Expression, purification and crystallization of the cell-division protein YgfE from Escherichia coli

Addinall, S.G.; Johnson, K.A.; Dafforn, T.; Smith, C.; Rodger, A.; Gomez, R.P.; Sloan, K.; Blewett, A.; Scott, D.J.; Roper, D.I.

doi:10.1107/S1744309105003945

结晶通信

结构生物学
通信

国际标准编号：2053-230X

第61卷| 第3部分| 2005年3月| 第305-307页

doi:10.1107/S1744309105003945

细胞源蛋白YgfE的表达、纯化和结晶大肠杆菌

^一英国曼彻斯特M13 9PT牛津路迈克尔·史密斯大厦曼彻斯特大学生命科学学院，^b条瑞典斯德哥尔摩大学阿伦尼乌斯自然科学实验室生物化学和生物物理系，SE-106 91，^c（c）英国伯明翰B15 2TT埃德巴斯顿伯明翰大学生物科学系，^d日英国考文垂华威大学生物科学系CV4 7AL，^{e（电子）}英国考文垂华威大学化学系CV4 7AL，^如果英国考文垂华威大学MOAC博士培训中心CV4 7AL^克英国莱斯特郡萨顿波宁顿诺丁汉大学生物科学学院国家大分子流体动力学中心LE12 5RD
^*通信电子邮件：david.roper@warwick.ac.uk

(收到日期：2004年12月21日； 2005年2月3日接受；在线2005年2月24日)

中指定为b2910（ygfE）的开放式阅读框架大肠杆菌K12-MG1655基因组序列被克隆到高表达质粒pETDuet-1中，并在大肠杆菌中过度表达大肠杆菌BL21（DE3）-AI。蛋白质分三步纯化至99%纯度。晶体是通过悬滴蒸汽扩散法在291K下从各种筛选条件下获得的，但主要是从含有0.1M（M）HEPES pH 7.0，18%聚乙二醇6000，5米M（M）氯化钙₂。在欧洲同步辐射设施（ESRF）收集了1.8°的衍射数据。这些晶体属于空间组 P（P）6₁22或P（P）6₅22，带单元间参数一 = 53.8,b条= 53.8,c（c）= 329.7 Å,α=β= 90,γ= 120°.

关键词：细胞介导蛋白;YgfE公司。

1.简介

祖先微管蛋白FtsZ在细菌细胞分裂过程中起着关键作用。FtsZ在细胞质膜内表面的预分裂细胞中间聚合成一个环（“Z环”）。然后Z环收缩，驱动细胞分裂（Addinall&Holland，2002）; Lutkenhaus&Addinall，1997年 ; Margolin，2000年 ). FtsZ在细菌物种和植物中广泛保存（在需要进行质体分裂的地方）。FtsZ也与一些古生物的分裂和一些真核生物的线粒体有关（沃恩等。, 2004 ). 作为一种具有原核起源的细胞骨架元素，Z环代表了一个有趣的研究课题，并且作为细菌生命基本过程中的主要参与者，FtsZ代表了新型抗菌化合物的一个令人兴奋的潜在靶点。

Z形环形成和收缩的机制特征较差体内Z形环的结构未知。体外研究表明，FtsZ是一种GTP酶，可以以GTP依赖的方式聚合成线性聚合物（Romberg&Levin，2003 )，并且这些聚合物根据聚合条件形成或多或少程度的横向缔合。测量表明，细胞含有足够的FtsZ，使Z环由多个原丝（Lu等。, 1998 ; Feucht公司等。, 2001 ). 这可能是因为含有GFP-FtsZ融合蛋白的细胞将大约30%的GFP荧光纳入Z环（Anderson等。, 2004 ). 因此，FtsZ聚合物之间的横向相互作用可能在Z环功能中很重要。

已鉴定出两种促进FtsZ聚合物之间横向关联的FtsZ辅助蛋白。ZipA（来自大肠杆菌)是一种跨膜蛋白，具有与FtsZ C末端相互作用的细胞质域（Hale&de Boer，1997 ). ZipA的这个域诱导FtsZ聚合物的捆绑在体外（黑尔等。, 2000 ; Ray Chaudhuri，1999年 )其结构已在与小FtsZ肽（Moy）的复合物中确定等。, 2000 ). 来自两者的ZapA枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌已证明能结合并诱导FtsZ聚合物之间的捆绑（Gueiros-Filho和Losick，2002 ; 低等。, 2004 )、和晶体结构四聚体铜绿假单胞菌ZapA已解决（低等。, 2004). 我们最近证明了大肠杆菌YgfE蛋白结合并捆绑FtsZ聚合物，抑制FtsZ GTPase并在溶液中采用二聚体-四聚体平衡（小等。，提交的工作）。因此，如先前序列和免疫荧光数据所示，YgfE是ZapA的功能同源物（Gueiros-Filho&Losick，2002）).

2.方法和材料

2.1. 克隆、过表达和纯化

基因编码大肠杆菌通过PCR扩增YgfE（b2910；109个氨基酸，12594 Da）大肠杆菌K12-MG1655染色体DNA，带有包含生态基因5′端的RI位点和Hin公司dIII站点位于3′端。用这些酶消化PCR片段，并将其连接到pETDuet-1载体（Novagen）中，也用生态RI和Hin公司d三。该策略为YgfE提供氨基末端六组氨酸标记。通过限制性消化筛选出含有克隆基因的重组子后，大肠杆菌用产生的重组质粒pETDuet转化BL21（DE3）AI（Invitrogen）-ygfE公司细胞在310 K的温度下在含有50µg l的650 ml LB培养基中生长⁻¹氨苄西林。通过添加最终浓度为0.2%的阿拉伯糖诱导蛋白质表达，并在298 K下持续生长16 h。通过6400℃离心收集细胞克并在50米内重新悬浮M（M）4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES），pH 7.5500 mM（M）氯化钠和10 mM（M）咪唑（缓冲剂A类)在超声波分解之前。

通过在50000下离心来澄清超声处理的提取物克并在277 K温度下应用于25 ml螯合Sepharose（GE Healthcare）亲和柱上，该亲和柱的三个柱体积为50 mM（M）氯化镍（50 m）M（M）磷酸钠缓冲液在缓冲液中平衡前的pH值为4A类装载粗提取物后，用10个柱体积的A类然后是10列的缓冲区A类补充100 mM（M）咪唑，pH 8.0。然后在缓冲液中从色谱柱中洗脱YgfEA类含500mM（M）咪唑，pH 8.0。蛋白质被透析成20米M（M）HEPES pH值7.5，浓缩至12 mg ml⁻¹，由BioRad蛋白质分析测定。

3.结晶和DLS分析

在结晶之前，通过Whatman SpinX离心机旋转过滤器过滤蛋白质样品，并使用DynaPro MS/X设备进行动态光散射分析，以检查单分散性。所有结晶实验都是在291 K的24孔组织培养Linbro平板中使用悬挂滴蒸气扩散法进行的。初始结晶实验是使用取自Hampton Research Crystal Screens I和II的0.5 ml储液器溶液进行的（Jancarik&Kim，1991 )或使用从Clear Strategy Screen中提取的0.5 ml溶液，用0.1缓冲M（M）MES pH 6.5（Brzozowski&Walton，2001年 ). 全程使用由1µl蛋白质溶液和1µl贮存液组成的滴剂。几天后，使用清晰策略屏幕（CSS；Brzozowski&Walton，2001）中的几种条件获得晶体)包括CSS1 No.1（25%PEG 2K单甲醚，0.3M（M）醋酸钠）和CSS1 No.6（0.1M（M）HEPES pH 7.0，25%PEG 2K单甲醚，0.8M（M）甲酸钠）。此外，晶体是从为小蛋白和肽类使用由0.1组成的条件M（M）HEPES pH 7.0，18%聚乙二醇6000，5米M（M）氯化钙₂这些晶体的质量适合X射线数据采集，尺寸超过0.1×0.5×0.2 mm（图1).

图1
晶体大肠杆菌从0.1获得的YgfEM（M）HEPES pH 7.0，18%聚乙二醇6000，5米M（M）氯化钙₂。这些晶体在291 K下培养板后2–3天内出现，在任何一个维度上最大尺寸为0.5 mm。

3.1. X射线晶体学研究

使用Enraf–Nonius Cu在100 K内部收集初步衍射数据K（K）α在45 kV和115 mA下运行的X射线发生器，配备有Osmic聚焦镜和MAR 345dtb成像探测器。本文引用的完整数据集在ESRF ID14.3中收集。晶体在液氮中用30%玻璃化(v（v）/v（v）)母液中的甘油作为低温保护剂，使用牛津低温蒸汽系统在整个数据采集过程中保持在100K。使用香港（HKL）程序DENZO公司和电子秤组件（Otwinowski&Minor，1997年 ). 数据收集和处理统计数据如表1所示。

表1
数据收集和处理统计

括号中的值对应于外部分辨率外壳。

波长（Ω）	0.933
“空间”组	P（P）6₁22
单位-细胞参数
一(Å)	53.8
b条(Å)	53.8
c（c）(Å)	329.7
α(°)	90
β(°)	90
γ(°)	120
马修斯系数^三达⁻¹)	2.7
每个AU的分子数	2
溶剂含量（%）	55
分辨率范围（Ω）	30–1.8 (1.83–1.80)
观察结果总数	380518
独特的反射	27357
平均我/σ(我)	47.9 (4.4)
R（右）_合并	0.052 (0.242)
完整性（%）	98.3 (78.2)

在本研究过程中铜绿假单胞菌ZapA（PDB代码1周2)变得可用。虽然ZapA是YgfE的功能同源物，但这两种蛋白质之间的序列相似性很低（图2)到目前为止，我们还无法使用ZapA作为搜索模型来获得分子置换解决方案。因此，我们正在研究MIR和MAD策略，以获得YgfE结构的解决方案，作为研究YgfE、FtsZ和其他细胞视觉蛋白相互作用的协调研究的一部分。

图2
CLUSTALW公司序列比对(https://www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html)第页，共页大肠杆菌K12-MG1655 YgfE（TIGR参考b2901）铜绿假单胞菌PAO1 ZapA（TIGR参考PA5227）。

致谢

我们非常感谢您访问位于格勒诺布尔ESRF和达累斯伯里SRS的同步加速器设施并为其提供用户支持。我们要感谢克劳斯·福特勒（伯明翰大学）在数据收集方面提供的帮助。AB由BBSRC学生奖学金资助；支持RPG通过EPSRC支持的位于KAJ沃里克的分子组织和细胞组装（MOAC）博士培训中心由卡尔·特里格基金会支持，SA和TD分别由威康信托基金会和MRC职业发展研究金支持。

工具书类

Addinall，S.G.&Holland，B.（2002年）。分子生物学杂志。 318, 219–236. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Anderson，D.E.、Gueiros-Filho，F.J.和Erickson，H.P.（2004）。《细菌学杂志》。 186, 5775–5781. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Brzozowski，A.M.和Walton，J.（2001）。J.应用。克里斯特。 34, 97–101. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Feucht，A.、Lucet，I.、Yudkin，M.D.和Errington，J.（2001）。摩尔微生物。 40, 115–125. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Gueiros-Filho，F.J.和Losick，R.（2002）。基因发育。 16, 2544–2556. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Hale，C.A.和de Boer，P.A.（1997年）。单元格，88, 175–185. 交叉参考中国科学院公共医学科学网谷歌学者
 Hale，C.A.、Rhee，A.C.和de Boer，P.A.（2000年）。《细菌学杂志》。 182, 5153–5166. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Jancarik，J.和Kim，S.-H.（1991年）。J.应用。克里斯特。 24, 409–411. 交叉参考中国科学院科学网 IUCr日志谷歌学者
 Low，H.H.，Moncrieffe，M.C.和Löwe，J.（2004年）。分子生物学杂志。 341, 839–852. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Lu，C.，Stricker，J.&Erickson，H.P.（1998）。细胞模型。细胞骨架，40，71–86科学网交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 Lutkenhaus，J.和Addinall，S.G.（1997）。每年。生物化学版。 66, 93–116. 交叉参考中国科学院公共医学科学网谷歌学者
 Margolin，W.（2000年）。FEMS微生物。版次。 24, 531–548. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Moy，F.J.、Glasfeld，E.、Mosyak，L.和Powers，R.（2000）。生物化学，39, 9146–9156. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Otwinowski，Z.&Minor，W.（1997年）。方法酶制剂。 276, 307–326. 交叉参考中国科学院科学网谷歌学者
 Ray Chaudhuri，D.（1999年）。EMBO J。 18, 2372–2383. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Romberg，L.&Levin，P.A.（2003年）。每年。微生物版。 57, 125–154. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Vaughan，S.、Wickstead，B.、Gull，K.和Addinall，S.G.（2004）。《分子进化杂志》。 58, 19–29. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者