1.简介
现在,大分子晶体的大多数结构都可以通过以下方法来解决分子替换。然而,在缺乏合适的同源模型的情况下,实验相位是克服晶体结构的选择方法相位问题。这种方法需要测量当将X射线的波长调谐到与结构结合的原子的吸收边缘时产生的微小异常差异。最成功的标记是硒,用硒代蛋氨酸取代氨基酸蛋氨酸。然而,这项技术并不是通用的,因为它不适用于所有的表达系统,即使可以产生标记蛋白,在某些情况下结晶也会失败。
天然硫单波长异常衍射(S-SAD)方法可以通过利用硫的固有异常信号来克服这一问题。在过去的几年里,一些研究已经证明了这种方法对日益复杂的问题的适用性(刘等。, 2012; 韦内特等。, 2015; El Omari公司等。2014年; 玫瑰色等。, 2015). 在标准实验装置上,通常针对硒周围的波长进行优化K(K)边缘(λ=0.97Å),并在空气中操作,在1.7–2.3Å的波长范围内进行S-SAD实验。波长选择主要受到空气散射增加的背景噪声、空气吸收减少的信号以及探测器尺寸的限制,因为以恒定分辨率测量数据所需的衍射角随波长增加。为了测量微小的异常信号,来自衍射良好的晶体的高冗余数据或来自多个晶体的合并数据同质晶体都是必需的。硫磺K(K)边缘位于λ=4.96º,异常信号随着波长的立方体向边缘移动而近似增大。钻石光源的新长波长MX光束线I23旨在为本地SAD实验提供一个优化的环境,使更长波长的实验能够以最小的噪声增加异常信号(Wagner等。, 2016).
氰杆菌素是一个核糖体合成和翻译后修饰的家族肽类(RiPPs;阿尼森等。, 2013)来自蓝藻。每种产品都是使用一组选定的酶来生产线性或大环的肽类(西沃宁等。, 2010). 髌板通路(Schmidt等。, 2005)是最具特征的途径。髌酰胺生物合成的第一步是通过杂环酶PatD使半胱氨酸、苏氨酸和丝氨酸依赖ATP脱水,分别形成噻唑啉、甲基恶唑啉和恶唑啉(图1). 在这种环化水合作用之后,N-末端被PatA蛋白酶域切割,随后被PatG的大环化酶域大环化。杂环酶(环状脱水酶;Koehnke)的结构已经确定等。, 2013, 2015),蛋白酶(豪森等。, 2012; 阿加瓦尔等。, 2012),戊基转移酶(Bent等。, 2013),未知函数的保守域(Mann等。2014年)和宏环化酶(Koehnke等。, 2012; 阿加瓦尔等。, 2012)来自各种氰杆菌途径的蛋白质。髌板簇中唯一尚待解决的酶功能是依赖FMN的氰杆菌唑啉氧化酶。氧化酶将噻唑啉转化为噻唑啉,一些酶也能将恶唑啉氧化为恶唑(图1,表1). 氧化酶结构域在髌骨样途径中作为G蛋白的融合结构域或作为一个独立蛋白质而保守(Martins&Vasconcelos,2015)); 例外的是树干酰胺途径,在该途径中,最终化合物不被氧化。
酶 | 带保险丝/独立 | 天然产品含有 | 生物体/生物合成途径 | PatGox公司 | 熔断,PatG的一部分 | 噻唑类、恶唑啉类 | 前氯代烷sp./帕特拉酰胺类 | ThcOx公司 | 独立 | 噻唑类、噻唑啉类、恶唑啉类 | 氰藻纲PCC 7425/氰硫酰胺 | ThcOx2型 | 独立 | 噻唑类、噻唑啉类、恶唑啉类 | 氰藻纲PCC 7822(合同专用条款) | TriOx公司 | 独立 | 噻唑类 | 红海束毛藻ISM101/三甲酰胺 | McaGox公司 | 熔断,McaG的一部分 | 噻唑类、恶唑类 | 铜绿微囊藻NIES-298/微环酰胺 | 艺术Gox | 融合,ArtG的一部分 | Thiaozles公司 | 螺旋藻节旋藻/关节螺酰胺类 | LynGox公司 | 熔丝,LynG的一部分 | 噻唑类 | Lyngbya aestuarii公司CCY9616/依司他胺 | TenGox公司 | 保险丝,TenG的一部分 | 噻唑类、恶唑类 | 海绵体念珠菌变量。时态/替奴环酰胺 | | |
| 图1 在氰杆菌素中形成噻唑和恶唑的两步工艺的合成示意图。初始步骤是ATP依赖性的PatD反应,形成噻唑啉和恶唑啉,然后由PatGox进行FMN依赖性氧化,生成噻唑。注意,在相关途径中,恶唑啉也被氧化成恶唑环。 |
在这里,我们介绍了ThcOx,这是第一个在金刚石光源(Wagner)光束线I23上通过真空长波大分子晶体成像解决的新结构等。, 2016)以及随后通过分子替换解决的高分辨率结构。
2.材料和方法
2.1. ThcOx基因的克隆、表达和纯化
从培养的gDNA中扩增出ThcOx基因氰藻纲从巴氏蓝藻培养物(巴黎)中获得的sp.PCC 7425,并用N末端亚克隆烟草蚀刻病毒(TEV)可清除蛋白酶His6标记后接一个四甘氨酸连接子进入来自DNA2.0的pJexpress 401载体(表2). 它表达于大肠杆菌BL21(DE3)细胞在添加50µM(M)核黄素在20°C下放置48小时。将细胞沉淀重悬于裂解缓冲液加上不含EDTA的蛋白酶抑制剂片剂(Roche)和DNase中,每克湿细胞沉淀重悬0.4mg。再悬浮液通过207 MPa下的细胞破碎器进行溶解(恒定系统)。通过离心(40000克,4°C,20 min),然后加载到Ni-Sepharose 6快速流动柱(GE Healthcare)上,用裂解缓冲液进行平衡[150 mM(M)氯化钠,20米M(M)Tris–HCl pH值8.0,20 mM(M)咪唑pH 8.0,50µM(M)黄素单核苷酸(FMN),3 mM(M) β-巯基乙醇(BME)]。用裂解缓冲液清洗色谱柱,然后用洗脱缓冲液(150 m)洗脱ThcOxM(M)氯化钠,20米M(M)Tris–HCl pH值8.0,250 mM(M)咪唑pH 8.0,50µM(M)FMN,3米M(M)BME)。然后将蛋白质通过脱盐柱(16/10脱盐,GE Healthcare)送回裂解缓冲液。以1:10的质量比添加TEV蛋白酶,并在20°C下消化蛋白质2 h,以去除His6标签。然后将样品加载到裂解缓冲液中的第二个镍柱上,并直接加载到离子交换柱(HiTrap Q Sepharose FF,GE Healthcare)上,用0.15-1洗脱M(M)NaCl梯度。然后将峰分数浓缩至7.5 ml(Vivaspin浓缩器,30 kDa分子量截止值),并应用于与凝胶过滤缓冲液(150 m)平衡的Superdex 200凝胶过滤柱(GE Healthcare)上M(M)氯化钠,10米M(M)HEPES pH 7.4,1米M(M)TCEP)。凝胶过滤缓冲液中缺乏FMN,洗脱部分保持黄色,证实FMN确实与蛋白质结合。将蛋白质浓缩至4 mg/ml−1用于结晶学。通过SDS-PAGE分析确认蛋白质的纯度,并通过质谱法(MS)。
源生物 | 氰藻纲从巴氏蓝藻培养物收集(巴黎)中获得的sp.PCC 7425 | DNA来源 | 从培养物中提取的gDNA氰藻纲sp.PCC 7425,在BG-11介质上,具有12小时光周期/12小时暗周期。在培养4周后,在新鲜培养基上制备亚培养物。 | 表达式向量 | pJexpress 401(DNA2.0) | 表达式宿主 | 大肠杆菌BL21(DE3) | 所产生结构的完整氨基酸序列† | MHHHHHHENLYFQ\GGGMLDLFTLSFSPDLSIASEAEQLTLQSKDDRLILEHPQPGLRTALEQLKQGNLTLAQLTELVSEQDGVEAGITFASELEKLVDLGWICHSVLPLITAIPIAKDYELNVPDSWQTTAIALSRFAFLHQDLQQLVLESPRSKSKLVGAVIAKLAQSDRFATSATSADSLADLSLEELKRLFALLIATQMMDLEEDETITQWKFHYTRLGRLDNSRKLNLPVFEHRDRYPYVKPVISTQAIPLVKPDLTALATTDMTLTEARSIRRSIR EYSDQPITLAQLGEFLYRCARVKAVYTLPEDPMQVGESTTRPYPSGGAL公司YELEIYPLVHQCGDLAAGLYYQPLSHTLHVPVADPEVESVLVYDAWRATGQSIPQIVLIITARFGRLFWKYHDIAYSLILKVHVLYQTFYLVATAMQLAPSAIGANTTKFCQIAGLNPDEEASVGEFSLGAAKPQQQQS | | †烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶裂解点标记为\。 |
2.3. 数据收集、处理和阶段划分
最好的ThcOx晶体在石蜡油中进行低温保护,然后在同步加速器上直接闪速冷却,或者冷却并运送到同步加速器。晶体显示出高度的非同构性,衍射分辨率在4.0到2.65º之间(图2b条和2c(c)). 为了通过以下方式确定蛋白质结构的相位分子替换,几次尝试都失败了,使用的蛋白质如推测的硝基还原酶来自变异鱼腥藻(PDB条目第三届奥运会7)和嗜中性拉斯顿氏菌(PDB条目3小时9)均由结构基因组学联合中心(JCSG)保存。我们一直无法在天然或替代结晶条件下结晶蛋白质的硒代蛋氨酸变体。制备了一系列重原子浸泡液,包括溴化钠、醋酸铅(II)、四溴铂酸钾(II),碘化钠和碘化钾,但这些浸泡液均未成功获得相。去除His后,ThcOx蛋白总共包含10个S原子6标签(表2). 共有477个氨基酸残基,在2.0Ω波长下的Bijvoet比率为0.98%。我们尝试通过S-SAD定相来解决该结构,使用在1.54º波长下收集的内部数据,或使用在1.77º波长收集的数据在钻石光源的光束线I02上收集的数据,这两种方法都失败了,因为这些波长的异常信号很低。
因此,我们使用新型长波真空束线I23及其定制检测器来研究长波长相移的使用。3.1º的波长似乎是异常信号增加和数据质量下降之间的良好折衷,因为较长波长的样品吸收更大。在该波长下,Bijvoet比率为2.1%,是1.77Å波长下的2.5倍多。由于晶体之间存在较大的可变性,在找到合适质量的晶体之前,必须将48个晶体转移到光束线真空终端。最佳晶体衍射到3.15º的分辨率极限。数据是用大型真空PILATUS 12M探测器(Dectris,Switzerland)在波长3.1Å、0.1°振荡和0.1 s曝光时间下收集的。共有4000张图像在反相机模式下测量,楔形尺寸为20°,随后进行处理和缩放XDS公司/XSCALE公司(卡布施,2010年). 没有进行额外的吸收校正。这个下部结构由确定SHELXD公司(谢尔德里克,2010年)在搜索18个站点时,分辨率截止值为4.2º,成功率为1000次测试中命中一次。使用此下部结构, 自动扫描(特威利格等。, 2009)发现了非晶体学对称性,并在密度修改后,自动建模将大约20%的氨基酸残基放置在质量足够高的电子密度图中,以允许手动建模。反常测量的准确性可以在相位反常差分图中看到,该图显示了S原子的强峰值(图3).
| 图3 相位异常差(F类+−F类−)该图显示了使用3.1º波长在光束线I23上收集的异常差测量值的准确性。地图是围绕含硫残留物绘制的(一)蛋氨酸和(b条)半胱氨酸为3.5σ使用最终(高分辨率)结构作为搜索模型,从分子置换溶液中计算相。(图像来自PyMOL公司.) |
该初始模型经过改进,然后用作搜索模型分子置换解决之前在钻石光源光束线I02上采集的高分辨率数据集。高分辨率数据经过处理并按比例放大夏2(2010年冬季)使用XDS公司(卡布施,2010年)和标量(埃文斯,2006年). 使用以下公式确定结构相位器(麦考伊等。2007年)作为中央处理器4套(Winn等。, 2011). 所有数据收集统计数据见表4.
衍射光源 | 钻石光源光束线I23 | 钻石光源光束线I02 | 波长(Ω) | 3.096 | 1.771 | 温度(K) | ∼50† | 100 | 探测器 | 皮拉特斯12M | 皮拉特斯6M | “空间”组 | P(P)41212 | P(P)41212 | 一,b条,c(c)(Å) | 111.4, 111.4, 217.6 | 109.3, 109.3, 195.4 | α,β,γ(°) | 90, 90, 90 | 90、90、90 | 分辨率范围(Ω) | 217.55–3.15 (3.37–3.15) | 72.84–2.65 (2.72–2.65) | 反射总数 | 575020 (86233) | 285753 (21726) | 独特反射次数 | 22295 (3452) | 35204 (2542) | 完整性(%) | 91.6 (80.6) | 100.0 (99.6) | 异常完整性(%) | 92.1 (81.4) | 100.0 (99.6) | 多重性 | 25.8 (25.0) | 8.1 (8.5) | 〈我/σ(我)〉 | 28.8 (2.3) | 17.9 (2.7) | R(右)测量 | 0.077 (1.617) | 0.089(0.890) | 总体B类Wilson图中的因子(λ2) | 121 | 60 | | †精确的温度校准仍有待改进;该值基于角度计头处44K的温度,假设通过样品支架的温度上升约6K。 |
4.讨论
我们报道了一种来自氰杆菌途径的氧化酶蛋白的第一个结构。结构由钻石光源新I23光束线上的本地S-SAD相位确定。使用3.10º的波长测量足够大的异常信号,以从衍射到3.15º分辨率的晶体中实验确定ThcOx结构的相位,有用的异常数据仅扩展到4.2º分辨率。这些分辨率限制传统上不利于通过原生S-SAD进行相位确定,特别是考虑到非对称单元(总共954个残基的二聚体),S原子相对较少。此外,由于非同构,无法将阶段扩展到更高分辨率的数据集,这要求分辨率为3.15°的初始阶段必须具有足够的质量,才能进行模型构建。因此,ThcOx对I23波束线和成功的结构确定验证其性能。
这个结构确定展示了新型真空长波长MX光束线I23的巨大潜力。真空采样环境与大型半圆柱形PILATUS 12M像素混合探测器相结合,可以在最小背景下进行非常准确的测量,在标准MX光束线通常无法达到的波长范围内提供非常高的信噪比。这种新的束线应能显著扩大蛋白质晶体的范围,使其适合于天然S-SAD结构的测定。
致谢
我们感谢钻石光源提供光束线I23的接入。我们还感谢托马斯·索伦森及其工作人员访问并支持光束线I02。本研究得到了英国生物技术和生物研究理事会(编号BB/K015508/1;JHN和MJ)和欧洲研究理事会(代码339367;JHN和MJ。生物医学科学研究中心进行了质谱分析质谱法以及圣安德鲁斯大学蛋白质组学设施,由Wellcome信托基金资助(赠款编号:094476/Z/10/Z和WT079272AIA)。JHN是英国皇家学会沃尔夫森功绩奖得主,四川大学1000名人才学者。
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