BrabA.11339.a: anomalous diffraction and ligand binding guide towards the elucidation of the function of a `putative β-lactamase-like protein' from Brucella melitensis

Abendroth, J.; Sankaran, B.; Edwards, T.E.; Gardberg, A.S.; Dieterich, S.; Bhandari, J.; Napuli, A.J.; Van Voorhis, W.C.; Staker, B.L.; Myler, P.J.; Stewart, L.J.

doi:10.1107/S1744309111010220

结构通信

结构生物学
通信

国际标准编号：2053-230X

第67卷| 第9部分| 2011年9月| 第1106-1112页

doi:10.1107/S1744309111010220

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BrabA.11339.a：异常衍射和配体结合指南，用于解释假定的功能β-内酰胺酶样蛋白羊布鲁氏菌

^一美国西雅图传染病结构基因组学中心，^b条Emerald BioStructures Inc.，地址：7869 NE Day Road West，Bainbridge Island，WA 98110，USA，^c（c）伯克利结构生物学中心，劳伦斯伯克利实验室，回旋加速器路1号，6R2100号楼，伯克利，加利福尼亚州94720，美国，^d日美国华盛顿大学西雅图分校变态反应和传染病系医学院，邮编：98195^{e（电子）}西雅图生物医学研究所，美国华盛顿州西雅图西湖大道北307号500室，邮编98109
^*通信电子邮件：jabendroth@embios.com

(收到日期：2011年2月12日； 2011年3月18日接受；在线2011年8月16日)

这个晶体结构的β-内酰胺酶样蛋白羊布鲁氏菌最初通过SAD阶段化解决了这个问题，该阶段化来自内部数据集，该数据集收集于一块浸有碘化物的晶体上。在硒边缘波长的同步下收集了高分辨率数据集，该数据集还使用活性部位金属离子的微小异常信号提供了独立的相位源。通过比较不同波长下的反常峰高，可以将活性中心金属离子识别为锰。在本地数据集中，可以确定部分占用的GMP。当与AMPPNP或GMPPNP共结晶时，观察到水解类似物的清晰密度，为蛋白质的功能提供线索。

关键词：西雅图传染病结构基因组中心;碘化物;SAD分阶段;反常衍射;羊布鲁氏菌;内酰胺酶;电话.

三维视图：3md7、3py5、3py6、3qh8

PDB参考：制动器A.11339，3md7;GMP复合体，3py5;3年6月;AMP复合体，3qh8

1.简介

西雅图感染性疾病结构基因组中心（SSGCID）的任务是为科学界提供一个潜在药物靶点的感染性生物体蛋白质晶体结构库。该结构集合有望促进针对国家过敏和传染病研究所（NIAID）A类、B类和C类传染病生物体的结构导向药物设计。目标生物体由SSGCID及其姊妹组织感染性疾病结构基因组学中心（CSGID）划分。两个中心都提供质粒（BEI储存库）、蛋白质样品（SSGCID）、坐标和结构因子（蛋白质数据库）以及原始衍射图像(https://www.csgid.org/csgid/pages/diffraction_images)目标完成后立即发送给社区。

羊布鲁氏菌是一种革兰氏阴性细菌病原体布鲁氏菌属确定引起布鲁氏菌病的物种（Moreno&Moriyon，2002 ). 布鲁氏菌病主要影响山羊、绵羊和牛，导致流产和死产等生殖疾病，因此流行的名称是“传染性流产”。病原体可以传播给人类通过接触受感染的动物或食用未经高温消毒的牛奶或奶酪（Young，1995 ). 在人类中，这种疾病最初被称为“马耳他热”或“波动热”，是一种多系统疾病，具有非特异性症状，如发热、寒战、痴呆、疲劳、头痛、恶心、呕吐、肌肉和身体疼痛。布鲁氏菌病影响显著的地区是地中海、亚洲、非洲和拉丁美洲的部分地区（科尔贝尔，1997年 ). 抗菌药物可以成功治疗感染。的病理生物学布鲁氏菌属由于缺乏经典的毒力因子，它是独一无二的（Moreno&Moriyon，2002).

在这里，我们报告了BrabA.11339.a的高分辨率结构，这是一个结构基因组学靶点，作为一个`β-内酰胺酶样蛋白'。β-内酰胺酶分解β-青霉素等内酰胺类抗生素会导致病原菌对抗生素产生耐药性。有四类β-内酰胺酶：A~D类。而A类、C类和D类有一个活性位点-海洋，B类金属-β-内酰胺酶在激活水的活性部位有一个双核金属中心。利用包含不同波长异常信息的高分辨率数据，我们可以获得BrabA.11339.a活性位点的详细描述和活性位点金属的鉴定。配体结合结构使我们对这种蛋白质的功能有了一个了解。

2.材料和方法

2.1. 克隆、表达和纯化

BrabA.11339.a的基因来自羊白痢生物变种Abortus 2308（NCBI YP_414422.1；基因座BAB1_1016；UniProt Q2YQ74）跨越残基2–272的全长蛋白，使用连接独立克隆（LIC；Aslanidis&de Jong，1990）将其克隆到pAVA0421载体中 ; 梅林等。, 2006 ). 该载体编码一个N端组氨酸亲和标签，后跟3C蛋白酶的底物序列；整个标签序列为MAHHHHHMGTLEAQTQ′GPGS，其中′表示解理位点。

该蛋白表达于大肠杆菌使用BL21（DE3）R3 Rosetta细胞和自诱导培养基（Studier，2005 )在LEX生物反应器中。LB肉汤的起始培养物与适当的抗生素在310 K下培养约18小时。ZYP-5052自诱导培养基是根据Studier公布的方案新鲜制备的（Studier2005). 将抗生素添加到2 l瓶无菌自诱导培养基中。这些瓶子接种了所有过夜培养物。然后将接种过的瓶子放入LEX生物反应器。培养物在298 K下培养约24小时；将温度降至288 K，培养物再培养约60 h。为了收获，将培养基在4000℃下离心克在277 K下保存20分钟。细胞膏在液氮中闪速冷冻，并在193 K下保存。

将冷冻细胞重新悬浮在裂解缓冲液（25m）中M（M）HEPES pH 7.0，500 mM（M）氯化钠，5%甘油，30米M（M）咪唑、0.025%叠氮化钠、0.5%CHAPS、10 mM（M）氯化镁₂，1米M（M）TCEP，250纳克毫升⁻¹AEBSF和0.05µg ml⁻¹溶菌酶）。用Virtis声波仪（408912）将再悬浮的细胞颗粒在冰上破碎30分钟，将其设置为100 W功率，15 s脉冲开和15 s脉冲关交替循环。用20µl苯甲酸酶核酸酶（25单位ml）培养细胞碎片⁻¹)在室温下放置45分钟，并使用Sorval SLA-1500离心机以14000转/分钟的转速离心澄清⁻¹在277 K下保持75分钟。通过固定化金属亲和力从澄清的细胞裂解液中纯化蛋白质色谱法使用5 ml HisTrap FF柱（GE Healthcare）与结合缓冲液（25 m）平衡M（M）HEPES pH 7.0，500 mM（M）氯化钠，5%甘油，30米M（M）咪唑，0.025%叠氮化钠，1 mM（M）TCEP）。用250m洗脱重组蛋白M（M）咪唑。通过与3C蛋白酶孵育过夜来去除六组氨酸标签。然后将样品在重力流柱中通过HisTrap树脂。无标记蛋白质在流动中收集。通过尺寸排除进一步纯化色谱法（SEC）使用HiLoad 26/60 Superdex 75色谱柱（GE Healthcare）与SEC缓冲液（25m）平衡M（M）HEPES pH 7.0，500 mM（M）氯化钠，2米M（M）DTT、0.025%叠氮化钠和5%甘油）。蛋白质以单峰形式洗脱。将峰分数合并并浓缩至19.6 mg ml⁻¹使用Amicon Ultra离心过滤器，具有10 kDa截止值（Millipore）。浓缩后的样品在液氮中闪速冷冻，并在193K下储存。

2.2. 结晶和X射线数据采集

对于蛋白质浓度为19.6 mg ml的目标BrabA.11339.a⁻¹，按照纽曼的策略设置了两个稀疏矩阵屏幕等。(2005 )：JCSG+（翡翠生物系统）和PACT（分子尺寸）。将0.4μl蛋白质溶液与0.4μl微孔溶液混合，并使用96-well Compact Jr结晶板（Emerald BioSystems）与100μl储液罐进行平衡。适用于衍射研究的晶体是在两个非常相似的条件下从PACT屏幕上获得的：G9（200 mM（M）酒石酸钠/钾，100 mM（M）双三丙烷pH值7.5，20%PEG 3350）和H9（200 mM（M）酒石酸钠/钾，100 mM（M）双三丙烷pH值8.5，20%PEG 3350）。晶体在一个缓冲液中进行低温保护，缓冲液中含有含有20%乙二醇的良好溶液。

Cu内部收集了本地数据集K（K）α使用Rigaku SuperBright FR-E的波长⁺配备Osmic VariMax高频光学元件和Saturn 944+CCD探测器的旋转阳极X射线发生器（表1，天然铜K（K）α). 衍射数据被简化为XDS公司/XSCALE公司（卡布施，2010年 )并在中缩放到1.85Å分辨率空间组 C类222₁.

表1
数据收集统计

括号中的值表示20个分辨率最高的壳。

配体	碘化物	天然CuK（K）α	本地ALS 501	GMP铜K（K）α	AMP铜K（K）α	放大器ALS 502
波长（Ω）	1.5418	1.5418	0.9774	1.5418	1.5418	1.3476
“空间”组	C类222₁	C类222₁	C类222₁	C类222₁	C类222₁	C类222₁
单位-细胞参数（Ω）	一= 72.71,b条= 74.95,c（c）= 98.27	一= 72.63,b条= 75.04,c（c）= 98.11	一= 72.89,b条= 75.25,c（c）= 98.36	一= 72.86,b条= 75.23,c（c）= 98.54	一= 72.85,b条= 75.20,c（c）= 98.53	一= 73.21,b条= 75.53,c（c）= 98.94
分辨率范围（Ω）	50–2.00 (2.05–2.00)	50–1.85 (1.90–1.85)	50–1.27 (1.30–1.27)	50–1.70 (1.74–1.70)	50–1.70 (1.74–1.70)	50–1.60 (1.64–1.60)
独特的反射	17854 (1257)	23011 (1520)	71257 (5123)	29984 (2068)	29964 (2069)	36362 (2574)
多重性	12.4 (6.9)	5.4 (1.90)	9.5 (6.7)	9.1 (4.4)	9.1 (4.5)	12.4 (6.1)
完整性（%）	99.3 (94.3)	98.9 (91.3)	99.7 (97.2)	99.5 (93.1)	99.5 (93.6)	99.6 (95.9)
R（右）_合并†	0.072 (0.140)	0.048 (0.149)	0.051 (0.489)	0.037 (0.147)	0.041 (0.203)	0.069 (0.390)
平均值我/σ(我)	27.1 (11.4)	24.7 (5.1)	28.3 (3.9)	40.0 (9.2)	35.2 (7.7)	25.1 (5.8)

†R（右）_合并= $[\textstyle\sum_{h}\sum_}|i_{i}（h）-\langle i（h）\rangle|/]$ $[\textstyle\sum_{h}\sum_{i} 我_{i} （h）]$ .

为了获得实验相位信息，将同一孔中的晶体在含有200 m碘的缓冲液中培养5 minM（M）酒石酸钠/钾，100米M（M）HEPES pH 7.0，25%PEG 3350，250米M（M）KI。使用如上所述的相同设置，在内部收集具有高多样性的数据集。采集720张图像，每帧宽度为0.5°。衍射数据被简化为XDS公司/XSCALE公司（卡布施，2010年)并缩放到2.0º分辨率。中的数据分析XSCALE公司（反常相关和SigAno）显示了一个强反常信号，分辨率为2.0º。

在协同晶体学项目的背景下，在伯克利结构生物学中心的束线5.0.1上收集了高分辨率数据集。该光束线的波长针对Se-SAD实验进行了优化：0.9774Ω/12.4 keV（莫顿等。, 2007 ). 波束线配备了一个3×3平铺ADSC Q315r探测器。衍射数据被简化为XDS公司/XSCALE公司（卡布施，2010年)并缩放到1.27º分辨率。可以在中检测到微弱的异常信号XSCALE公司数据分析。

为了验证配体结合，将蛋白质与1 mM（M）AMPPNP或GMPPNP和2 mM（M）氯化镁₂设置了一个小型优化屏幕：15–20%PEG 3350，200 mM（M）酒石酸钠/钾，100米M（M）双峰pH值7.0–8.0。在晶体在几天内生长到完全大小后，将它们在由1mL组成的冷冻保护缓冲液中孵育1分钟M（M）AMPPNP或GMPPNP，2米M（M）氯化镁₂，15%乙二醇，21%聚乙二醇3350，165米M（M）酒石酸钠/钾，83米M（M）双层pH值7.5。对于每一种共晶体，在家庭来源处收集了具有高多重性的数据集，如上文所述的碘化物浸泡。每个数据集的分辨率均为1.7º。对于来自同一优化屏幕的另一个AMPPNP共晶体，在协同晶体学项目的背景下，在伯克利结构生物学中心的束线5.0.2上以1.3476？的波长收集了一个具有高多重性的数据集。波长被选择为能量低于Zn边缘（1.284º/9.659 keV），但能量明显高于Mn边缘（1.896º/6.359 keV）。ALS光束线配备了一个3×3平铺ADSC Q315r探测器。数据缩放到1.6º分辨率。

2.3. 结构解决和细化

晶体的堆积密度（Matthews，1968 ),V（V）_M（M）= 2.2 Å^三 Da公司⁻¹（44%溶剂含量），建议使用一个BrabA.11339.a分子非对称单元。蛋白质数据库的搜索爆炸（阿尔特舒尔等。, 1997 )没有产生任何超过23%序列一致性的结构同源物。试图通过以下方法解决BrabA.11339.a的结构分子置换具有相位器（麦考伊等。, 2007 )使用初始本地数据集（本地CuK（K）α，1.85º分辨率）和PDB条目第三代第一代（23%的身份；K.Podzelinska、S.He、M.Wathier、A.Yakunin、M.Proudfoot、B.Hove-Jensen、D.Zechel和Z.Jia，未发表的工作）作为搜索模型并不成功。实验相位是独立于碘浸泡和高分辨率同步加速器数据集获得的。

2.3.1. 碘化物数据集

数据分析XSCALE公司显示出2.0Å分辨率的强烈异常信号。菲氏囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡囊泡（格罗斯·昆斯特里夫和亚当斯，2003年）)在碘化物浸泡的数据集中，用以定位11个异常散射体。异常的子结构用相位器（麦考伊等。, 2007)从而扩展了异常下部结构到16个站点，获得了0.49到2.0º分辨率的优值（FOM）。通过以下方法获得的实验相相位器改进了中央对手方清算所4程序鹦鹉（Cowtan，2010年 ). 初始模型（256个残基，R（右）_工作=0.307）ARP协议/弯曲（兰格等。, 2008 )，然后在中进行反复的手动实际空间拟合库特（埃姆斯利等。, 2010 )和往复空间精炼具有REFMAC公司5（穆尔舒多夫等。, 2011 ).

2.3.2. 本地同步加速器数据集

在另一种方法中，使用本地高分辨率同步加速器数据集对BrabA.11339.a结构进行相位调整。这个XSCALE公司分析表明，分辨率为～2.0º的中度异常信号。菲尼克斯（格罗斯·昆斯特里夫和亚当斯，2003年）)当衍射数据限制在3º分辨率时，能够定位两个强反常散射体。相位器（麦考伊等。, 2007)对异常进行细化和扩展下部结构使用分辨率为1.8º的数据，得到了0.360的FOM。密度提高后鹦鹉（Cowtan，2010年),ARP协议/弯曲（兰格等。, 2008)可以用267个残基和a建立一个良好的初始模型R（右）_工作0.200，数据分辨率为1.7°。

BrabA.11339.a的高分辨率结构模型包含一个跨越残基Ser3–Val272的蛋白质分子、两个锰离子、一个钾离子、一种钠离子、一磷酸鸟苷（GMP）、一个酒石酸分子和348个水分子。最终结构通过验证库特（Cowtan，2010年)和摩尔概率（陈）等。, 2010 ). 该结构存放在PDB中，带有标识符3分7秒（见表2).

表2
细化和模型统计

碘和天然铜的模型K（K）α数据集只进行了部分优化。初步细化统计数据以斜体显示。括号中的值表示20个分辨率最高的壳。

配体	碘化物	天然CuK（K）α	本地ALS 501	GMP铜K（K）α	AMP铜K（K）α	放大器ALS 502
分辨率范围（Ω）	50–2.00 (2.05–2.00)	50–1.85 (1.90–1.85)	50–1.27 (1.30–1.27)	50–1.70 (1.74–1.70)	50–1.70 (1.74–1.70)	50–1.60 (1.64–1.60)
R（右）_晶体†	0.242 (0.226)	0.181 (0.213)	0.107 (0.152)	0.140 (0.163)	0.164 (0.174)	0.144 (0.223)
R（右）_自由的†	0.295 (0.281)	0.228 (0.266)	0.134 (0.203)	0.168 (0.206)	0.196 (0.211)	0.168 (0.260)
R.m.s.d.键（Å）	0.017	0.023	0.018	0.013	0.015	0.015
R.m.s.d.角（°）	1.65	1.94	1.87	1.52	1.64	1.65
蛋白质原子			2116	2116	2110	2118
非蛋白质原子			380	381	344	344
平均值B类系数（Ω²)			9.85	8.13	10.4	10.6
有利地区的残留物			243 [98%]	251 [97%]	248 [96%]	253 [98%]
允许区域内的残留物			4 [1.4%]	6 [2.3%]	9 [3.5%]	5 [1.9%]
不允许区域的残留物			1 [0.4%]	1 [0.4%]	1 [0.4%]	1 [0.4%]
摩尔概率分数[百分位数]			1.92[第92名]	1.27[第98位]	1.38[第96位]	1.08[第99位]
PDB代码	不适用	不适用	3分7秒	3年6月	3年5月	第3季度8

†R（右）_晶体= $[\textstyle\sum_｛hkl｝\bigh||F_｛\rm obs｝|-|F_｛\rm calc｝|\bigh|/]$ $[\textstyle\sum_{hkl}|F_{rm obs}|]$ .免费R（右）使用等效方程计算因子，使用从精致。

与AMPPNP或GMPPNP共结晶的三种结构通过直接求解精炼所有非蛋白原子都被移除的高分辨率结构。数据和细化统计总结见表1和2.

3.结果和讨论

目标BrabA.11339.a作为`β-内酰胺酶样蛋白羊白痢对序列数据库的同源性搜索产生了各种注释，主要是其他注释`β-类内酰胺酶蛋白质，金属依赖性水解酶，未表征的蛋白质、PhnP（磷酸降解碳磷裂解酶途径的磷酸二酯酶）蛋白质和tRNase Z蛋白质。然而，该序列在不同物种之间高度保守，许多蛋白质共享50%以上的序列同源性。对蛋白质数据库的搜索发现，明显缺乏具有高序列同源性的结构。碳磷裂解酶途径的磷酸二酯酶（PhnP；PDB入口第三代第一代)来自大肠杆菌是最接近的同源物；PhnP与BrabA.11339.a有23%的序列同源性，有大量插入和删除。

BrabA.11339.a在衍射井中容易结晶C类-中心正交晶型。该结构无法通过分子替换。SSGCID获得实验阶段的第一种方法是用碘化物快速浸泡（Abendroth等。, 2010 , 2011 )遵循Nagem和Dauter（Nagem等。, 2001 ). 这种方法背后的原理是（i）碘化物在Cu处的强异常信号K（K）αX射线波长(（f）′′ = 6.8; 布里科涅等。, 2003 )，（ii）碘与不同性质的弱结合位点（疏水性和碱性）的相容性，以及（iii）高浓度碘晶格可以容忍。在SSGCID背景下，这一试验性阶段化策略非常成功（Abendroth等。, 2010, 2011). 对于BrabA.11339.a，相位信息不仅来自碘离子：活性部位的两个金属离子和除碘离子外的一个钾离子。事实上，高分辨率本地数据集是在波束线上采集的，该波束线针对Se边缘（0.9774º）的数据采集进行了优化。来自这三个反常散射体的微小反常信号足以使结构独立相位。BrabA.11339.a的结构解强调了金属等固有反常散射体和碘等外部添加散射体的反常定相能力。

BrabA.11339.a与每个单体结晶非对称单元。二聚体由晶体对称性（图1). 二聚体埋藏1444²界面中每个原聚体的可及表面计算公式国际学生成绩评估（Krissinel&Henrick，1997）). BrabA.11339.a假定为金属-β-具有两个中心的内酰胺酶样折叠β-板材（图2). 使用搜索结构同源性SSM公司（Krissinel和Henrick，2004年 )发现PhnP蛋白（PDB条目）是最接近的结构同源物第三代第一代，1.7μl r.m.s.d.，25%序列同源性），一种推测的核糖核酸酶（PDB条目1千公里，1.9λr.m.s.d.，21%序列一致性；中西部结构基因组学中心，未发表的工作）和核糖核酸酶Z（PDB条目44年1月，2.3λr.m.s.d.，21%序列一致性；德拉西拉盖莱等。, 2005 )（见图2). 结构同源性主要集中在中心β-薄板和螺旋α4和α5，虽然在β-？股β5和β6

图1
BrabA.11339.a二聚体的结构。在晶体二聚体的带状表示中β-每个原单体的链的颜色略有不同。晶体二元系垂直排列。各种离子显示为球体：Mn²⁺品红，K⁺蓝色和Na⁺绿色。五个强碘化物位点显示为一个原聚体的橙色球体。GMP和酒石酸盐显示为棒状模型。

图2
折叠比较。BrabA.11339.a的折叠与其结构同源物的比较。第三代第一代PhnP蛋白质来自大肠杆菌,1千公里是一种来自炭疽杆菌和第1年44核糖核酸酶Z来自枯草杆菌.结构同源性集中在这两个方面β-板材和螺旋α4和α5、配色方案：Mn、品红色；锌、青色；Na，绿色；K、蓝色

作为β-BrabA.11339.a的活性位点中存在类内酰胺酶蛋白和磷酸二酯酶蛋白家族，这是一个双金属中心（图3). 这两种金属相距3.40º，由水330桥接，并由几个组氨酸残基（His86、His88、His170和His241）连接，键距在2.22到2.24º之间，天冬氨酸残基（Asp90和Asp188）的键距在2.2到2.31º之间以及GMP的磷酸基团。表3总结了金属中心周围的粘结距离.它们落在锰离子配位的预期距离内（郑等。, 2008 ).

表3
双核Mn的键距²⁺高分辨率数据集中心

原子	与Mn300的距离（Ω）	原子	与Mn301的距离（Ω）
锰301	3.40	300锰	3.40
Wat330型	2.10	Wat330型	2.07
GMP O1P	2.38	GMP O3P公司	2.20
Asp90 OD2型	2.28
Asp188 OD2型	2.28	Asp188 OD2型	2.31
Asp188 OD1型	3
His241 NE2	2.23	His86 NE2	2.24
		His88 ND1型	2.22
		His170 NE2	2.22

图3
双核锰中心。BrabA.11339.a的活性位点由两个锰离子（品红色）组成，它们被一个水分子（红色）桥接。GMP的磷酸基团与该活化水分子非常接近。这个σ_A类-加权2F类_o个−F类_c（c）高分辨率数据集的电子密度等值线为1σ（蓝色）和相应的F类_o个−F类_c（c）电子密度为±3σ（绿色/红色）。反常傅里叶电子密度的轮廓为10σ（橙色）。所有三个波长的强烈反常傅里叶密度表明活性中心金属为锰。粘结距离见表3

; 异常峰高见表4

波兹林斯卡等。(2009 )对PhnP的金属依赖性进行了详细的功能分析；他们报告说对锰有强烈偏好²⁺和镍²⁺（波兹林斯卡等。, 2009)并将金属建模为其结构中的锰离子。在1千公里假定核糖核酸酶的结构（中西部结构基因组学中心，未经证实的工作）金属被建模为锌²⁺离子，可能是因为结晶缓冲液中存在氯化锌。在RNAse Z的结构中（PDB条目44年1月)金属被建模为锌²⁺尽管结构文件和B类金属离子的因子高于蛋白质环境的因子（de la Sierra-Gallay等。, 2005).

碘化物数据集已经表明两种活性位金属和钾位的密度显著异常。为了更详细地分析金属中心，在长X射线波长下从配体共晶体中收集了具有高多重性的衍射数据集：内部λ=1.5418？，在同步加速器上λ= 1.3476 Å. 表4总结了金属位点的异常傅立叶峰高度(一)并与理论值进行了比较（f）表4中各种原子的“系数(b条). 钾是高浓度结晶、浸泡和冷冻缓冲液的一部分，这在数据集之间是一致的。因此，钾离子的占有率可以假定为常数，并可作为参考。有趣的是，钾离子位点在结构同源物之间并不保守。对于长波长数据集和边缘数据集，两种活性位金属都可以观察到强烈的反常傅里叶峰。每个峰值的强度大约是钾信号的四倍。锰是唯一一种在所有三个波长都有明显异常信号的金属。锌的异常信号²⁺在硒边缘很强，但在两个较长波长中都很弱。镍的异常信号²⁺在Se边缘和1.3476º处较强；然而，该值较低，为1.5418奥。金属之间的结合距离在Mn的预期范围内²⁺离子（郑等。, 2008). 因此，BrabA.11339.a的双核中心可以被指定为两个具有高度置信度的锰离子。

表4
异常傅里叶峰高和傅里叶系数

(一)在所有三个数据集的全分辨率范围内计算异常傅里叶图。峰被发现与中央对手方清算所4程序最大峰值.

原子	0.9774 Å	1.3476 Å	铜K（K）α放大器	铜K（K）α药品GMP
300锰	33.8	31.8	36.6	45.8
锰301	42.4	42.1	40.5	47.2
K302公司	8.8	12.6	11.7	14.3
15周SG	6.4	5.7	7.2	9
赛斯31 SG	6.5	4.9	8.3	10
Met71标准差	5.7	8.3	9.2	9.9
Met109标准差	6.7	6.6	7.3	7.9
128号气缸SG	5.3	5.1	8	10.3
符合143 SD	5	6	5.7	5.4
塞浦路斯186 SG	6.5	5.5	7.5	9.3
符合242 SD	6.1	7.3	8.3	10.4
符合252标准差	—	—	5.9	5.6

(b条)反常傅里叶系数（f）“（e）⁻)对于Cu处的选定元素K（K）α列出波长和12.4 keV进行比较（布里科涅等。, 2003). 锰是唯一一种在两种波长下信号都比钾强的金属。

	0.9774 Å	1.3476 Å	1.5418 Å
我	3.18	5.49	6.83
S公司	0.23	0.43	0.56
锰	1.30	2.26	2.80
锌	2.48	0.55	0.71
K（K）	0.46	0.84	1.08
镍	1.95	3.30	0.51

在天然结构中，可以在双核锰的紧邻处观察到部分占据的GMP分子²⁺中心。在纯化过程中的任何阶段都没有向蛋白质中添加GMP；因此，它一定是从表达宿主中纯化出来的。为了确认核苷酸，在GMPPNP和AMPPNP存在下生长晶体。然而，在这两种情况下，GMP和AMP的电子密度都非常稳定（见图4). 这个α-磷酸盐基团非常明确，但没有密度β-磷酸盐或γ-磷酸盐基团。这个γ--在晶体生长期间添加的GMPPNP或AMPPNP的磷酸基团是不可水解的，并且在冷冻缓冲液中进行了短暂浸泡；这个β-然而，磷酸基团可以水解。可以假设BrabA.11339.a能够水解AMPPNP和GMPPNPα-磷酸盐和β-磷酸盐分别为AMP或GMP。

图4
AMP结合和GMP结合的结构。BrabA.11339.a与AMPPNP和GMPPNP共结晶，AMPPNP和GMPPNP是AMP或GMP的变体，在β-？磷酸盐和γ-磷酸盐。左面板，AMPPNP（顶部）和GMPPNP共同晶体的OMIT密度（见图3

颜色）。这个σ_A类-加权2F类_o个−F类_c（c）高分辨率数据集的电子密度等值线为1σ（蓝色）和相应的F类_o个−F类_c（c）电子密度为±3σ（绿色/红色）。右侧面板显示了分别使用AMP（顶部）和GMP（底部）优化的模型的优化密度。在α-磷酸盐。很可能BrabA.11339.a水解了β-磷酸盐。这个核苷酸结合在二聚体界面并与两个原聚体进行多重相互作用。

GMP或AMP分子结合在二聚体界面并进行多重相互作用。磷酸基团参与与锰离子、桥联水分子330（在配体结合结构中称为水1）、组氨酸残基His88和His241、天冬氨酸残基Asp90和其他水分子（在高分辨率结构中为315、454和511）的氢键。核糖基团与Asp96的羧基（O2*和O3*）进行了两次相互作用，与Arg99的胍基（O2_）进行了二次相互作用。鸟嘌呤基团与另一个原聚体的Tyr127堆叠在一起。鸟嘌呤部分与Ala89（N3）的酰胺N原子和水分子形成氢键。这些相互作用都不能为AMP或GMP提供特异性。

在PhnP结构中（PDB条目第三代第一代)在磷酸和核糖占据的空间中模拟丙二酸。假定的核糖核酸酶（PDB条目）中没有配体建模1千公里). 在核糖核酸酶Z的结构中枯草杆菌（PDB条目44年1月（r.m.s.d.2.3–2.4º，20%序列恒等式）磷酸根在与BrabA.11339.a中GMP的磷酸基团相同的位置建模，尽管B类磷酸盐离子的因子明显高于环境因子（de la Sierra-Gallay等。, 2005). 这三种同源结构都不能在BrabA.11339.a中观察到的构象中容纳GMP或AMP分子而不发生构象变化。

在双核锰中心附近发现一个嘌呤单磷酸盐，可以推测BrabA的功能。11339.a。对于具有双核中心的各种酶，已知桥接水被两种金属离子激活。水以氢氧化物的形式反应，开始水解反应。GMP或AMP的磷酸基团位于该脱质子水分子303（2.2º）附近。活性部位有足够的空间容纳另外两个磷酸基团。因此，BrabA.11339.a可能是GTP/ATP或GDP/ADP水解酶。

BrabA.11339.a（BAB1_1016）的遗传背景提示其在核苷酸加工中具有功能。其遗传邻居为BAB1_1012，DNA聚合酶II亚单位Δ; BAB1_1013，一种假设蛋白质；BAB1_1014，metG，一种蛋氨酸-tRNA合成酶；TatD相关脱氧核糖核酸酶BAB_1015；BAB1_1016，BrabA.11339.a；BAB1-1017，循环β-1,2-葡聚糖ABC转运体；BAB1_1018，一种假设蛋白质；和BAB1_1019，一种RNA结合S4：假尿苷合成酶。

利用高分辨率数据和反常衍射，高精度测定了BrabA.11339.a及其双核锰中心的结构。最初偶然在活性部位发现GMP以及随后的高分辨率共晶具有的结构就地水解AMP或GMP揭示了这种蛋白质的功能，它作为一种蛋白质进入SSGCID管道`β-“类内酰胺酶蛋白”。需要进一步的分析来验证该蛋白的生物学功能及其在针对病原体的结构导向药物设计中的适用性羊白痢.

支持信息

三维视图：3md7、3py5、3py6、3qh8

PDB参考：制动器A.11339，3md7;GMP复合体，3py5;3年6月;AMP复合体，3qh8

致谢

作者感谢整个SSGCID团队。这项研究是根据联邦合同HHSN272200700057C获得资助的，合同号为HHSN27200700057C，由美国国家卫生研究院卫生与公众服务部国家过敏和传染病研究所提供。伯克利结构生物学中心部分由美国国立卫生研究院、美国国立普通医学科学研究所和霍华德·休斯医学研究所支持。根据合同号DE-AC02-05CH11231，先进光源由基础能源科学办公室科学办公室主任和美国能源部支持。

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