5b条为简洁起见）。正如预期的那样，不含色氨酸的蛋白质在UV成像下没有显示荧光。然而，色氨酸的存在并不能确保蛋白质晶体发出荧光。例如，蛋白质过氧化氢酶每506个氨基酸残基含有6个色氨酸，但其晶体没有显示荧光。这很容易归因于血红素基团，它在300–350 nm的区域内强烈吸收，并防止过氧化氢酶发出荧光，即使入射光很容易被吸收（见图5一–5d日). 为了确认这种干扰来自血红素组，我们测量了溶解在二甲基亚砜中的血红素的紫外-可见光谱（图5c（c）). 血红素在0.2米处也能很强地吸收M（M）而且很容易淹没蛋白质中任何色氨酸发出的荧光。

图4 紫外线下的假阴性和真阳性试验。(一,b条)胰岛素晶体与相应的紫外线图像。(c（c）,d日)伴刀豆球蛋白A晶体与相应的紫外线图像。

图5 不同蛋白质和化学溶液的紫外-可见光谱。(一)核糖核酸酶A（30 mg ml−1)在295 nm处为非吸收。(b条)嗜热菌蛋白酶（2.5 mg ml−1)在295 nm处吸收。(c（c）)血红素（0.21 mM（M）)在295和320–350 nm处吸收。(d日)氯化铁三在295和320–350 nm下吸收。(e（电子）)硝酸钠在295和320–330 nm处吸收。对于所有图形，垂直线为295 nm，垂直带在320到350 nm之间。

分子间因素也会影响荧光。C3屏幕上的768种独特条件是133种不同化学物质的组合混合物，表5列出了对荧光产生负面影响的前11种条件这种影响是通过目视检查四种不相关的蛋白质得出的，因此我们可以确保猝灭来自结晶溶液，而不是来自蛋白质或蛋白质与晶体的相互作用。正如我们观察到含血红素基团的蛋白质分子内荧光猝灭一样，我们评估了含铁的结晶条件(例如氯化铁）和其他二价阳离子，如钴；我们注意到，二价阳离子的存在与紫外猝灭之间很少有明确的相关性，并且通常只有荧光强度的降低。我们测量了三种不同含铁溶液的紫外-可见光谱，以及200–375 nm范围内的所有吸收光。代表性铁盐（0.01）的光谱M（M）氯化铁_三)如图5所示(d日). 其他条件更为神秘，尽管似乎醋酸盐阴离子和聚乙二醇的结合在一定程度上降低了荧光强度。

蛋白质样品本身的化学物质，而不仅仅是结晶条件，可以调节紫外线荧光。例如，使用六组氨酸标记纯化蛋白质以进行结晶是常见的，该过程可导致在最终的蛋白质制备中包含咪唑，因为它用于从亲和介质中洗脱标记的蛋白质。Willaert和Engelborghs（1991年)已经表明质子化的咪唑可以猝灭色氨酸荧光。Eftink和Ghiron（1981年)研究表明，其他化学物质，其中一些用于衍射图像的相位调整（例如碘化物），也可以降低任何固有色氨酸荧光。

所有含有硝酸盐（含铁和不含铁）的结晶液滴都显示出完全猝灭的荧光，即使液滴中有明显的晶体并且晶体是蛋白质，在其他结晶条件下会发出荧光（图6). 硝酸盐的紫外-可见光谱检查表明，该阴离子在300-350 nm范围内吸收，从而吸收发射的光（图5e（电子）)，说明分子间猝灭对于蛋白质晶体的紫外荧光成像非常重要。为一个内部项目创建了一个基于网格的优化屏幕，该项目包含所有条件下的聚乙二醇，以及HEPES或Tris缓冲液，以及四种镁盐中的一种与醋酸盐、氯化物、甲酸盐或硝酸盐反阴离子。此屏幕中观察到的荧光清楚地证实硝酸根阴离子会减弱荧光（图6). 硝酸钠的光谱（图5e（电子）)表明该阴离子在280–330 nm范围内具有吸光度。

图6 蛋白质板的UV照片，其中含有硝酸盐的条件以绿色突出显示。

为了检验假设亮度紫外荧光与蛋白质的序列无关（超出了至少存在一种色氨酸的绝对要求），我们比较了用不同蛋白质设置的类似滴的荧光。这个亮度四种对照蛋白（JCSG+条件A4、B5、D8、D11和H2）的五滴溶液的荧光强度是通过观察在整个溶液中随机选择的十个像素来测量的。此方法要求亮度甚至超过滴度，只有四种测试蛋白具有共同的结晶条件，具有所需的视觉平滑度。平均值亮度对这四种蛋白质中的五滴进行计算，并与蛋白质样品中色氨酸的浓度进行比较（表4). 在这项研究中，我们使用了已知适合晶体发生的浓度的控制蛋白；我们没有试图匹配测试蛋白质之间的蛋白质浓度（甚至色氨酸浓度）。我们确认，滴剂中的色氨酸浓度与亮度重申色氨酸荧光因蛋白质中侧链的位置（暴露或埋藏）而异（吉尔，2010).

为了检查蛋白质溶液中是否存在DNA对荧光有任何影响（猝灭或增强），我们建立了一个由2×96个孔组成的板，其中96个孔在JCSG+条件下与溶菌酶作用，96个孔与溶菌素和DNA作用在相同的条件下，以等摩尔比（选择这个比率是因为它是蛋白质-DNA实验常用的比率；Hollis，2007). 在误差范围内亮度在只含溶菌酶的滴剂和含有溶菌酶和DNA的滴剂之间。图2中仅显示了滴头A1–D12; E1–H12滴液也得到了类似的结果。DNA的存在似乎不会影响荧光。

4.结论

这项工作加强了紫外线成像是基于色氨酸荧光的观察，并且在蛋白质中没有色氨酸的情况下，这种技术是不合适的。对于自猝灭的含血红素蛋白质，也经常观察到类似的缺乏荧光。确定晶体在紫外线下是否会发出荧光的最佳方法是测量蛋白质溶液290到350纳米之间的光谱。如果溶液吸收320到350 nm之间，则不会观察到荧光，因为它将被溶液重新吸收。向蛋白质溶液中添加核酸并不会对这一一般结论增加任何进一步的警告。一些化学条件，特别是那些含有硝酸盐和/或一些金属（钴、铁）的化学条件，对吸收或发射的紫外光有负面影响。这会使任何蛋白质荧光变暗或熄灭，并可能掩盖紫外图像中晶体的外观。大多数情况下，当结晶混合物导致猝灭时，它只会降低荧光强度，增加用于查看UV图像的监视器的增益可能会使任何晶体仍能被观察到（图7). UV图像中明亮发光的物体通常是晶体，但必须小心地将UV图像与类似的白光图像进行比较，以识别虚假发光物体，尤其是塌陷的气泡。

图7 即使在鸡尾酒（硝酸盐）淬灭的情况下，紫外灯显示增加也可以观察到晶体。(一,c（c）)在可见光下滴入蛋白质晶体。(b条)在正常的紫外光显示下也有同样的下降。(d日)同样的下降在增强的紫外线显示下。