1.简介

蛋白质数据库（PDB；Berman）中存放的大分子晶体结构数量不断增加等。, 2007)这些蛋白质折叠的数量不断增加，并且出现了更敏感的方法（麦考伊等。, 2007; Read，2001年; 迪迈奥等。, 2011)意味着分子置换（MR）是大分子晶体学（MX）中结构溶液的主要选择。然而，未知折叠的生物大分子和大型蛋白质-蛋白质或蛋白质-核酸复合物的晶体结构的溶液仍然经常需要实验相测定。大多数实验从头开始 结构测定经常利用反常散射 通过多波长反常色散（MAD；史密斯，1991年; 亨德里克森，1991年)或单波长反常色散（SAD；赖斯等。, 2000; Dauter，2002年; 多泰等。, 2002)技术。可调谐同步加速器束线的几乎连续发展促进了此类实验，在这种束线上，实验人员能够准确测量几乎任何可引入晶体的反常散射体的吸收边缘，并收集这些散射体周围不同能量的衍射数据，以优化反常和色散信号。

当在单个低温冷却晶体上进行MAD和SAD实验时，原则上克服了可能困扰的非同构问题同晶置换实验。然而，在异常信号较小的实验中(即悲伤；亨德里克森和蒂特，1981年; 多泰等。, 1999; Liu&Hendrickson，2015年; 韦内特等。, 2015)必须注意减少系统误差，尤其是由辐射损伤引起的误差。在MAD/SAD实验中，辐射损伤加剧，因为它不仅会导致X射线吸收剂量的降低（Seltzer，1993）; 霍尔顿，2009)在晶体衍射的分辨率中，它还导致特定的化学损伤，包括二硫键断裂（Weik等。, 2000; 莱罗斯等。2001年; 恩尼法尔等。, 2002)，电子状态的变化（Berglund等。, 2002; 施利希廷等。, 2000)而且，非常重要的是，减少异常散射体的“占用”（拉马戈帕尔等。, 2005; 埃文斯等。, 2003; 拉韦利等。, 2005). 此外，上述类型的特定辐射损伤可能已经在远低于加曼极限的剂量下发生（欧文等。, 2006). 有时，辐射损伤的影响可以用于实验者的优势，如辐射损伤诱导相位调整（RIP；Ravelli等。, 2003; de Sanctis&Nanao，2012年)或在重原子占用减少的模型中（Schiltz等。, 2004). 然而，在系统的基础上使用这种方法往往有局限性，除非是有意的，否则建议尽可能减少辐射损伤。在这里，我们简要描述了旨在减少MAD/SAD实验期间系统误差和辐射损伤的数据收集策略，并描述了如何在ESRF结构生物学束线中最佳地实施这些策略。

2.ESRF MAD结构生物学光束线

ESRF运行三个可调谐波长端站，每个端站的能量范围为6–20keV:ID23-1（Nurizzo等。, 2006)，ID29（德桑克提斯等。, 2012)和ID30B（Mueller-Dieckmann等。, 2015). 这三个观测站配备了类似的衍射仪MD2（一种微衍射仪；法国莫伊兰斯的阿里纳斯；佩拉基斯等。, 1999)、MD2M（法国莫伊兰斯Arinax的微衍射仪）和MD2S（法国莫伊兰斯Arinax的微衍射筛选仪），均具有轴上样品可视化功能。ID23-1和ID29在样品位置有一个固定的焦点尺寸，并配备有光束定义孔，允许将X射线束尺寸裁剪为直径至少为10µm的尺寸（图1). ID30B在20至200µm的采样位置提供可变光束大小。所有三个终端站共享相似的数据收集几何结构(ω用于水平和垂直于X射线束进行振动扫描的轴），并配备MK3微型卡帕测角仪（布罗克豪斯等。, 2013)用于晶体重新排列和荧光探测器，用于测量吸收边缘扫描，点击按钮即可进行，并使用自动分析CHOOCH公司（Evans&Pettifer，2001年)用于确定反常散射周围的因素吸收边“峰值”和“拐点”能量的结束和。

图1 ESRF ID29上示例环境的特写视图。测角仪电机和主要部件均贴有标签。

3MXCuBE公司2概念

ID23-1、ID29和ID30B实验的用户控制与MX的所有ESRF设施一样，通过这个MXCuBE公司2 (网址：https://www.esrf.eu/mxcube2和https://github.com/mxcube网站)图形用户界面（GUI），其全部功能将在别处展示（奥斯卡森等。，准备中）。简要地，MXCuBE公司2，继承人MXCuBE公司（加巴丁霍等。, 2010)，旨在简化MX实验的规划和执行通过一个单一、集成和直观的界面，通过最小化容易出错的迭代人工干预，方便了使用详细的数据收集策略进行实验。以下两个主要方面MXCuBE公司2个与实验开发相关反常散射在里面从头开始 晶体结构决心：首先，MXCuBE公司2依靠“保存位置”的概念从任何给定样本中收集数据（图2). 可以为每个保存的位置分配一系列数据集合，以构建任何复杂的数据收集方案。其次MXCuBE公司2数据收集队列可以预先填充专家实验描述符，例如EDNA公司（因卡多纳等。, 2009)和工作流程（Brockhauser等。, 2012)自动化数据收集和分析。

图2 (一)的详细信息MXCuBE公司2接口。激活的中心位置用石灰标记，其他保存的位置用黄色标记。要激活保存的位置，点击它就足够了，并且可以同时激活多个位置。(b条)的队列详细信息MXCuBE公司2.在所示示例中，将采集一个双波长MAD（峰值和拐点）数据集，每个数据集从样品1:5 FAE-g5的不同保存位置采集。

4.实施的良好数据收集实践MXCuBE公司2

4.1. 数据收集策略的计算

计算合适的数据收集策略是晶体学家所传的“良好实践”之一（Dauter，1999）; 弗洛特等。, 2006). 通常，目标是确定最小角度范围和方便的振荡范围（切片），并确保收集到具有所需多重性的完整数据。为了确保计算ESRF MX波束线的最佳数据收集策略EDNA公司管道（Incardona等。, 2009)已使用通过这个MXCuBE公司2“角色化”选项卡DNA（莱斯利等。, 2002),EDNA公司是为了利用软件的发展而开发的，例如标签（绍特等。, 2004),最佳（布伦科夫和波波夫，2010年)和放射性核素（Paithanar和Garman，2010年)制定考虑到全球辐射损害的数据收集策略。晶体对称性由两个或四个衍射图像确定，使用标签或MOSFLM公司; X射线剂量的计算单位为放射性核素假设“平均”晶体成分，使用入射光束的能量，光子通量和梁尺寸，由自动提供MXCuBE公司以及研究中晶体的尺寸（图3). 该剂量随后用于最佳提出衍射计划，该计划以新数据收集的形式添加到MXCuBE公司2队列（图2). 可以使用专用工具从样本视图直接测量晶体尺寸，该工具可以将以像素为单位测量的长度转换为微米。用户还可以指定其对数据收集的要求，例如首选角度范围或期望的多重性，请求“异常策略”（Bourenkov&Popov，2010; 图3b条)如有必要，修改建议策略的参数。针对以下目的的实验从头开始结构解决方案中，通常建议收集高度冗余的数据，当要利用微弱的异常信号时，这变得更加相关（Dauter&Adamiak，2001; Cianci公司等。, 2008; 阿基等。2014年; 韦内特等。, 2015; Liu&Hendrickson，2015年).

图3 (一)MXCuBE公司2显示光子通量以每秒光子数表示的对样本的入射。更改光束定义光圈时会调整该值。该值和梁尺寸为EDNA公司在计算数据收集策略时，允许估计晶体上沉积的剂量率。(b条)面板用于EDNA公司特征描述。除了数据路径和文件名信息外，用户还可以调整数据收集的复杂性（如最佳; Bourenkov&Popov，2010年)，通过选择“优化SAD”（Bourenkov&Popov，2010)并指定晶体尺寸和空间组，如果已经知道。(c（c）)反向光束是作为“标准数据采集”的附加选项提供的，其中定义了构成两个待采集数据集的每个子边缘（在本例中为十个）的帧数。(d日)交错MAD工作流程界面：最多可以交错四种能量，并且可以选择将帧记录在反向光束几何体中。(e（电子）)的工作流接口κ-角度重新定向：异常策略旨在将一条平行于ω。可能κ策略在Brockhauser中描述等。(2013).

4.2. 晶体重新定向

第三代同步辐射源的大多数MX光束线都配备了单轴测角仪，以实现高机械稳定性（图1)自微焦点和微束流线（Flot等。, 2010; 德桑克提斯等。, 2012). 然而，当利用反常散射在MX中，使用单轴测角仪对通过测量“真实多重性”来减少系统误差的实验有明显的限制(即通过记录来自多个不同晶体方向的反射而获得的多重性）或将特定的单位-细胞轴平行于ω旋转轴，以便在同一衍射图像上测量Friedel mates。为了克服这一限制，ESRF可调谐光束线配备了MK3小型卡帕测角仪（布罗克豪斯等。, 2013)允许晶体重新定向，同时围绕样品进行旋转ω（参见Brock­hauser中的图1等。, 2013). 通过将从同一晶体中收集的不同数据集组合在一起，可以直接获得真正冗余的数据κ角。通过这种方式，在二维探测器的不同区域以及通过样品的不同X射线路径长度上记录等效反射。MXCuBE公司2通过允许在不同的用户定义位置，从晶体中的相同或不同位置创建数据收集队列，促进了此类实验κ角。MK3功能的一个更复杂的用途是重新调整晶体的方向，使单位细胞的旋转轴均匀点编组平行于ω旋转轴（图4). 这允许在弗里德尔对在相同的衍射图像上，从而确保在晶体受到相同的X射线剂量后同时测量它们。计算κ和φ这种重新定向所需的角度可能是一项复杂的任务，甚至超出了经验丰富的实验者的范围，因为它需要波束线硬件配置和限制的知识。然而，该程序已在“kappa再定位”工作流中实现自动化（Brock­hauser等。, 2012)直接与MXCuBE公司2.在此工作流程中，在ω在κ=0°用于识别晶体Bravais晶格并在实验室框架内计算出晶体取向矩阵。随后STAC公司服务器（Brock­hauser等。, 2013)计算κ和φ使偶数折叠轴平行于ω。一旦晶体重新定向，用户将样品置于X射线束的中心，然后用以下公式计算最佳异常数据收集策略EDNA公司经实验者批准后执行。在表1中我们报告了来自木聚糖酶10B阿魏酰酯酶模块硒代蛋氨酸衍生物晶体的数据收集统计数据热梭菌（普拉茨等。2001年; PDB条目1千克)在中获得空间组 P（P）4₂2₁2.从单晶的不同位置收集了两组数据。第一组数据是在尼龙圈中采集的随机晶体中采集的，第二组数据是用c（c）*平行于对齐的轴ω在这两种情况下，数据收集策略均符合EDNA公司/最佳可以看出，沿c（c）*轴导致更大的异常信号（表1中的“DelAnom”和“Anom正态概率的中斜率”)尽管用于收集具有相似完整性和多样性的数据集的总剂量非常相似。

表1 从随机方向收集的数据集的数据收集和处理统计信息c（c）*使用MK3设备与旋转轴对齐 以3.5º的分辨率切割数据，以正确比较两个数据集中的异常信号。没有全局辐射损伤的迹象，例如单位细胞体积或整体体积的增加B类因子，在数据中观察到。括号中的值用于外壳。   随机 κ(c（c）*) 光束线 ID29（标识29） ID29（标识29） 波长（Ω） 0.9791 0.9791 温度（K） 100 100 探测器 皮拉图斯3 6M 皮拉图斯3 6M 数据收集时间（s） 50 44 光子通量（光子−1) 3.5 × 1011 4.5 × 1011 晶体到探测器的距离（mm） 429.2 463.1 每张图像的旋转范围（°） 0.05 0.1 总旋转范围（°） 80 80 “空间”组 P（P）41212 P（P）41212 单位-细胞参数（Ω） 一=b条= 111.38,c（c）= 65.40 一=b条= 111.58,c（c）=65.59 镶嵌度（°） 0.060 0.064 分辨率范围（Ω） 40–3.5 (3.83–3.50) 40–3.5 (3.83–3.50) 反射总数 30994 (7365) 30586 (7637) 独特反射次数 5505 (1291) 5500 (1285) 完整性（%） 99.5 (100) 98.6 (97.9) 多重性 5.6（5.7） 5.4 (5.5) 〈我/σ(我)〉 36.8 (26.1) 49.4 (38.4) R（右）相对湿度。† 0.040（0.064） 0.032 (0.039) 国际标准协会 31.04 31.52 DelAnom公司 0.771 (0.448) 0.852 (0.804) Anom中坡。正态概率 2.564 3.936 †R（右）相对湿度。=.

图4 棒状晶体沿其均匀对称轴之一排列的影响，从(一)随机定向，结晶液滴采集的结果(b条)最终重新定向，在这种情况下，c（c）*平行于ω.

4.3. 反梁数据采集

尽管MK3在MAD/SAD实验（见上文）期间是一种非常有用的晶体对齐设备，或用于对齐晶体，使长单位轴平行于ω样品环内不幸的晶体取向和有限的（24°）αMK3的开启角度可能意味着所需的重新定向超出范围。在这种情况下，在MAD/SAD实验中，确保在弗里德尔对通过采用反束几何学在时间和X射线剂量上紧密结合（亨德里克森等。, 1985; Dauter，1997年; 图5). 在反光束实验中，以旋转角度收集弗雷德尔对中的两个反射ω和ω+分别为180°，反梁几何实验包括将要收集的总角度范围细分为两个相隔180°的数据集ω并按顺序收集它们，通常分解为“子楔”（图3c（c）和5). 光束线控制软件负责每个数据集的正确起始角度、图像和运行编号。这两个数据集分别处理，然后一起缩放以提供最终数据集。尽管据我们所知，还没有对反向梁几何的有益用途进行系统研究，但文献中已经报道了许多使用该技术的成功定相实验的例子（刘等。, 2012, 2013; 阿基等。2014年).

图5 反向光束数据采集允许通过交替采集衍射图像来测量Friedel对中的反射ω（左）和ω+180°（右）。

4.4. 交错MAD数据采集

早期，MAD实验很复杂，需要当地工作人员的干预才能正确准备光束线(即改变能量并重新对准光束线光学元件和样品环境）。ESRF MX波束线（Arzt等。, 2005)以及世界各地的其他同步加速器（Soltis等。, 2008; 斯捷潘诺夫等。, 2011; 软木塞等。, 2006)简化并稳定了可调谐MX光束线的操作，使得MAD实验期间的能量变化对用户几乎透明。用户友好度的增加使得用户能够专注于实验设计的优化，这在提取小的异常信号时尤其重要从头开始结构溶液或样品对辐射损伤敏感时。如已经指出的，MXCuBE公司2的设计允许数据收集协议的模块化组装，并提供了构建实验序列的机会。一个这样的实验序列可用作中的工作流MXCuBE公司2，在其中以不同能量交替收集完整衍射数据集的子边缘是“交错MAD”（Finke等。, 2016)，该协议确保不同数据集中相同反射之间的色散差异受X射线损伤的影响最小。为了证明执行这种数据收集协议的容易性，我们从木聚糖酶10B的阿魏酰酯酶模块的同一晶体的两个不同位置收集C.热电偶（普拉茨等。2001年)在中获得空间组 P（P）2₁2₁2₁一个“经典”双波长MAD数据集和一个MAD数据集中，其中两个波长的数据集合由10°子边交错。结果数据处理统计数据如表2所示并显示具有类似质量的单个数据集。“交错MAD”工作流程的界面允许在多达四种不同能量下交错收集MAD衍射数据，此外，还可以与反向光束几何结合使用（图3d日). 提供新的交织协议的工作流的发展非常简单，并且可以很容易地实现。例如，在不同的探测器距离或κ例如，可以通过在MXCuBE公司2图形用户界面。

表2 木聚糖酶10B阿魏酰酯酶模块的数据收集参数和处理统计C.热电偶（普拉茨等。2001年; PDB条目1000万) 数据集是从P（P）212121晶体的形式为“经典”双波长MAD实验和“交错”MAD实验，其中数据收集在两种能量交替的10°子边中。以3.5º的分辨率切割数据，以正确比较两个数据集中的异常信号。无全球辐射损伤迹象，例如单位细胞体积或整体的增加B类在所收集的数据中观察到因子。括号中的值用于外壳。   峰值“经典” 弯曲“classic” 峰值“交错” 弯曲“交错” 光束线 ID29（标识29） ID29（标识29） ID29（标识29） ID29（标识29） 波长（Ω） 0.9791 0.9793 0.9791 0.9793 温度（K） 100 100 100 100 探测器 皮拉图斯3 6M 皮拉图斯3 6M 皮拉图斯3 6M 皮拉图斯3 6M 数据收集时间（s） 24 24 24 24 光子通量（光子−1) 1.5 × 1011 1.5 × 1011 1.5 × 1011 1.5×1011 晶体到探测器的距离（mm） 391.77 391.75 391.73 391.56 每张图像的旋转范围（°） 0.1 0.1 0.1 0.1 总旋转范围（°） 120 120 120 120 “空间”组 P（P）212121 P（P）212121 P（P）212121 P（P）212121 单位-细胞参数（Ω） 一= 64.82,b条= 108.42,c（c）=113.21 一= 64.86,b条= 108.50,c（c）= 113.29 一= 64.80,b条=108.42，c（c）= 113.16 一= 64.80,b条= 108.40,c（c）= 113.17 镶嵌度（°） 0.039 0.040 0.042 0.043 分辨率范围（Ω） 40–3.5 (3.83–3.50) 40–3.5 (3.83–3.50) 40–3.5 (3.83–3.50) 40–3.5 (3.83–3.50) 反射总数 44499 (10699) 44430（10671） 44492 (10384) 44418 (10620) 独特反射次数 10397 (2478) 10367 (2472) 10384 (2465) 10359 (2470) 完整性（%） 98.9 (99.5) 98.7 (99.3) 98.9 (99.3) 98.8 (99.5) 多重性 4.3 (4.3) 4.3 (4.3) 4.3（4.3） 4.3 (4.3) 〈我/σ(我)〉 28.5 (27.1) 28.8 (26.9) 31.1 (28.9) 30.2 (27.9) R（右）相对湿度。† 0.046 (0.044) 0.045 (0.044) 0.042（0.042） 0.043 (0.043) 国际标准协会 21.82 22.50 25.62 25.06 DelAnom公司 0.679 (0.678) 0.696 (0.674) 0.730 (0.679) 0.718 (0.661) Anom中坡。正态概率 2.610 2.515 2.733 2.693 †R（右）相对湿度。=.

5.结论

实验阶段划分依据反常色散技术是最成功和常见的从头算方法结构确定。The success of an反常色散实验强烈依赖于数据质量，当预期出现小的异常信号时，这一点变得更加重要。在这种情况下，实验设计和执行实验的工具发挥着重要作用。在这里，我们列出了用于MAD或SAD实验的高质量衍射数据收集中最常见的“最佳实践”。MXCuBE公司ESRF Structural Biology Beamlines提供的实验控制GUI通过多种不同的方式促进了这些工作。MXCuBE公司2允许使用EDNA公司,放射性核素和最佳提出数据收集策略，考虑辐射损伤引起的晶体衰变，它允许直接实现复杂的数据采集协议，如反向扫描和交错数据采集实验，并允许高效使用minikapa测角仪以及多位置和多晶体数据采集。此外MXCuBE公司2数据收集队列模块化为新的数据收集方法和数据分析的集成铺平了道路网格和集合管道。MXCuBE公司2不断发展，以纳入新的实验类型，并将其移交给MX用户社区。