Anomalous dispersion analysis of inhibitor flexibility: a case study of the kinase inhibitor H-89

Pflug, A.; Johnson, K.A.; Engh, R.A.

doi:10.1107/S1744309112028655

结构通信

结构生物学
通信

国际标准编号：2053-230X

第68卷| 第8部分| 2012年8月| 第873-877页

doi:10.1107/S1744309112028655

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异常分散抑制剂灵活性分析：以激酶抑制剂H-89为例

亚历山大·普弗卢格,^一肯尼思·约翰逊 ^一和理查德·安格 ^一 ^*

^一挪威特罗姆瑟大学化学系挪威结构生物中心，N-9037特罗姆瑟，挪威
^*通信电子邮件：richard.engh@uit.no

(收到日期：2012年4月24日； 2012年6月24日接受； 2012年7月26日在线)

由于X射线晶体学能够显示药物靶蛋白和小分子配体之间的相互作用，因此它是药物发现计划中的一个重要工具。然而，它的有用性可能受到结晶伪影或数据分辨率的限制，特别是当单峰结合（和各向同性运动）的假设不适用时。模型之间的差异晶体结构而结构的生理范围通常阻止了结合能的定量估计。改进晶体结构分辨率通常不会有助于能量估算，因为提供最高刚性和分辨率的条件不太可能反映生理条件。相反，必须采用策略来测量和建模灵活性和多种绑定模式，以补充晶体学信息。一个有用的工具是使用反常色散用于含有合适原子的小分子。本文对激酶抑制剂H-89与蛋白激酶A（PKA）的结合进行了分析。H-89含有一个溴苯部分，该部分明显与激酶ATP口袋中的多种构象结合。使用反常色散方法，可以将这些构象解析为两种不同的结合几何。

关键词：蛋白激酶A;激酶;配体;抑制剂;灵活性;反常色散;SAD公司;溴.

三维视图：3伏每小时

PDB参考：PKA–H-89复合物，3vqh

1.简介

除了批准的药物Fasudil（HA-1077）外，H-89是激酶抑制剂“H系列”的最杰出代表之一，这是一组ATP-竞争性异喹啉磺胺类（奇吉瓦等。, 1990 ; Hidaka公司等。, 1984 ; 小野斋藤等。, 1999 ; 图1). H-89被开发出来并被报道对cAMP依赖性蛋白激酶的催化亚单位（也称为蛋白激酶A（PKA））具有选择性。尽管PKA在某些类型的癌症中调节不当，但由于其调节的细胞过程普遍存在且本质上是必需的，因此通常被认为是药物开发中的“反靶点”。因此，H-89的使用主要局限于学术研究。相反，Rho激酶靶向抑制剂Fasudil于1995年在日本被批准用于预防蛛网膜下腔出血患者的脑血管痉挛，并被发现可能有助于增强老年痴呆症患者的记忆和改善预后（Huentelman等。, 2009 ). 然而，H-89因在体外需要缺乏PKA活性或PKA本身调节作用的研究。它仍然被频繁使用，但最近的研究表明H-89是一种相当普遍的AGC激酶抑制剂（Davies等。2000年 ; Lochner&Moolman，2006年 ). 虽然H系列化合物作为药物开发的一个障碍可能是PKA的抑制，但H-89也被证明在药物设计项目中有用。H-89支架为设计对蛋白激酶B（PKB/Akt；Caldwell）具有选择性的新化合物提供了基础等。, 2008 ; 柯林斯等。, 2006 ; 留尼旺等。, 2002 )结构类似于PKA（Gassel等。, 2003 )并且仍然是重要的药物靶点（Cheng等。, 2005 ; Wu和Hu，2010年 ).

图1
腺苷-5′-三磷酸（ATP）、Fasudil和H-89的化学结构相对于ATP囊的方向相似（左侧铰链区域）。H-89的异喹啉部分以蓝色突出显示，磺胺部分以绿色突出显示，溴苯部分以红色突出显示。H-89分子的编号是指C3和N4，与结构中原子的名称一致3伏每小时.“PKA”是指cAMP依赖性蛋白激酶催化亚单位αRho激酶的亚型1和'ROCK2'α亲和力值取自文献：*，Rajagopalan等。(2010

); †, Gassel公司等。(2003

); ‡, 亚诺等。(2008

); §，英语等。(1996

2.材料和方法

2.1. 蛋白质生产、纯化和结晶

全长人催化亚单位αPKA（GenBank登录号NP_002721）在大肠杆菌BL21（DE3）-自诱导培养基中基于载体pT7-7构建的RIL细胞（Stratagene）（Studier，2005）)在297 K下经过约20小时。用于纯化PKA的程序遵循先前发布的协议（Engh等。, 1996 ).

在277 K下，在悬挂液滴中进行PKA和H-89的共结晶。液滴由10 mg ml组成⁻¹蛋白质，25米M（M）双向/MES pH 6.9，50 mM（M）KCl，1.5米M（M）辛酰基-N个-甲基葡聚糖胺，1米M（M）`蛋白激酶抑制剂肽（PKI）；₅TTYADFIASGRTGRRNAIHD公司₂₄)和5米M（M）H-89（从100 m添加M（M）甲醇原料）与12–22%进行平衡(v（v）/v（v）)甲醇。为了收集数据，将晶体转移到30%的2-甲基-2,4-戊二醇中并进行闪冷。

2.2. 衍射数据采集和数据处理

在欧洲同步辐射设施（ESRF；法国格勒诺布尔）的光束线ID29上测量了冷却晶体的衍射。扫描晶体的最大X射线吸收后，选择0.91969Ω的波长进行数据采集，接近理论值K 吸收边缘数据收集策略旨在获得大于4的总多重性。数据的后续处理是用XDS公司软件包（Kabsch，2010 )和中央对手方清算所4套节目（Winn等。, 2011 ). 衍射框架与XDS公司结果强度按比例缩放XSCALE公司，其中未合并Friedel对（“Friedel'S_LAW=FALSE”选项；表1). 数据集由分阶段生成分子置换具有MOLREP公司（Vagin和Teplyakov，2010年 )使用PDB条目的坐标1码（工程等。, 1996). 结构经过了改进REFMAC公司5（穆尔舒多夫等。, 2011 ; 表1)并将生成的结构因子与未分阶段原始数据的“DANO”和“SIGDANO”列合并*.mtz（毫米）文件使用程序计算机辅助设计.结果*.mtz（毫米）利用含有相结构因子和H-89溴的异常信号的文件，用该程序计算了异常差傅里叶图快速傅里叶变换（Ten Eyck，1973年 ).

表1
PDB条目的细化和结构统计3伏每小时

括号中的值表示最后一个shell。

数据收集和缩放(XDS公司)
X射线源	ID29、ESRF
分辨率极限（Ω）	35.0–1.95 (2.20–1.95)
单位-细胞参数（Ω）	一= 72.73,b条= 75.18,c（c）= 80.33
“空间”组	P（P）2₁2₁2₁
波长（Ω）	0.91969
反射总数	283804 (84880)
独特反射次数	61702 (18509)
多重性	4.6（4.6）
〈我/σ(我)〉	19.08 (5.68)
R（右）_{mrgd公司-F类}†(%)	9.0 (28.8)
完整性（%）	98.0 (99.3)
威尔逊B类(Å²)	21.57
精炼(REFMAC公司5)
R（右）_工作‡(%)	19
R（右）_自由的‡(%)	23.4
平均B类系数（Ω²)	21.88
蛋白质原子数	3015
配体原子数	62
水分子数量	178
R.m.s.d.粘结长度（Ω）	0.010
R.m.s.d.粘结角（°）	1.38
拉马钱德兰阴谋(PROCHECK检查)
最受欢迎（%）	91.1
额外允许（%）	8.9
允许充足（%）	0
不允许（%）	0

†R（右）_{mrgd公司-F类}= $[\textstyle\sum_{hkl}[1/（n-1）]\sum_{j=1}^{n}|F{hkl，j}}-\langle F{hk.}}\rangle|/]$ $[\textstyle\sum_{hkl}\sum_{j} F类_{hkl，j}]$ .
‡R（右）_工作/R（右）_自由的= $[\textstyle\sum_{hkl}\big||F_{rm obs}|-|F_}\rm calc}|\big|/]$ $[\textstyle\sum_{hkl}|F_{rm obs}|]$ .

REFMAC公司5（穆尔舒多夫等。, 2011)用于生成加权电子密度和差异图（2百万英尺_o个−DF公司_c（c）和百万英尺_o个−DF公司_c（c）（图2）b条和2c（c）).F类_o个和F类_c（c）指观察到的结构因素和模型结构因素，米是功绩和D类是模型误差参数。这个REFMAC公司5权重系数的计算D类和米（穆尔舒多夫等。, 2011)与中的匹配SIGMAA公司（里德，1986年 )除了只有免费的-R（右）-标记的反射用于估计米和D类对于丢失的反射，贴图系数替换为DF公司_c（c）在电子密度图中，在差分图中为零。

图2
(一)生成的异常差异傅里叶映射（1.95º）覆盖了非对称单元在PDB条目中3伏每小时3级等高线σ, 4σ和5σ. (b条)PDB条目中化合物H-89周围的2.3Ω分辨率电子密度图（灰色）和差异密度图（绿色）1码（青色；英语等。, 1996

). (c（c）)在PDB条目中化合物H-89的两种构象周围雕刻的1.95μ分辨率OMIT电子密度图（灰色）和反常差密度图（蓝色）3伏每小时（黄色）。

2.3。抑制剂

激酶抑制剂H-89购自Cayman Chemicals（美国安娜堡）。“蛋白激酶抑制剂”肽（PKI）；₅TTYADFIASGRTGRRNAIHD公司₂₄)用于PKA的提纯和共结晶，购自GL Biochem Shanghai Ltd（中华人民共和国上海）。

2.4. 结构沉积

PKA–H-89复合体的坐标和结构因子晶体结构此处描述的已保存在蛋白质数据库（PDB）中，并带有登录代码3伏每小时.

3.结果

3.1. 总体结构

在PDB条目中3伏每小时催化亚单位α蛋白激酶A以其通常的构象出现（图3一)，类似于参考结构中的1个tp（郑）等。1993年 )以及1cdk个（博塞梅耶等。1993年 )与PKA–H-89复合体（PDB入口）的早期结构几乎相同1码; 英语等。, 1996). 结构之间的平方根偏差（r.m.s.d.）1码和3伏每小时为0.33奥。在3伏每小时PKI（“蛋白激酶抑制剂”）肽的片段5–24占据肽底物位置，该位置主要由蛋白激酶抑制剂的表面形成，因为它稳定激酶结构域并促进结晶，因此通常用于PKA的结构研究α-蛋白质的螺旋C末端叶。N端波瓣，主要由五股反平行线组成β-片状物通过一条肽链（铰链）与C末端叶共价连接。它们的界面形成了一个深深的裂缝，构成了核苷酸底物ATP的结合囊。在这里描述的结构中，ATP竞争抑制剂H-89占据ATP结合位点（图3一). 如图1所示，H-89相对于ATP结合，使得H-89的异喹啉基团占据腺嘌呤结合口袋，磺酰胺模仿ATP的核糖基团，溴苯部分占据富含甘氨酸的环（由β-绞线1和2以及β-旋转链接它们）。

图3
(一)PDB入口的总体结构3伏每小时：催化亚基的三元络合物α蛋白激酶A（PKA；白色）、肽假底物“蛋白激酶抑制剂”（PKI；灰色）和ATP竞争性抑制剂H-89（黄色）。(b条)B类/结构中H-89构象的温度因子3伏每小时绘制成各自原子上的球体。所选原子的值已显示。(c（c）)结构上PKA ATP囊中H-89构象的结合环境3伏每小时残基Val123、Glu127和Asn171与配体形成氢键；溴部分与来自Phe54和Lys174侧链的疏水原子以及富含甘氨酸环的一些主链原子相互作用。ATP袋的内表面用红色表示（与抑制剂分子的最大距离为2º）。

与PDB条目中相同1码（英语等。, 1996)，H-89的溴苯部分的电子密度是扩散的，其位置没有明确定义（图2).

3.2. 异常信号描述了H-89的二价结合模式

收集的数据集中H-89溴的异常信号很弱，从“异常”中可以明显看出。表2中的corr.和“SigAno”参数，分别表示异常强度差的两个随机子集之间的平均相关因子及其估计标准差单位的平均异常差。希望衍射数据集包含有用的反常色散信息，异常相关性（“Anomal.corr.”）超过30%，异常信号强于噪声（“SigAno”>1），但这仅适用于粗于～5º的分辨率（表2). 然而，尽管异常信号的强度远低于成功SAD相位实验的要求（Dauter等。, 2002 )，这足以明确定位H-89的溴部分在非对称单元（图2).

表2
从中选择的列XSCALE公司PDB条目的缩放统计3伏每小时

分辨率极限（Ω）	数据完整性（%）	我/σ(我)	R（右）_{mrgd公司-F类}(%)	异常。更正。†(%)	SigAno公司‡
35	0	−99	−99.9	0	0
30	90	65.84	1.3	35	1.870
25	90.9	32.47	2.4	三	1.318
20	96.7	62.23	1.4	75	1.661
15	100	56.57	1.3	57	1.599
10	100	59.68	1.2	47	1.132
9	100	54.80	1.3	53	1.224
8	100	53.60	1.6	42	1.211
7	100	50.58	1.6	44	1.457
6	100	46.30	1.7	36	1.192
5	100	46.07	1.8	22	1.021
4	99.8	46.41	1.8	15	0.940
3.8	99.9	43.37	2.1	13	0.920
3.55	99.9	40.27	2.4	4	0.847
3.3	99.9	35.20	2.8	8	0.920
3.05	100	30.36	3.7	10	0.935
2.8	99.9	23.71	5.3	9	0.906
2.45	100	16.07	8.6	6	0.865
2.2	100	10.88	13.7	三	0.836
1.95	98	5.68	28.8	三	0.791

总计	99.3	19.08	9	6	0.867

†异常。Corr.是异常强度差异的两个随机子集之间的平均相关因子。
SigAno=[|F类₍₊₎−F类₍₋₎|/σ].

图2中的异常差傅里叶图(一)在非对称单元这在以3的信噪比绘制的地图中占主导地位σ和4σ在地图上是独一无二的σ该峰对应于PKA ATP囊中H-89溴基团的定位（图2c（c）). 然而，异常密度并非局限于一个位置，而是分散成两个密度球，表明溴部分的两个主要位置。这一结果与H-89的溴苯基团在两种结构中的不清楚电子密度密切相关1码（图2b条; 英语等。, 1996)以及本研究中确定的更高分辨率的H-89–PKA复合物结构（图2c（c）). 在这两种情况下，H-89的溴苯基团似乎都有一定的自由度，可以绕垂直于其苯环的轴旋转。虽然电子密度本身暗示了这一点，但反常密度显示出Br原子明显的优先位置。

与反常差异傅里叶图中出现的两个强度相似的峰一致，配体H-89在结构中建模3伏每小时有两种可供选择的结构，每种都有50%的入住率。C3-N4键的旋转（图1)在H-89的柔性连接体中，调整以下二面体，将两个构象的溴部分放置在反常差异图所示的不同位置。结构的坐标随后在REFMAC公司5对配体分子没有位置限制，导致图2中所示的构象(c（c）). 在精炼H-89的溴苯部分保留了它们的不同位置，与反常差分图的密度很好地一致。连接器几何结构相对彼此发生相应位移；这与结构中H-89这一部分的部分弱电子密度一致3伏每小时（图2c（c）). 相反，H-89的异喹啉部分锚定在激酶结构域的铰链上通过氢键（图3c（c）)因此具有配体分子中最低的温度因子（图3b条); 相邻的磺胺组显示轻微旋转。酰胺基团相对于异喹啉的扭转角变化约17°。PKA和这两种构象之间的蛋白-配体相互作用略有不同。这对于H-89的连接体与PKA的极性接触以及H-89的溴苯部分与PKA富含甘氨酸环之间的疏水接触都是如此（图3c（c）). 在这两种情况下，H-89的溴部分与蛋白质的极性接触无关，其两个构象的离散位置可能是连接体二面体施加约束的结果。

3.3. 数据质量

用于结构建模的衍射数据3伏每小时来源于暴露于约7 MGy X射线剂量下的单晶。由于在数据采集过程中，无论是整体衍射质量还是异常信号都没有衰减，溴的无序性似乎不是由辐射损伤引起的，并且可以清楚地观察到这两种H-89构象。一致地，这两种H-89构象的溴部分呈现出电子密度，并且观察良好。溴苯部分中溴-碳键的长度均为1.9Å，这与文献值非常一致。

4.讨论

将溴并入小分子配体以快速筛选结合并随后有效确定结合几何结构的方法已被用作药物发现商业模式（Antonysamy等。, 2008 ; 布兰尼等。, 2006 ; 狼等。, 2002 ). 科学文献中很少有关于其应用和效用的详细信息。然而，这将是解决药物设计中评估配体灵活性问题的一种方法（Seddon等。, 2012 ). 在这里，我们展示了这种方法在一个非常特殊的应用中的成功应用，即表征激酶抑制剂的明显异质结合模式，这是使用电子密度图（2百万英尺_o个−DF公司_c（c）)独自一人。

尽管统计数据显示，总体异常信号仅在较低分辨率的壳层中是显著的，但转换为真实空间异常电子密度图的总体信号的影响明确地定位在H-89的溴基团，其分辨率足以识别两个离散位置。这证明了该方法在表征结合模式异质性的其他相关应用中的实用性，也证实了其在涉及弱结合配体或可能只与部分占据结合的低亲和力小分子片段的应用中的有用性。

关于PKA ATP囊中H-89的柔性结合模式，问题是该信息是否有助于抑制剂设计。一般来说，结合灵活性与对结合位点变化的适应性有关，这与H-89对AGC激酶的广泛抑制谱一致（Davies等。2000年; Lochner&Moolman，2006年). 为了将H-89发展成为PKB抑制剂，其芳香族部分之间的连接物被固化，但未报告所得化合物的选择性（考德威尔等。, 2008; 柯林斯等。, 2006). 一种有趣的方法可能是修改H-89的连接子，以捕获两个各自的结合构象，并研究化合物的目标选择性模式的潜在变化。

支持信息

三维视图：3伏每小时

PDB参考：PKA–H-89复合物，3vqh

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