1.简介

每个人类细胞都含有超过2米的DNA，这些DNA被染色质高度压缩到细胞核中，而细胞核的厚度只有50微米左右^三结构生物学方法已经开始揭示DNA是如何在细胞中被压缩和修饰的。例如，早期的电子显微镜（EM）工作证实了生物化学的结论，即染色质的基本单位是核小体，核小体将DNA紧密包裹在四聚体H3–H4的中央盘状体周围，该盘状体的两面被H2A–H2B二聚体所覆盖（里士满等。, 1984; 克鲁格等。, 1980). 核小体核心粒子（NCP）的宽度约为10纳米，围绕着这个共形粒子的赤道有1.65圈DNA。核小体2.8°分辨率结构的里程碑式出版（卢格等。, 1997)揭示了组蛋白折叠和蛋白质与DNA相互作用的关键特征。近原子图部分是通过使用完全重组组蛋白和强定位DNA实现的，重组后的NCP比从细胞中分离出来的NCP更均匀。每个组蛋白都表现出一种典型的三螺旋哑铃形，其N端和C端尾部大多是非结构化的（图1). DNA与八聚体盘接触，带有许多碱性残基，这些残基映射到组蛋白核心的外周，并投射到DNA的小凹槽中，参与非序列特异性的相互作用。核小体暴露在溶剂中的上下表面形成起伏的表面，具有用于染色质蛋白质识别的独特电化学特征。组蛋白尾部是翻译后修饰的主要部位（Ng&Cheung，2016; 鲁滕堡等。, 2007); 它们被描述为具有多种构象，并且可能具有高度的灵活性（卢格等。, 1997; 戴维等。, 2002; 汉森等。, 2006)但可以在蛋白质结合后有序化（阿玛奇等。, 2011; 阿里塔等。, 2012). NCP提供了一个平台，便于阅读和复制结合的DNA，并有助于控制细胞中无数与DNA相关的过程。核小体结构的相对稀缺性是理解核小体如何被修饰、读取、打开、移除和沉积的主要障碍。X射线晶体学研究揭示了不同组蛋白变体和DNA序列如何影响核心NCP（McGinty&Tan，2015年综述). 然而，尽管最近取得了进展，但NCP结合复合物、表观遗传修饰NCP和高阶NCP阵列的X射线结构相对较少（McGinty&Tan，2016).

图1 (一)NCP结构。Chua的3.9º分辨率结构等。(2016)（EMD条目8140）显示并分段加州大学旧金山分校Chimera（佩特森等。, 2004)突出不同的组蛋白和DNA。突出显示了NCP的主要功能。(b条)H2A的密度显示在Davey的H2A带状表示旁边等。(2002)（PDB条目3lz0个).

互补结构技术，如核磁共振、SAXS和EM，已被开发用于染色质组分的可视化，与X射线晶体学相比具有一些优势。许多研究使用甲基-TROSY NMR帮助建立动态核小体相互作用的结构模型（Eidahl等。, 2013; 加藤等。, 2011; 周等。, 2013). 根据SAXS（Pilotto）推断出NCP复合物的低分辨率模型等。, 2015)和单粒子EM数据（Nguyen等。, 2013; 查班等。, 2008; 沙拉瓦纳等。, 2012; 托西等。, 2013; 山田等。, 2011). 事实上，EM长期以来一直用于细胞切片和体外重组染色质纤维以探测核小体在高阶结构中的排列（谢弗等。, 2011; 罗宾逊等。, 2006; 劳斯等。, 2008; Finch&Klug，1976年; 埃尔特索夫等。, 2008). 然而，随着新成像技术和计算方法的出现（Fernandez-Leiro&Scheres，2016)，单粒子低温电子显微镜现在可以提供以前难以处理的复合物的分子细节。有三个因素使结构冷冻电子显微镜成为一种有吸引力的技术：（i）制备需要相对较少的可溶性单分散样品；（ii）可以通过计算处理一定程度的成分/构象异质性，这通常会损害结晶；以及（iii）较大的大分子，例如含核小体的组装体，在电子显微镜上更容易看到。

在这篇综述中，我们将总结在确定核小体生物组装体的单粒子EM结构方面的最新进展，强调EM方法与更传统的结构生物学工具相比的变化作用和优势。

2.在电子显微镜下观察核小体

尽管核小体相对较小（～200kDa），但由于包裹的核小体DNA的电子散射增加，核小体高度致密，在低温电子显微镜中提供相对较高的对比度。尽管有这些优点，但识别玻璃冰中的小NCP颗粒可能具有挑战性，并且迄今为止，大多数低温EM NCP结构都是通过增加质量进行可视化的，或者是通过巨大的过渡后改造（Wilson等。, 2016)或与大型蛋白质组装体复合（Maskell等。, 2015; 山田等。, 2011; 徐等。, 2016). Chua和同事通过使用Volta相位板来规避这个问题，从而在低频率下增加对比度并改进粒子排列（Chua等。, 2016). 这些作者能够重建分辨率为3.9º的最终低温电子显微镜图，这与NCP的可用晶体结构非常一致（图1). 通过将EM密度与已发表的高分辨率晶体结构进行比较，可以分辨组蛋白尾部的细微细节（Chua等。, 2016; 威尔逊等。, 2016; 图1). 与EM图谱相比，组蛋白H3和H4尾部的路径和密度在晶体结构中更加有序。然而，即使从较低分辨率的EM图中，也可以观察到组蛋白H2A的N-和C-末端尾部，这表明这些尾部在玻璃冰中的分离颗粒中可能是有序的（图1).

3.使用单粒子EM研究NCP相互作用体

只有少数染色质结合蛋白–NCP结构已由X射线晶体学测定（Barbera等。, 2006; 马克德等。, 2010; 阿玛奇等。, 2011; 麦金蒂等。, 2014; 吉里什等。, 2016; 摩根等。, 2016; 方等。, 2016; 周等。, 2015). 迄今为止，所有结构都利用NCP表面的多种元素来获得核小体特异性和亲和力，以多价方式参与。可以赋予多价通过同一域中的多个联系人。对于Rcc1和Sir3-BAH1结构域的已知晶体结构（Makde等。, 2010; 阿尔诺多等。, 2013; 阿玛奇等。, 2011). 或者，通过将不同染色质结合域遗传链接到同一蛋白质复合体中的单个多肽或多个阅读域，可以建立与NCP的协同结合。事实上，在多个蛋白质中发现了tandem相邻的组蛋白代码识别模块（Rutenburg等。, 2007; Ng&Cheung，2016年; 塔维纳等。, 2007). 有趣的是，许多核小体结合物利用组蛋白H2A和H2B残基之间形成的高负电荷区，称为酸性斑（图1). 迄今为止，所有酸性斑块相互作用物中都描述了一种常见的精氨酸锚定基序（McGinty&Tan，2016）; 麦金蒂等。, 2014).

在低温电子显微镜的“分辨率革命”之前，核小体复合物的单粒子研究分辨率有限（>20º；阮（Nguyen）等。, 2013; 查班等。, 2008; 沙拉瓦纳等。, 2012; 托西等。, 2013; 山田等。, 2011; 奇图鲁鲁等。, 2011). 虽然只有整体的结构域组织可以用这样的分辨率来描述，但这些研究对于首次了解大型柔性分子机器如何重塑DNA上的核小体具有重要意义。一系列说明性EM研究探讨了H2A组蛋白变体H2AZ交换的机制，该交换是由INO80和SWR1染色质重塑复合物的相反作用所催化的。这两种复合物都是高度动态的，超过1 MDa。EM结构显示，这些复合物具有共同的结构，具有一个大的AAA+ATP酶头部和一个由不同的多肽（渡边等。, 2015). 阴性EM显示INO80发生构象变化，将NCP夹在Arp8尾结构域和ATP酶头结构域之间（Saravanan等。, 2012; 托西等。, 2013). 相比之下，SWR1与NCP的接触更加有限，NCP只有一个表面主要由催化SWR1亚基（Nguyen等。, 2013). 这一观察结果可能解释了INO80和SWR1的不同功能活性：虽然两者都可以驱逐和替换H2A变体，但只有INO80可以沿着DNA滑动NCP。

RSC染色质重塑器促进核小体易位，并包含一个预制腔以与NCP结合（Asturias等。, 2002). RSC–NCP的冷冻电镜研究显示，RSC腔中心的组蛋白八聚体（Chaban等。, 2008). 观察到核小体DNA密度较低，这表明RSC结合导致DNA与八聚体部分分离，形成允许DNA移位的环。一项单独的研究使用低温电子显微镜结合X射线晶体学来表征ISW1a重塑复合物（山田等。, 2011). 缺少催化ATP酶结构域的ISW1a核心的晶体结构揭示了与两股DNA的不对称结合模式。双核体的24Å分辨率冷冻电镜结构显示，ISW1a的DNA结合部分位于很好的位置，可以识别DNA从NCP的进入和离开，并有助于定义核小体之间的间距，起到直接分子标尺的作用。

最近，已经确定了NCP-染色质结合蛋白复合物的许多亚纳米级再溶解结构（Maskell等。, 2015; 佐克等。, 2016; 徐等。, 2016; 威尔逊等。, 2016; 图2). 在<9°范围内的局部分辨率下，二级结构元件(α-尤其是螺旋）更容易解析，允许可用的原子坐标对接，并在大分子组装中可靠定位功能域。此外，可以清楚地观察到DNA双螺旋的转动，为建立低温电子显微镜图的利手性提供了工具。因此，这些研究使我们能够更深入地了解从NCP修饰和识别到病毒DNA整合等更多样的生物过程。

图2 近纳米和亚纳米NCP–相互作用体EM结构。EM密度图在中显示和分割加州大学旧金山分校Chimera文本中注释的关键域突出显示，NCP二元结构的位置用箭头标记。(一)PFV入口–NCP结构（EMD条目2992；Maskell等。, 2015). (b条)NuA4乙酰化酶–NCP结构（EMD条目9536；Xu等。, 2016). (c（c）)53BP1–NCP-ubme结构（EMD条目8246；威尔逊等。, 2016). 左插图：UDR泛素-NCP与泛素相互作用的放大图，符合密度（PDB条目1个大学). (d日)Chp1色域–NCP-me结构（EMD条目8063；Zocco等。, 2016). (e（电子）)12-mer染色质纤维（EMD条目2600；Song等。, 2014). 左边的插图突出显示了一个核小体，并对其关键特征进行了注释。这个晶体结构NCP（戴维等。, 2002; PDB条目3lz0个)符合低温电磁密度。

与NCP结合的原型泡沫病毒入口体的结构表明，导致逆转录病毒整合的靶向标记捕获发生在完整核小体的背景下，并解释了为什么NCP优先于裸DNA作为整合底物（Maskell等。, 2015). 核小体DNA上的两个独立位点被整合酶识别为与NCP二联体相对的位置。整合位点通过涉及一个H2A–H2B二聚体的许多蛋白质接触来稳定（图2一). 在这里，核小体DNA被提起和解开，以允许进入整合酶催化核心。核小体DNA是否在整合后重塑尚待确定。二次对接位点涉及整合酶与NCP DNA中第二回的接触（图2一). 整合酶中NCP接触元件中的氨基酸取代会影响整合效率体外以及细胞中的病毒整合景观（Maskell等。, 2015).

芽殖酵母Tip60–NuA4复合乙酰化物H4调节转录和DNA修复（Doyon&Cóté，2004）). Xu和同事对截短的四亚单位NuA4复合物的多晶体结构进行了补充，确定了与NCP（Xu）复合物中NuA4核心的交联7.9μ分辨率结构等。, 2016; 图2b条). 该结构揭示了低特异性乙酰化酶如何仅修饰组蛋白H4的N末端尾部中的赖氨酸：NuA4复合物与核小体表面结合，将催化的Esa1亚基定位在H4尾部上。为了建立这种优雅的空间识别模式，NuA4复合体与NCP形成广泛接触，主要是通过重组Epl1亚单位，结合双相邻DNA和NCP酸性斑块。Esa1中的一个半柔性Tudor结构域被对接到接近催化参与的Esa HAT结构域的密度中，与核小体DNA非常接近。有趣的是，完整的NuA4复合物包含染色质阅读器结构域，这些结构域在本研究中不存在，但需要直接进行组蛋白乙酰化（Steunou等。, 2016). 这些额外领域如何在NCP中相互作用仍是一个尚未回答的问题。

4.使用冷冻电镜研究组蛋白修饰

NCP被广泛的翻译后修饰修饰，直接控制DNA的可及性和与特定相互作用体的结合。反过来，这些组蛋白结合因子可以改变染色质的结构特性，帮助协调细胞中与DNA相关的过程。现有的晶体结构集中于与短段修饰肽结合的孤立结构域。事实上，很明显，许多蛋白质对染色质的亲和力高于从简单的结合事件到短线性初级序列的预期。许多研究表明，在NCP的背景下分析修饰染色质相互作用具有重要意义（Xu等。, 2016; 巴特克等。, 2010; 尼科洛夫等。, 2011; Ng&Cheung，2016年). 这表明染色质蛋白与核小体表面多价结合的共同主题也延伸到以“组蛋白密码”形式识别翻译后修饰的NCP。大多数翻译后修饰是在无序组蛋白尾部发现的，关于共价修饰如何影响NCP的结构信息很少。

生产大量修饰的NCP是一项具有挑战性的任务，这阻碍了我们对组蛋白密码结构理解的快速进展。泛素化已被证明是对结构研究所需的大规模生产的一种易处理的改进（Machida等。, 2016; 摩根等。, 2016)，部分归功于生物化学的进步（Faggiano&Pastore，2014). Morgan及其同事利用多种化学方法生成含有H2B Lys-120ub（Morgan等。, 2016). 3.8º分辨率晶体结构结合到NCP-H2BK120ub的SAGA DUB模块有助于解释多亚单位DUB如何直接靶向去除染色质中的这种修饰。另一个挑战是底物上大泛素蛋白修饰的固有灵活性，这阻碍了泛素修饰的完整模型构建和定位（Machida等。, 2016; 摩根等。, 2016; 威尔逊等。, 2016; 锂等。, 2017).

最近的一项研究揭示了多重翻译后修饰和NCP表面如何结合以赋予染色质结合成分特异性和亲和力。53BP1是一种关键的DNA损伤反应因子，与DNA双链断裂的修复有关（Panier&Boulton，2014)并通过识别H4尾部的甲基标记（H4K20me2）和DNA损伤诱导标记：H2A-Lys15泛素化（H2AK15ub），招募到DNA损伤相邻染色质。53BP1的短片段足以招募到细胞中的DNA损伤部位，并包含H4K20me2相互作用的串联Tudor结构域（Botuyan等。, 2006)和一个短区域，称为泛素依赖性招募区域（UDR；Fradet-Trucotte等。, 2013).

结合到甲基赖氨酸类似物和泛素化NCP的53BP1的4.5μl分辨率低温-EM结构表明，53BP1与组蛋白尾甲基化和泛素修饰以及核小体表面本身形成直接接触（Wilson等。, 2016; 图2c（c）). 采用化学方法在组蛋白H4 Lys20上创建二甲基赖氨酸类似物。串联Tudor结构域结合仅限于修饰的H4组蛋白尾部；重组后的图谱在H4尾部的密度较弱，同时分辨率也较差，这表明与NCP表面没有稳定联系的柔性结合。有序的肽UDR在NCP表面上蜿蜒，夹在核小体和泛素之间，将泛素固定在受限构象中。泛素识别是通过UDR、组蛋白表面和限制性泛素（折叠在NCP表面上）之间的相互作用获得的。这种识别模式有助于解释53BP1对H2AK15ub的位点特异性。UDR的密度足以建立该片段的模型，序列注册由互补生物化学和交联推断。这表明先前确定的关键53BP1残基（Fradet-Turcotte等。, 2013)直接与泛素相互作用，而UDR中的一段基本残基与H2A–H2B酸性斑块以类似于其他酸性斑块相互作用蛋白的方式相互作用。

Cryo-EM用于确定裂变酵母Chp1的色域如何读取异色H3K9me3标记（Zocco等。, 2016; 图2d日). 通过整合Chp1色域（Schalch等。, 2009)由于Chp1与甲基化NCP的配合物具有10μl分辨率的低温结构，Chp1-binding模块位于NCP核心上方，而不是靠近H3N末端尾部。基于这一分配，Chp1模块准备接触酸性斑块、H4尾部和组蛋白H3的核心。作者建议，识别H3K9me3尾巴需要尾巴在进入Chp1结合位点之前向NCP核心回环，与NCP表面正交。

5.用低温电子显微镜分析染色质复合物的结构灵活性

在低温电子显微镜中，将蛋白质快速冷冻到玻璃冰中，希望能重现蛋白质在溶液中的状态。事实上，同一大分子组装的一组不同构象状态可以从EM数据集中分离出来生物信息学。标称报告分辨率反映了从整个三维结构得出的全局估计。由于单粒子平均的性质电子显微镜，EM结构可以跨越很大的分辨率范围，提供结构化核心的高分辨率信息以及粒子外围构象变化的信息。因此，在比较EM和晶体结构时，应注意估计分辨率的方法本质上是不同的。EM图的局部分辨率可以通过以下公式计算ResMap（重新映射）（库克尔比尔等。, 2014)，允许直接量化局部地图分辨率的波动。这些数据可以以热图的形式显示，不仅可以在结构内部进行比较，还可以在具有可比分辨率的结构之间进行比较，通常可以提供重要的机械见解。

例如，该工具已被证明有助于比较在同源结合伙伴53BP1（Wilson等。, 2016). 这项分析表明，NCP上的泛素具有高度的运动性，仅限于栓系通过与组蛋白H2A尾部共价连接。然而，当53BP1结合到修饰的NCP复合物上时，共价连接的泛素的明确顺序似乎很明显（图2c（c）).

局部分辨率分析可以用来描述核小体DNA的灵活性。在最近确定的结构中，与组蛋白相比，DNA的分辨率稍差，这表明DNA表现出了一定程度的灵活性（Chua等。, 2016; 威尔逊等。, 2016).

6.使用低温电子显微镜成像高阶染色质结构

早期对部分未折叠染色质的旋转阴影EM研究揭示了由连接DNA连接的规则间隔的NCP阵列的特征性“珠上串模式”（Thoma&Koller，1977). 如何在每个人类细胞的细胞核中进一步压实2米以上的DNA，一直是研究的重点。高阶染色质可能以多种混合状态排列（Kuznetsova&Sheval，2016）). Cryo-EM有助于揭示染色质致密的一种模式，即“30纳米纤维”是如何发生的。可以使用体外与连接蛋白组蛋白孵育的重组核小体阵列（Song等。, 2014)与细胞中观察到的类似（Scheffer等。, 2011; 锂等。, 2015; Finch&Klug，1976年).

Song及其同事观察到通过添加连接组蛋白H1.4形成的12个定位NCP的交联原纤维（Song等。, 2014; 图2e（电子）). 结构（分辨率为11º）表明，纤维形成了一个左手双螺旋，由连接体DNA桥接的锯齿状NCP。这种30纳米纤维的结构与四核小体提出的“两部分模型”非常吻合晶体结构，通过直接连接体DNA在两个相邻的NCP堆栈之间架起桥梁（Schalch等。, 2005). 有趣的是，纤维并没有形成连续的螺旋。相反，四核体单元相互叠加，音调发生变化，形成螺旋图案。多个NCP内部的相互作用是可见的；H2A–H2B四螺旋束由四聚体单元内相邻的NCP形成。在四聚体单元之间，一个组蛋白H4的尾部投射到相邻NCP的H2A–H2B酸性斑块，桥接了一个更大的间隙。值得注意的是，这种排列概括了在单个NCP结构的晶体堆积中看到的相互作用（Luger等。, 1997). 组蛋白H1.4的密度位于纤维中每个NCP的二分体附近；不对称地放置在DNA二元体附近，以与退出和进入DNA相互作用。这种不对称性赋予纤维极性，核小体之间的H1–H1二聚体相互作用稳定四核小体单位。改变连接体DNA的长度可以改变纤维的直径和高度，而不会影响结构中的整体堆叠。有趣的是，一个替代连接体组蛋白的后续结构，组蛋白H5，与NCP结合（周等。, 2015)有助于解释观察到的染色质纤维折叠的不同拓扑结构（罗宾逊等。, 2006). H5与NCP对称结合，导致连接器DNA的不同轨迹，并可能改变纤维结构。

7.未来展望

我们目前缺乏对大多数染色质结合蛋白如何与核小体DNA相互作用的分子理解，因此需要对染色质进行研究上部结构令人兴奋的新兴领域。Cryo-EM是结构生物学家工具包的重要补充，将使我们能够可视化以染色质为中心的日益复杂的生物系统。事实上，正如我们所概述的，低温电子显微镜提供了一种独特的工具来帮助研究以前难以处理的核小体结合因子。与其他结构生物学技术不同，低温电子显微镜中大分子的可视化仅受其生化形成、稳定性和在显微照片中识别粒子方向的能力的限制。然而，优化低温电子显微镜中的网格冻结和成像条件仍然是一项艰巨的任务，阻碍了高通量结构测定目前。

尽管低温电子显微镜技术取得了重大进展，但冷冻水合NCP的原子分辨率结构仍有待实现。迄今为止，与NCP结合的EM结构使用了混合方法，将高分辨率碎片对接到高阶结构中，以解释低温EM密度。这种方法允许在残留水平上进行推断，这可以在生化或细胞生物学环境中进一步验证。肽骨架和二级结构特征的模型构建可以在4º范围内的分辨率下进行；然而，该模型仍需要大量的下游验证，以确保实现正确的序列寄存器。随着更快的图像处理技术的出现，更廉价的高端显微镜的使用，以及对该技术的重新兴趣，我们很可能进入染色质生物学分子理解的黄金时代。