A high-transparency, micro-patternable chip for X-ray diffraction analysis of microcrystals under native growth conditions

Murray, T.D.; Lyubimov, A.Y.; Ogata, C.M.; Vo, H.; Uervirojnangkoorn, M.; Brunger, A.T.; Berger, J.M.

doi:10.1107/S1399004715015011

研究论文

结构
生物学

编号：2059-7983

第71卷| 第10部分| 2015年10月| 第1987-1997页

doi:10.1107/S1399004715015011

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一种用于X射线的高透明度、可微图案化芯片衍射分析自然生长条件下的微晶

托马斯·默里,^a、，^b条阿特姆·尤比莫夫,^c（c）克雷格·奥加塔,^d日 Huy Vo公司,^{e（电子）} 莫纳林·乌尔维罗金科恩,^c（c）阿克塞尔·T·布鲁格 ^c（c）^*和詹姆斯·伯杰 ^b条 ^*

^一美国加州大学伯克利分校生物物理研究生组，邮编94720，^b条美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院生物物理和生物物理化学系，邮编：21205，^c（c）美国斯坦福大学分子和细胞生理学系、神经病学和神经科学系、结构生物学和光子科学系以及霍华德·休斯医学院，斯坦福大学，加利福尼亚州94305，^d日总经理/CA@APS美国伊利诺伊州阿贡市阿贡国家实验室先进光子源X射线科学部，邮编60439^{e（电子）}美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学生物医学工程系，邮编：21205
^*通信电子邮件：brunger@stanford.edu,jberge29@jhmi.edu

英国牛津大学E.F.Garman编辑(2015年4月10日收到； 2015年8月11日接受；在线2015年9月26日)

微晶是X射线衍射法测定大分子结构的主要障碍。尽管微焦点同步加速器光束线和X射线自由电子激光器（XFEL）能够从微晶收集可解释的衍射数据，但仍需要高效的方法来收集小体积（<2µl）在普通实验室格式下生长的微晶，并在自然生长条件下将其传送到X射线束源。一种有望克服微晶分析固有挑战的方法是将所谓的“固定目标”取样装置与基于微束的X射线衍射方法配对。然而，为了记录微弱的衍射图案，有必要用X射线透明材料制作器件，以最小化背景散射。这里介绍了一种由氮化硅、光刻胶和聚酰亚胺薄膜制成的三层组成的新型微衍射器件的设计。该芯片具有低X射线散射和X射线吸收特性，并使用疏水和亲水表面图案的可定制混合，帮助将微晶定位到指定区域。可以使用标准移液管将自然生长条件下的微晶加载到芯片中，允许在室温下进行数据采集。从加载到芯片中的鸡蛋白溶菌酶微晶（10-15µm）中收集的衍射数据产生了一个完整的高分辨率（<1.6º）数据集，足以通过以下方法确定高质量的结构分子替换。该芯片的特性允许在微焦点同步加速器束线和XFEL上对几乎任何实验室格式下生长的微晶进行快速且用户友好的分析。

关键词：微晶;氮化硅;串行数据采集;XFEL公司;微焦点光束线;X射线晶体学;微流体.

PDB参考：鸡蛋白溶菌酶，4z98

1.简介

X射线结晶学长期以来一直帮助研究人员确定生物大分子及其复合物的高分辨率结构。尽管它们的用途和用途广泛，但由于无法获得大的衍射良好的晶体，获取结构信息的晶体学工作经常受到阻碍。事实上，微晶（最长尺寸<15µm）经常在结晶条件的初始搜索中发现，在许多情况下，项目可能会在超过微晶极限的过程中停滞不前。微晶研究的挑战推动了旨在克服微米级样品固有的弱衍射和辐射敏感性的技术创新的发展。近年来，微焦点同步加速器光束线和X射线自由电子激光器（XFEL）等先进技术使得从各种微晶系统（Boutet）收集有用的衍射数据成为可能等。, 2012 ; 查普曼等。, 2006 , 2011 ; Cowan&Nave，2008年 ; 库萨克等。, 1998 ; 芬弗洛克等。, 2010 ; 菲舍蒂等。, 2009 ，2013年 ; 希尔加特等。, 2011 ; 约翰逊等。, 2012 ; 穆哈梅齐亚诺夫等。, 2008 ; 佩拉基斯等。, 1999 ; 萨尼什维利等。, 2008 , 2011 ; 萨瓦亚等。, 2014 ; 史密斯等。, 2012 ).

尽管光束线技术目前可以用于亚微米尺寸的晶体（查普曼等。, 2011)样品采集和靶向仍然是微晶衍射研究中的两大难题。例如，使用XFEL，液体喷射喷射系统可以连续地将微晶流注入快速脉冲X射线束（DePonte等。, 2008 ; 齿状山脊等。, 2012 ; 魏尔斯塔尔等。, 2012 , 2014 ). 液体射流已成功用于多项结构分析（Barends等。, 2014 ; 博塔等。, 2015 ; 布泰等。, 2012; 查普曼等。, 2011; 约翰逊等。，2013年 ; 科恩等。, 2012 ，2013年 , 2014 ; 库皮茨等。, 2014 ; 刘瓦克等。，2013年 ; 雷德克等。，2013年 )；然而，这些设备的“命中率”本质上也很低(即与收集的总曝光次数相比，“光束对准”事件的数量较少），并且它们在实验过程中往往消耗大量样品（数百微升到数十毫升）（布特等。, 2012; 查普曼等。, 2011; 齿状山脊等。, 2012; 魏尔斯塔尔等。, 2014). 基于毛细管的液流系统，已成功用于微焦点同步加速器光束线（Stellato等。, 2014 )，具有类似的大样本要求。

`用于输送微晶的固定目标装置构成了液体喷射系统的宝贵替代品（科恩等。, 2014 ; 平田等。, 2014 ). 环路、微网孔或聚碳酸酯塑料格栅的体积消耗低，目标命中率相对较高（科恩等。, 2014; 平田等。, 2014)在晶体材料受到限制的情况下，这是一个有用的特性。尽管有这些有利的特性，但固定目标设备也有其自身的缺点。例如，沉积在塑料网上的晶体需要低温保存以避免脱水；寻找合适的低温保护条件通常很困难，在某些情况下，溶质的变化或冷却过程本身可能会不利地降低结晶顺序或影响蛋白质结构（弗雷泽等。, 2009 , 2011 ; 基迪等。, 2014 ; 蒂尔顿等。, 1992 ). 一些固定目标输送系统，如MiTeGen MicroRT毛细管支架、基于PDMS的微流体装置（海曼等。, 2014 ; 赫沃斯蒂琴科等。, 2014 ; 柳比莫夫等。, 2015 )，氮化硅格栅（Frank等。, 2014 ; 亨特等。, 2014 ; 木村等。, 2014 )HC1湿度控制装置（Sanchez-Weatherby等。, 2009 )和聚酰亚胺（Kapton）薄膜基格栅（Cipriani等。, 2012 ; 扎里纳-阿萨尔等。, 2012 )通过允许在室温下进行样品分析，可以避免与低温保护相关的问题。此外，微流体设备可以允许从可寻址阵列内的稀释溶液中生长或捕获微晶（Hansen等。, 2002 ，2006年 ; 海曼等。, 2014; 赫沃斯蒂琴科等。, 2014; 柳比莫夫等。, 2015; 郑等。, 2004 ).

与液体喷射设备相比，一些固定目标方法的一个缺点是设备材料引起的背景散射增加。例如，PDMS在～7.5º分辨率（Dhouib等。, 2009 ; Greaves&Manz，2005年 ; 古哈等。, 2012 )和设备制造通常需要相对较厚（>50µm）的材料层，这些材料层的特性可能会干扰弱衍射图案（Hansen等。, 2006; 柳比莫夫等。, 2015). 与PDMS相比，氮化硅支架提供相对较低的背景散射和较高的X射线透射（Frank等。, 2014; 亨特等。, 2014)，但迄今为止报告的此类微晶采集设备依赖于从其自然生长条件中移除样品的装载方案（Feld&Frank，2014 ; 弗兰克等。, 2014; 亨特等。, 2014)，这一步骤可能会对衍射质量产生不利影响。HC1湿度控制装置允许通过用户控制的薄片上晶体样品的部分脱水来收集室温数据；然而，该系统要求对优化后的晶体进行低温冷却，以便进行完整的数据集收集（桑切斯·威瑟比等。, 2009). 就他们而言，已经描述了聚酰亚胺（Kapton）薄膜基器件，它们具有低散射性，并且可以在加载期间保持自然晶体生长条件（Cipriani等。, 2012; 扎里纳-阿萨尔等。, 2012)；然而，这些系统要么要求在设备中生长晶体（西普里亚尼等。, 2012)或者那个大玻璃珠等。, 2012)其尺寸比微晶的尺寸大得多（高达100µm），可用于创建纹理表面，使晶体取向随机化（Zarrine Afsar等。, 2012).

为了克服当前固定目标器件中存在的一些局限性，开发了一种新的硅氮基芯片，可以在自然生长条件下从微晶收集X射线衍射数据。使用高X射线透射材料的组合，包括氮化硅、卡普顿薄膜和可图案化光刻胶，该芯片能够接受小体积（<2µl）微晶浆液，将其限制在规定的成像区域内，并有利于偏置具有微彩色特征的单个微晶的位置。这些芯片用于在类似XFEL、零振荡、“单晶体/一次激发”策略下收集微焦点光束线上约10–15µm大小的鸡蛋白溶菌酶（HEWL）晶体的X射线衍射数据，使用手动瞄准。这种方法允许收集完整、高质量（1.55此外，使用X射线自由电子激光（XFEL）测试HEWL微晶的曝光，产生了高质量的衍射数据，证明了芯片用于微焦点同步加速器或XFEL X射线辐射的实用性。

2.材料和方法

2.1. 芯片制造

使用直径100 mm、厚度525（±25）µm、涂有1500°（±5%）低压化学气相沉积氮化硅（WRS材料）的“优质”级硅片，为所有器件设计制造氮化硅窗口。将晶片在200°C下脱水60分钟，冷却后，使用2µm厚的S1813光刻胶（Dow），使用激光蚀刻铬掩模（Front Range PhotoMask）和标准光刻技术将其制成所需阵列（Jaeger，2002 ). 在随后的深度反应离子蚀刻（DRIE）处理期间，将S1813光刻胶旋转到晶圆背面，使其厚度达到2µm，以保护背面的氮化硅层。在115°C烘烤以硬化晶圆背面的光刻胶后，晶圆使用四氟化碳（CF）进行DRIE₄)等离子体选择性地去除之前转移所需窗口图案时暴露的氮化硅。然后在丙酮浴中剥离光刻胶，然后将晶圆浸入90°C 30%(w个/五)用于硅晶片湿法蚀刻的氢氧化钾溶液。湿法蚀刻以大约1µm min的速度进行⁻¹完成后，用去离子水彻底冲洗晶圆。为了制备用于中间层的光致抗蚀剂图案化的晶片，将晶片在200°C下脱水烘焙60分钟，然后使用PEII-a等离子体蚀刻室（Technics）进行氧等离子体处理（300 W，5分钟）。随后将SPR 220-7.0光刻胶（道氏）旋转到晶圆的连续氮化硅表面侧，高度为15µm，用于沟道芯片设计，或将SPR 220-3.0光刻胶粒旋转到晶片上5µm高度，用于光刻胶芯片设计。使用标准光刻技术和激光蚀刻铬掩模（前幅光刻掩模）对光刻胶特征进行了图案化。为了使光刻胶条具有亲水性，使用Atomflo 400系列等离子体发生器（Surfx）对光刻胶进行氧气等离子体处理。使用金刚石尖端笔从晶片上切下单个器件，以沿着骰子线施加压力，骰子线与初始窗口阵列一起被图案化到晶片上，并在湿法蚀刻期间被蚀刻到晶片中。

2.2。氮化硅芯片内微晶光学成像的晶体生长和芯片加载

按照福克纳的描述，生长了鸡蛋白溶菌酶（HEWL）微晶等。(2005 )，但使用了市售的HEWL制剂（OmniPure，5950-OP），并且省略了晶体交联步骤。将冻干溶菌酶重新悬浮在20 mg ml⁻¹在pH 3.5的醋酸钠中，分成50µl小份，然后在−20°C下储存。为了结晶，将溶菌酶溶液解冻，然后以13000转/分钟的转速旋转10分钟⁻¹在台式离心机（Eppendorf 5424）中去除任何沉淀物或细颗粒物质。然后将澄清的溶液转移到新鲜的微型离心管中，并以1:3（蛋白质：缓冲液）的比例添加结晶缓冲液。要生成10–15µm大小的晶体，20%氯化钠，8%(w个/五)聚乙二醇8000，0.5M（M）使用pH为3.5的醋酸钠溶液。将溶液置于冰上或4°C的冷藏室中时，溶液在15分钟内形成晶体。

对于装载HEWL微晶的芯片的光学成像，微晶浆料首先通过上下移液管搅拌。接下来，在光刻胶图案的氮化硅窗口顶部发现0.5µl该制剂。为了覆盖芯片，使用刀片切割一片8µm厚的Kapton薄膜（SPEX SamplePrep，目录号3511），其尺寸足以覆盖所有氮化硅观察窗，并放置在溶液顶部。芯片上的晶体图像是使用配备Retiga 2000R相机（Q Imaging）的奥林巴斯IX71显微镜拍摄的。

为了在斯坦福同步辐射实验室（SSRL）束线BL12-2和Linac相干光源（LCLS）的X射线泵探针（XPP）端站上收集X射线数据，按照光学成像所述加载并覆盖芯片。在高级光子源中，将0.5µl新制备的HEWL微晶浆料用移液管移到四个连续窗口上，因为由于安装设备和光束线终端的几何形状，每个氮化硅芯片上只有四个窗口可用于数据采集。

2.3. 衍射数据采集和晶体结构决心

在SSRL光束线BL12-2上进行了背景散射X射线衍射实验，采用10µm光束、3 s曝光和0.02°振荡。10–15µm HEWL微晶的X射线衍射实验使用10µm光束、5 s曝光和0.02°振荡。图像收集在Dectris PILATUS 6M探测器上。所有测量均使用5×30 mm基于通道的芯片（补充图S1）。所有实验均使用定制的芯片支架。晶体要么完全位于氮化硅表面，要么完全位于涂有光刻胶的氮化硅表面上，产生衍射而没有任何明显差异（补充图S2）。随后，两幅衍射图像都用预期的空间组四方HEWL微晶的单位-细胞参数(P（P）4_三2₁2,一 = b条 = 79.1,c（c）=38.1Å，α=β=γ= 90.0°).

在LCLS的XPP终端使用10–15µm HEWL微晶进行X射线衍射实验，使用3µm未衰减光束和40 fs脉冲。使用3µm非衰减光束的40 fs脉冲对5×30 mm基于信道的芯片进行测试曝光（补充图S1）（补充图S3一，第4页一和4b条)或30µm未衰减光束（补充图S4c（c）和S4d日)9千伏。在Rayonix MX325探测器上收集静止（零振荡）图像。所有测量均使用5×30 mm基于通道的芯片（补充图S1）和定制的芯片支架（带机加工芯片孔槽的标准磁性底座）。探测器的位置应确保角对应于～2.0Ω的分辨率。使用J蓝色——史诗（斯特帕诺夫等。, 2011 )，首先聚焦单个1毫米，将晶体移动到光束中²低倍率氮化硅窗口。随后，放大倍数增加到可以清楚地看到单个微晶的程度，然后手动瞄准单个微晶进行曝光。

使用零振荡串行数据收集策略，使用直径为10µm的光束和PILATUS3 6M探测器，在高级光子源（APS）的通用医学科学与癌症研究所结构生物学设施（GM/CA）光束线23-ID-D上收集了完整的数据集。芯片使用GM/CA开发的定制芯片支架安装。在光束时间<8小时内，共收集了324张（0.25秒曝光）图像。使用八块芯片进行数据采集，芯片通常保持安装状态，观察时间为30–60分钟；对一块芯片进行了107分钟的检查。通过手动光栅从氮化硅窗口的左上角到右下角定位HEWL微晶。在一个窗口内暴露晶体后，芯片被转换到相邻窗口，该窗口也被手动光栅化。这些实验中使用了亲水性光刻胶条带基芯片（10×30mm器件尺寸，条带图案）。

为了确定最大分辨率数据集采集所需的最小X射线剂量，首先对单个HEWL微晶进行10次1.0 s的辐射暴露，以确定衍射分辨率极限开始降低的时间。在单个微晶仅经历一次1.0秒的暴露后，对另一个微晶进行10次0.3秒的低剂量系列暴露。在第二次0.3秒曝光期间，分辨率降低。在十次0.1秒曝光后，发现分辨率极限没有延伸到探测器边缘，因此选择0.25秒曝光进行数据集采集。

使用cctbx.xfel公司软件套件（Hattne等。, 2014 ).底漆然后用于成功合并、缩放和后细化324/324个集成图像（Uervirojnangkoorn等。2015年 ). 溶菌酶的结构通过分子置换使用相位器（麦考伊等。, 2007 )并使用菲尼克斯定义（亚当斯等。，2010年 )，而手动重建和调整是在库特（埃姆斯利等。, 2010 ).R（右）_自由的-从分子重定位图开始，所有输出图中都保留了标记的反射。

3.结果

3.1. 用于获取蛋白质微晶的三层氮化硅基芯片的构建

为了构建微晶X射线衍射实验平台，设计了一个三层芯片，其中顶部和底部由高度X射线透明的材料组成，中间层配置为分离支撑层，也有助于捕获微晶样品（图1一和1b条). 氮化硅被选为芯片的基础材料，因为它的成本低，并且在衍射实验中已经确立了实用性（Feld&Frank，2014; 弗兰克等。, 2014; 亨特等。, 2014; 木村等。, 2014). 在与SSRL、APS和LCLS的科学家就理想尺寸进行协商后，获得了一系列矩形（5×30 mm）“芯片”，其特征是10个1 mm的阵列²制作了×150nm厚的氮化硅观察窗。为了提高制造效率，制作了图案掩模，允许从单个直径为100mm的氮化硅涂层硅片上生成多达24个此类器件（图1c（c）和1d日). 由于光刻胶的图案稳定性和良好的X射线透射特性（Dhouib等。, 2009; 威尔斯，1992年 ). 选择商用8µm厚聚酰亚胺（Kapton）薄膜作为顶层，因为其透气性低，经常用于X射线衍射实验（Cipriani等。, 2012; 海曼等。, 2014; 扎里纳-阿萨尔等。, 2012)和耐用性。

图1
三层设备布局。(一)芯片层的示意图。(b条)组装芯片的成像室剖视图，具有150 nm厚的氮化硅窗口、15µm厚的光刻胶和8µm厚度的Kapton薄膜层。(c（c）)直径100 mm的晶圆，带24个5×30 mm器件。(d日)单个5×30 mm器件的照片（仅氮化硅层）。

光刻胶图案具有高度可调性，允许通过标准光刻在表面上构建几乎任何形状的结构（Jaeger，2002）). 为了帮助限制和定位蛋白质微晶，光刻胶（中间）层最初被制成一系列长的平行通道。通道的设计宽度为20µm，高度为15µm（对应于一组尺寸略大于典型微晶），由约50–100µm宽的光刻胶壁隔开，长度跨越整个1 mm²氮化硅窗口（补充图S1一)或者被分成两个0.5毫米的部分（补充图S1b条). 在我们芯片的早期原型中，相对通道间距也不同（补充图S1c（c）和S1d日)，尽管后来发现信道长度和信道间距的变化都不会影响芯片性能（未显示）。

为了测试基于通道的芯片设计，将0.5µl鸡蛋白溶菌酶（HEWL）微晶浆料（平均晶粒尺寸为~10–15µm）用移液管移到光刻胶图案氮化硅窗口上，并用一条Kapton薄膜覆盖样品。在放置Kapton薄膜层之后，晶体确实沉淀在图案通道中（图2一). 然而，晶体通常位于光刻胶的最上面，夹在该层和Kapton膜之间（图2b条). 尽管测试暴露没有显示出含有光刻胶的芯片区域的背景散射有任何明显增加与那些没有这样做的芯片（补充图S2）被重新设计，使晶体有利于直接与氮化硅结合或与光刻胶特征的边缘结合，从而使卡普顿薄膜不会将其压入光刻胶中。

图2
加载的基于通道的芯片的光学成像。(一,b条)采用20µm宽通道设计并加载10–15µm HEWL微晶的密封三层芯片的光学显微照片。

3.2. 亲水表面图案改善微晶定位

根据最初的发现，晶体倾向于与光刻胶的上平面结合，就像与图案化通道的氮化硅地板一样容易，这两层的天生疏水性似乎阻止了对一种材料或另一种材料的任何优先定位。这一想法表明，蛋白质微晶可以稳定地固定在相对亲水的表面可能是有益的。为了克服芯片整体的疏水性，使用氧等离子体处理使光刻胶层具有亲水性（Northen&Turner，2005 ; 沃尔特等。, 2007 ). 通过在氮化硅层上图案化更密集的光刻胶结构，将纹理更丰富的表面引入芯片；这种方法已被证明有助于表面润湿（马里纳罗等。, 2014 ; 扎里纳-阿萨尔等。, 2012)并有助于随机化沉积在表面上的样品的方向（Zarrine Afsar等。, 2012).

首先，设计了不同尺寸和间距的矩形光致抗蚀剂条纹阵列（图3). 条纹宽度为20µm，长度从窗口长度到～150µm不等。在光刻胶图形化和氧等离子体处理之后，使用光学显微镜评估微晶是否优先与处理过的光刻胶条纹的边缘相关联，而不是与未处理的条纹相关联。将0.5µl新制备的HEWL微晶浆料加载到光刻胶带状图案氮化硅窗口上，该窗口上覆盖有Kapton薄膜和1 mm范围内的可观察晶体数量²然后计算氮化硅观察窗（图4一和4b条). HEWL微晶明显倾向于定位于亲水性光刻胶条纹的长边（图4c（c）)这表明这些特征确实有助于偏置微晶的放置。纹理更丰富的光刻胶结构也有助于随机化芯片内微晶的方向（图4d日).

图3
基于光刻胶条纹的芯片设计。(一,b条,c（c）)1 mm图案设计掩模示意图²氮化硅窗口，具有20µm宽的不同长度的光刻胶结构。(d日)单个1 mm范围内的光学显微照片²氮化硅窗口以20µm宽137.5µm长的光刻胶结构为图案。

图4
未经处理和氧等离子体处理的三层芯片中封装的HEWL微晶的光学成像。(一)1 mm的光显微照片²氮化硅窗口上有20µm宽的未经处理的光刻胶条纹，上面装有HEWL微晶。(b条)1 mm的光显微照片²氮化硅窗口采用20µm宽的氧等离子体处理光致抗蚀剂条带，加载HEWL微晶。(c（c）)1 mm范围内HEWL微晶数光学成像的量化²氮化硅窗口。(d日)氧气等离子体处理芯片内的晶体特写。

3.3. 氮化硅芯片中微晶的X射线衍射研究

为了测试芯片的性能，他们在SSRL的BL12-2微焦点束线上使用一个源自标准晶体环磁性底座的支架进行了评估。在APS上还使用定制的芯片安装架进行了X射线衍射实验，该芯片安装架用于安装各种尺寸的设备（图5一)并在LCLS的XPP端站使用与标准测角仪兼容的改进型磁性底座（图5b条). 芯片的刚性使得可以在测角仪设置的有限空间内使用各种定制支架进行高效安装。较低的腔室总厚度（<25µm；图1b条)芯片的光学透明性也使得在数据采集期间，即使设备倾斜45°，也可以轻松识别和瞄准氮化硅观察窗内的晶体。

图5
用于X射线衍射实验的芯片固定器。(一)APS的GMCA束线23-ID-D上使用的定制芯片安装图，能够容纳各种宽度的芯片（图中为10×30 mm设备）。(b条)LCLS的XPP端站上使用的定制芯片底座的图像。

正如预期的那样，三层芯片的背景信号非常低（图6一). 背景散射水平被证明远低于基于PDMS的微流控晶体捕获设备（图6）b条和6c（c）)，唯一显著的背景特征是在～16℃时由Kapton薄膜产生的散射环（图6一和6c（c）). 接下来，在SSRL（补充图S2）和LCLS XPP终端（补充图S3），使用BL12-2上的约10–15µm大小的HEWL微晶对芯片进行测试一)和APS处的GM/CA波束线23-ID-D（补充图S3b条). 在每种情况下，生成的衍射图像用空间组(P（P）4_三2₁2）和单元间参数(一=b条= 79.1,c（c）= 38.1 Å,α = β =γ=90°），常见于四方HEWL晶体。此外，衍射图案中的高分辨率数据非常明显，衍射最大值经常延伸至~1.5º分辨率（补充图S3b条)，与偶尔从薄层PDMS芯片上观察到的~1.8Å分辨率斑点相比（Lyubimov等。, 2015).

图6
氮化硅基和PDMS基器件背景散射的比较。(一)包含结晶缓冲液的三层（氮化硅窗口、15µm厚的光刻胶和Kapton薄膜）器件的衍射图像。分辨率为16º的暗散射环源自Kapton薄膜。(b条)装载有结晶缓冲液的～100µm厚双层微流体PDMS晶体捕获设备的衍射图像。(c（c）)散射强度图与中所示图像的分辨率(一)和(b条). 光束挡块左侧的锥形暗区对应于衍射图像中X射线未被X射线散射防护罩遮挡的部分。的数据(c（c）)被平滑以去除这些未阻挡的X射线引起的尖锐特征。

3.4. 芯片性能的结构验证

在确定了三层氮化硅基芯片允许收集高分辨率衍射数据后，在室温下使用这些设备收集了完整的衍射数据集。在APS的GM/CA光束线23-ID-D上使用直径为10–15μm的HEWL微晶和直径为10μm的光束收集衍射图像。每个芯片的总数据收集时间通常达到1小时，从第一次曝光到最后一次曝光的最长持续时间为107分钟；事实证明，这段时间足以在样本脱水之前使用芯片的所有片段。每个晶体都拍摄了一个零振荡（“静止”）衍射图像，以近似于类似XFEL的串行数据采集实验。在数据收集之前，确定了这些晶体仍能产生最大衍射分辨率的最小X射线曝光时间（0.25 s）（§2.3，材料和方法). 该曝光时间大约相当于单个FEL脉冲中8 keV光子数量的0.05–0.1倍。收集过程中使用芯片倾斜（以2°增量为±44°），以确保互易空间适当取样；在这方面，光致抗蚀剂的亲水性和纹理特征被证明在随机化微晶取向方面是有价值的，从而允许从相对少量（<325）的微晶中收集完整的串行X射线衍射数据集（补充图S5）。最后的数据集是从八块光刻胶条纹图案芯片（图3）获得的324/324张静止图像中组合而成的). 有趣的是，单个图像通常索引并集成到~1.3º的分辨率，显示芯片的高信噪比特性（补充图S6）。

收集数据后，cctbx.xfel公司（哈特纳等。, 2014)用于衍射图像的索引和集成底漆（Uervirojnangkoorn）等。, 2015)用于缩放、合并和后期优化。该过程总共产生了324张索引/综合衍射图像。合并数据集在最高分辨率bin（1.55º）中的完成率为91.6%，总体完成率为96.9%（1.3º的更高分辨率数据不包括在精炼由于完整性低）。芯片倾斜和芯片表面上晶体取向的随机分布似乎大大有助于整体完整性，因为使用类似数据收集策略的基于PDMS的设备仍然显示出衍射数据缺失的楔形（补充图S5；Lyubimov等。, 2015).

合并后，相位器（麦考伊等。, 2007)用于分子置换使用源自HEWL结构（PDB条目）的多胺搜索模型1伏/分)在不同的环境中结晶空间组(P（P）2₁; S.Aibara、A.Suzuki、A.Kidera、K.Shibata、T.Yamane、L.J.DeLucas和M.Hirose，未出版作品）。只有一个具有极好对数增益（1279.3）和平移函数的单一解决方案Z轴-该方法得到的分数（39.0）。MR-衍生2百万英尺_o个−DF公司_c（c）电子密度图清楚地显示了大多数侧链和所有二硫键（补充图S7一). 结构经过了改进菲尼克斯（亚当斯等。, 2010)，手动干预精炼使用进行的循环库特（埃姆斯利等。，2010年). 根据报告，最终模型具有良好的几何结构摩尔概率（陈）等。, 2010 )与报道的四方HEWL结构（表1，补充图S7c（c）和S7d日).

表1
数据收集、合并统计和结构优化

括号中的值用于外壳。

数据收集和合并统计
晶体数量	324
波长（Ω）	1.03318
分辨率范围（Ω）	39.59–1.55 (1.58–1.55)
“空间”组	P（P）4_三2₁2
单位-细胞参数（Ω，°）	一=b条= 79.14,c（c）= 38.11,α=β=γ=90.0
总反射	138868
独特的反射	17566 (817)
观察次数†	7.90 (3.44)
完整性（%）	96.9（91.6）
平均值我/σ(我)	14.58 (3.68)
威尔逊B类系数（Ω²)	19.96
科科斯群岛_1/2(%)	82.2 (15.8)
结构优化统计
R（右）_工作	0.205
R（右）_自由的	0.246
R.m.s.d.，债券（Au）	0.008
R.m.s.d.，角度（°）	1.08
拉马钱德兰青睐（%）	96
允许Ramachandran（%）	三
Ramachandran异常值（%）	0

†对应于报告的每个Miller指数的部分观察数底漆（Uervirojnangkoorn）等。, 2015

4.讨论

在生物大分子结晶过程中，研究人员获得微晶并不罕见。事实上，对于许多项目，只能获得5-10µm或更小的晶体，这限制了结构确定选项。微焦点光束线已被证明在允许研究人员从微晶样品中确定结构方面是非常宝贵的（切列佐夫等。, 2007 ; 库利巴利等。, 2007 ; 纳尔逊等。, 2005 ; 拉斯穆森等。, 2007 , 2011 ; 警告等。, 2008 ). 同样，下一代“衍射受限光源”将产生比当前第三代同步加速器光源更亮的X射线束（Biasci等。, 2014 ; Borland，2013年 ; Decker，2014年 ; Einfeld，2014年 ; 田中，2014年 )XFEL源有望对此类系统产生更大的影响（巴伦兹等。, 2014; 布泰等。, 2012; 查普曼等。, 2011; 约翰逊等。, 2012，2013年; 科恩等。, 2012，2013年, 2014; 库皮茨等。, 2014; 刘瓦克等。，2013年; 雷德克等。，2013年; 萨瓦亚等。, 2014).

尽管光束线技术不断进步，微晶的采集和输送通常仍然是一个挑战。输送系统目前侧重于两种主要方法，即连续液体喷射喷射和固定目标系统，每种方法都为微晶采集和分析提供了一定的优缺点。考虑到它们在微晶研究中的实用性，固定目标设备，例如回路、微网孔、网格和微流控芯片，通常提供低样本消耗和相对较高（>30%）的自动命中率（Hunter等。, 2014). 然而，环网和微孔网需要样品低温保护以防止快速脱水（科恩等。, 2014; 平田等。, 2014). 低温保护过程通常很耗时，并且会影响结晶靶的结构（弗雷泽等。, 2009, 2011; Halle，2004年 ). 其他基于网格或芯片的固定目标方法允许在室温下进行数据采集，但通常也需要在一种高度专业化的设备中生长和分析晶体（Cipriani等。, 2012; 汉森等。, 2006; 赫沃斯蒂琴科等。, 2014)或者晶体被转移到非天然的收获条件，如石油（亨特等。, 2014). 理想的样品交付平台将允许以温和和自然的方式传输和分析任何形式生长的晶体，以避免因溶液条件或机械应力的变化而造成的损坏。同时，这种设备将微晶定位在确定的、可寻址的位置，以优化数据收集期间样品使用的效率。

在这里，我们报道了一种具有最小X射线背景散射和吸收特性的新芯片的开发。该芯片采用三层设计，包括氮化硅观察窗、光刻胶微晶支撑和Kapton薄膜盖（图1一和1b条). 只需将样品溶液移到观察窗上，并将卡普顿薄膜铺在液滴上，即可加载芯片。加载所需的材料很少（<2µl），微晶在转移到设备时保持在其自然生长条件下。Kapton薄膜和氮化硅层减轻了脱水的影响，为使用手动目标从芯片中收集数据提供了充足的时间。目前正在研究为装置内的微晶创造气密密封的长期方法，以实现样品的临时储存和运输。

类似于微孔和格栅（科恩等。, 2014)，暴露的氮化硅格栅（Hunter等。, 2014)和Kapton基于胶片的网格（Zarine-Afsar等。, 2012)，这里介绍的器件中的材料及其薄的性质（光致抗蚀剂条纹芯片的总腔室厚度<15µm）提供了高的X射线透射，并允许晶体以随机方向定位。因此，使用氮化硅芯片在低曝光剂量下获得完整的衍射数据集，从数百个单一HEWL微晶收集一系列静止图像，以模拟XFEL型衍射数据。HEWL微晶已用于液体喷射基础（Botha等。, 2015)，基于固定目标（Coquelle等。2015年 ; 柳比莫夫等。, 2015)和基于毛细管的（Stellato等。, 2014)输送系统。从芯片中加载的HEWL微晶上收集的数据中，确定了HEWL模型系统所期望的完全分辨率和质量的结构。数据集始终包含显示高分辨率衍射峰的单个图像，分辨率通常为1.3°（补充图S3b条和S6）。本地数据具有足够的质量，可以使用分子替换。值得注意的是，HEWL的结构仅使用收集到的324张衍射图像来确定，这与可以从单吊滴蒸汽扩散实验中获得的微晶样品的数量相当。因此，基于氮化硅的设备，加上最先进的串行数据还原软件，可以从稀疏矩阵结晶试验期间获得的晶体中提取高质量的衍射数据。

结果进一步表明，多层芯片应适用于更小（<10µm）的微晶靶，以及具有大单位-细胞参数的复合物的微晶。高质量的数据表明，从芯片获得的衍射应足以完成需要高信噪比测量的任务，例如自然硫SAD相位（Liu，Liu等。，2013年 ). 在这方面，芯片顶部的卡普顿薄膜层可以由更低的Z轴-分数/更高的X射线透射材料（如必要），如另一氮化硅窗口、铍或潜在的石墨烯，以促进此类研究（克劳斯等。, 2014 ; 迈耶等。, 2007 ). 目前正在努力设计这种装置。

加载到氮化硅芯片中的HEWL微晶的测试XFEL曝光表明，该装置可用于未来使用XFEL束源的X射线衍射实验（补充图S3一). 当将光刻胶图案的氮化硅器件暴露于未衰减的3µm光束时，在Kapton薄膜中产生了一个孔和一个直径约为100µm的熔化光刻胶环（补充图S4一和S4b条)衍射数据质量似乎未受影响（补充图S3一). 此外，在前一次拍摄的大约250µm的XFEL光束照射下，仍然可以产生高质量的溶菌酶衍射图案（未显示），这表明可以使用光栅方法进行有效的数据收集。此外，在使用3µm XFEL光束安装芯片进行X射线衍射实验时，由于受到损坏，也没有出现明显的脱水现象。相比之下，用30µm光束曝光不会以任何可观察的方式影响Kapton膜或与光束相互作用点周围的光刻胶结构（补充图S4c（c）和S4d日).

微晶输送系统中的一个剩余挑战是最大限度地提高样品命中率，以便在衍射数据自动采集期间获得的接近100%的图像包含来自单个微晶的可用衍射图案。一种能够产生从稀释溶液中捕获的完全可寻址微晶阵列的设备已经开发出来，这是朝着这个目标迈出的宝贵一步（吕比莫夫等。, 2015). 最近涉及氮化硅基器件的工作（Coquelle等。2015年; 弗兰克等。, 2014; 亨特等。, 2014; 木村等。, 2014)已证明氮化硅作为低后向散射材料用于弱衍射微晶样品的实用性。然而，这些最新的设备并没有影响微晶位置的方法。这里，微晶位置通过交替疏水/亲水表面的形成而得到了有利的偏移（图4). 虽然晶体没有完全定位在规定的位置，但HEWL微晶可以优先定位于通过氧等离子体处理变得亲水的光刻胶特性。目前正在努力将所有这些进展整合到一个高效的晶体测量系统中。

此外，现在已经建立了材料（氮化硅、光刻胶和聚酰亚胺薄膜）和微加工方法（氧等离子体处理）的组合，这有助于衍射数据收集，同时最大限度地减少背散射，并影响微晶的定位，该平台可用于设计各种微操作实验的芯片，例如重原子浸泡。未来，预计数据集的收集需要大量图像，例如从头算天然硫SAD实验的阶段化将大大有助于将微晶定位在可编程为自动数据收集系统的确定的、可瞄准的位置。进一步改善此处所述的三层设备的表面特性和特征尺寸有助于实现这些目标。

支持信息

3D视图

PDB参考：鸡蛋清溶菌酶，4z98

支持信息文件。内政部：10.1107/S1399004715015011/gm5039sup1.pdf

致谢

我们要感谢斯蒂芬·哈里森教授在芯片设计和数据采集方面的建议，以及他慷慨捐赠的一部分XFEL波束时间。总经理/卡@APS全部或部分由美国国家癌症研究所（ACB-12002）和美国国家普通医学科学研究所（AGM-12006）的联邦基金资助。本研究使用了先进光子源的资源，这是美国能源部（DOE）科学办公室用户设施，由阿贡国家实验室根据合同DE-AC02-06CH11357为DOE科学办公室运营。SLAC国家加速器实验室斯坦福同步辐射实验室（SSRL）和Linac相干光源（LCLS）的使用由美国能源部科学办公室基础能源科学办公室支持，合同号DE-AC02-76SF00515。SSRL结构分子生物学项目由DOE生物与环境研究办公室和国家卫生研究院、国家普通医学科学研究所（包括P41GM103393）支持。本出版物的内容仅由作者负责，不一定代表NIGMS或NIH的官方观点。该项目的资金由休斯合作创新奖（HCIA）提供给ATB和JMB。

工具书类

P.D.亚当斯。等。(2010).《水晶学报》。天66, 213–221. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Barends，T.R.M.、Foucar，L.、Botha，S.、Doak，R.B.、Shoeman，R.L.、Nass，K.、Koglin，J.E.、Williams，G.J.、Boutet，S.和Messerschmidt，M.&Schlichting，I.（2014）。自然（伦敦）,505，244–247科学网交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 比亚西，J.C。等。(2014).同步辐射。新闻,27, 8–12. 交叉参考谷歌学者
 Borland，M.（2013）。《物理学杂志》。Conf.序列号。 425, 042016. 交叉参考谷歌学者
 Botha，S.，Nass，K.，Barends，T.R.M.，Kabsch，W.，Latz，B.，Dworkowski，F.，Foucar，L.，Panepucci，E.，Wang，M.，Shoeman，R.L.，Schlichting，I.&Doak，R.B.（2015）。《水晶学报》。天71, 387–397. 科学网交叉参考 IUCr日志谷歌学者
 Boutet，S.公司。等。(2012).科学类,337, 362–364. 交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 查普曼，H.N。等。（2006年）。自然物理学。 2, 839–843. 科学网交叉参考中国科学院谷歌学者
 H.N.查普曼。等。(2011).自然（伦敦）,470, 73–77. 科学网交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 Chen，V.B.、Arendall，W.B.、Headd，J.J.、Keedy，D.A.、Immormino，R.M.、Kapral，G.J.，Murray，L.W.、Richardson，J.S.和Richardsson，D.C.（2010）。《水晶学报》。天66, 12–21. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Cherezov，V.、Rosenbaum，D.M.、Hanson，M.A.、Rasmussen，S.G.F.、Thian，F.S.、Kobilka，T.S.、Choi，H.-J.、Kuhn，P.、Weis，W.I.、Kotilka，B.K.和Stevens，R.C.（2007年）。科学类,318, 1258–1265. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Cipriani，F.、Röwer，M.、Landret，C.、Zander，U.、Felisaz，F.&Márquez，J.A.（2012）。《水晶学报》。天68, 1393–1399. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 科恩，A.E。等。(2014).程序。美国国家科学院。科学。美国,111, 17122–17127. 科学网交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 Coquelle，N.、Brewster，A.S.、Kapp，U.、Shilova，A.、Weinhausen，B.、Burghammer，M.和Colletier，J.-P.（2015）。《水晶学报》。天71, 1184–1196. 科学网交叉参考 IUCr日志谷歌学者
 Coulibaly，F.、Chiu，E.、Ikeda，K.、Gutmann，S.、Haebel，P.W.、Schulze-Briese，C.、Mori，H.和Metcalf，P.（2007年）。自然（伦敦）,446，97–101科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Cowan，J.A.和Nave，C.（2008）。J.同步辐射。 15, 458–462. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Cusack，S.、Belrhali，H.、Bram，A.、Burghammer，M.、Perrakis，A.和Riekel，C.（1998）。自然结构。分子生物学。 5，634–637页科学网交叉参考中国科学院谷歌学者
 Decker，G.（2014）。同步辐射。新闻,27, 13–17. 交叉参考谷歌学者
 DePonte，D.P.，Weierstall，U.，Schmidt，K.，Warner，J.，Starodub，D.，Spence，J.C.H.&Doak，R.B.（2008）。《物理学杂志》。D申请。物理学。 41，195505页科学网交叉参考谷歌学者
 Dhouib，K.、Khan Malek，C.、Pfleging，W.、Gauthier-Manuel，B.、Duffait，R.、Thuiller，G.、Ferrigno，R.，Jacquamet，L.、Ohana，J.、Ferer，J.-L.、Théobald-Dietrich，A.、Gieg，R.和Lorber，B.和Sauter，C.（2009年）。实验室芯片,9, 1412–1421. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Einfeld，D.（2014）。同步辐射。新闻,27, 4–7. 交叉参考谷歌学者
 Emsley，P.、Lohkamp，B.、Scott，W.G.和Cowtan，K.（2010年）。《水晶学报》。天66, 486–501. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Falkner，J.C.、Al-Somali，A.M.、Jamison，J.A.、Zhang，J.、Adrianse，S.L.、Simpson，R.L.和Calabretta，M.K.、Radding，W.、Phillips，G.N.Jr和Colvin，V.L.（2005）。化学。马特。 17, 2679–2686. 科学网交叉参考中国科学院谷歌学者
 Feld，G.K.和Frank，M.（2014）。货币。操作。结构。生物。 27, 69–78. 科学网交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 Finfrock，Y.Z.、Stern，E.A.、Yacoby，Y.、Alkire，R.W.、Evans-Lutterodt，K.、Stein，A.、Isakovic，A.F.、Kas，J.和Joachimiak，A.（2010）。《水晶学报》。天66, 1287–1294. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Fischetti，R.F.、Xu，S.、Yoder，D.W.、Becker，M.、Nagarajan，V.、Sanishvili，R.、Hilgart，M.C.、Stepanov，S.和Makarov，O.&Smith，J.L.（2009年）。J.同步辐射。 16, 217–225. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Fischetti，R.F.，Yoder，D.，Xu，S.，Makarov，O.，Ogata，C.&Smith，J.L.（2013）。《物理学杂志》。Conf.序列号。 425, 012006. 交叉参考公共医学谷歌学者
 M·弗兰克。等。(2014).IUCrJ大学,1, 95–100. 科学网交叉参考中国科学院公共医学 IUCr日志谷歌学者
 Fraser，J.S.、Clarkson，M.W.、Degnan，S.C.、Erion，R.、Kern，D.和Alber，T.（2009）。自然（伦敦）,462, 669–673. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Fraser，J.S.、van den Bedem，H.、Samelson，A.J.、Lang，P.T.、Holton，J.M.、Echols，N.和Alber，T.（2011）。程序。美国国家科学院。科学。美国,108，16247–16252科学网交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 Greaves，E.D.&Manz，A.（2005年）。实验室芯片,5, 382–391. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Guha，S.、Perry，S.L.、Pawate，A.S.和Kenis，P.J.（2012年）。传感器执行器B化学。 174，1-9科学网交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 Halle，B.（2004）。程序。美国国家科学院。科学。美国,101, 4793–4798. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Hansen，C.L.、Classen，S.、Berger，J.M.和Quake，S.R.（2006年）。美国化学杂志。Soc公司。 128，3142–3143科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Hansen，C.L.、Skordalakes，E.、Berger，J.M.和Quake，S.R.（2002）。程序。美国国家科学院。科学。美国,99, 16531–16536. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 J.哈特尼。等。(2014).自然方法,11, 545–548. 科学网交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 Heymann，M.、Opthalage，A.、Wierman，J.L.、Akella，S.、Szebenyi，D.M.E.、Gruner，S.M.和Fraden，S..（2014）。IUCrJ大学,1, 349–360. 科学网交叉参考中国科学院公共医学 IUCr日志谷歌学者
 Hilgart，M.C.、Sanishvili，R.、Ogata，C.M.、Becker，M.、Venugopalan，N.、Stepanov，S.、Makarov，O.、Smith，J.L.和Fischetti，R.F.（2011）。J.同步辐射。 18, 717–722. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 平田，K。等。(2014).自然方法,11, 734–736. 科学网交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 亨特，M.S。等。(2014).科学。代表。 4, 6026. 科学网交叉参考公共医学谷歌学者
 Jaeger，R.C.（2002年）。微电子制造导论第二版，由G.W.Neudeck和R.F.Pierret编辑，第17-25页。上鞍河：普伦蒂斯·霍尔。谷歌学者
 约翰逊，L.C。等。(2013).自然社区。 4, 2911. 谷歌学者
 约翰逊，L.C。等。(2012).自然方法,9, 263–265. 科学网交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 Keedy，D.A.、van den Bedem，H.、Sivak，D.A.和Petsko，G.A.、Ringe，D.、Wilson，M.A.和Fraser，J.S.（2014）。结构,22, 899–910. 科学网交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 科恩，J。等。(2012).程序。美国国家科学院。科学。美国,109, 9721–9726. 科学网交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 科恩，J。等。(2013).科学类,340, 491–495. 科学网交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 科恩，J。等。(2014).自然社区。 5, 4371. 科学网交叉参考谷歌学者
 Khvostichenko，D.S.，Schieferstein，J.M.，Pawate，A.S.，Laible，P.D.&Kenis，P.J.（2014）。克里斯特。增长设计。 14, 4886–4890. 交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 Kimura，T.、Joti，Y.、Shibuya，A.、Song，C.、Kim，S.、Tono，K.、Yabashi，M.、Tamakoshi，M、Moriya，T、Oshima，T.，Ishikawa，T.和Bessho，Y.&Nishino，Y.（2014）。自然公社。 5, 3052. 交叉参考谷歌学者
 Kraus，J.、Reichelt，R.、Gunther，S.、Gregoratti，L.、Amati，M.、Kiskinova，M.，Yulaev，A.、Vlassiouk，I.和Kolmakov，A.（2014）。纳米级,6，14394–14403交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 库皮茨，C。等。(2014).自然（伦敦）,513, 261–265. 科学网交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 Liu，Q.，Liu，Q.&Hendrickson，W.A.（2013）。《水晶学报》。天69, 1314–1332. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Liu，W.，Wacker，D。等。(2013).科学类,342, 1521–1524. 交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 Lyubimov，A.Y.、Murray，T.D.、Koehl，A.、Araci，I.E.、Uervirojnangkoorn，M.、Zeldin，O.B.、Cohen，A.E.、Soltis，S.M.、Baxter，E.L.、Brewster，A.S.、Sauter，N.K.、Brunger，A.T.和Berger，J.M.（2015）。《水晶学报》。天71, 928–940. 科学网交叉参考 IUCr日志谷歌学者
 Marinaro，G.、Accardo，A.、De Angelis，F.、Dane，T.、Weinhausen，B.、Burghamer，M.和Riekel，C.（2014）。实验室芯片,14, 3705–3709. 交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 McCoy，A.J.、Grosse-Kunstleve，R.W.、Adams，P.D.、Winn，M.D.、Storoni，L.C.和Read，R.J.（2007年）。J.应用。克里斯特。 40, 658–674. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Meyer，J.C.，Geim，A.K.，Katsnelson，M.I.，Novoselov，K.S.，Booth，T.J.&Roth，S.（2007）。自然（伦敦）,446, 60–63. 交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Moukhametzianov，R.、Burghammer，M.、Edwards，P.C.、Petitdemange，S.、Popov，D.、Fransen，M.，McMullan，G.、Schertler，G.F.X.和Riekel，C.（2008）。《水晶学报》。天64, 158–166. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Nelson，R.、Sawaya，M.R.、Balbirnie，M.、Madsen，A.O.、Riekel，C.、Grothe，R.和Eisenberg，D.（2005）。自然（伦敦）,435, 773–778. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Northen，M.T.和Turner，K.L.（2005）。纳米技术,16, 1159–1166. 交叉参考中国科学院谷歌学者
 Perrakis，A.、Cipriani，F.、Castagna，J.-C.、Claustre，L.、Burghammer，M.、Riekel，C.和Cusack，S.（1999）。《水晶学报》。天55, 1765–1770. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Rasmussen，S.G.F.，Choi，H.-J.，Rosenbaum，D.M.，Kobilka，T.S.，Thian，F.S.、Edwards，P.C.，Burghammer，M.，Ratnala，V.R.，Sanishvili，R.，Fischetti，R..，Schertler，G.F.X.，Weis，W.I.&Kobilca，B.K.（2007年）。自然（伦敦）,450, 383–387. 交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 拉斯穆森，S.G.F。等。(2011).自然（伦敦）,477, 549–555. 科学网交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 雷德克，L。等。(2013).科学类,339, 227–230. 科学网交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 Sanchez-Weatherby，J.、Bowler，M.W.、Huet，J.，Gobbo，A.、Felisaz，F.、Lavault，B.、Moya，R.、Kadlec，J.和Ravelli，R.B.G.&Cipriani，F.（2009年）。《水晶学报》。天65, 1237–1246. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Sanishvili，R.、Nagarajan，V.、Yoder，D.、Becker，M.、Xu，S.、Corcoran，S.，Akey，D.L.、Smith，J.L.和Fischetti，R.F.（2008）。《水晶学报》。天64，425–435科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Sanishvili，R.、Yoder，D.W.、Pothineni，S.B.、Rosenbaum，G.、Xu，S.、Vogt，S.和Stepanov，S.，Makarov，O.A.、Corcoran，S.。、Benn，R.和Nagarajan，V.、Smith，J.L.和Fischetti，R.F.（2011）。程序。美国国家科学院。科学。美国,108，6127–6132科学网交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 萨瓦亚，M.R。等。(2014).程序。美国国家科学院。科学。美国,111, 12769–12774. 科学网交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 塞拉·R·G·。等。(2012).《水晶学报》。天68，1584年至1587年科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Smith，J.L.、Fischetti，R.F.和Yamamoto，M.（2012）。货币。操作。结构。生物。 22, 602–612. 科学网交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 F.斯特拉托。等。(2014).IUCrJ大学,1, 204–212. 科学网交叉参考中国科学院公共医学 IUCr日志谷歌学者
 Stepanov，S.、Makarov，O.、Hilgart，M.、Pothineni，S.B.、Urakhchin，A.、Devarapalli，S.，Yoder，D.、Becker，M.，Ogata，C.、Sanishvili，R.、Venugopalan，N.、Smith，J.L.和Fischetti，R.F.（2011）。《水晶学报》。天67, 176–188. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Tanaka，H.（2014）。同步辐射。新闻,27，23–26交叉参考谷歌学者
 Tilton，R.F.Jr，Dewan，J.C.&Petsko，G.A.（1992年）。生物化学,31，2469–2481交叉参考公共医学中国科学院科学网谷歌学者
 Uervirojnangkoorn，M.，Zeldin，O.B.，Lyubimov，A.Y.，Hattne，J.，Brewster，A.S.，Sauter，N.K.，Brunger，A.T.&Weis，W.I.（2015）。埃利夫,4，e05421交叉参考谷歌学者
 Walther，F.、Davydovskaya，P.、Zürcher，S.、Kaiser，M.、Herberg，H.、Gigler，A.M.和Stark，R.W.（2007年）。J.微型机械。马略能。,17, 524–531. 交叉参考中国科学院谷歌学者
 Warne，T.、Serrano-Vega，M.J.、Baker，J.G.、Moukhametzianov，R.、Edwards，P.C.、Henderson，R.，Leslie，A.G.W.、Tate，C.G.和Schertler，G.F.X.（2008）。自然（伦敦）,454, 486–491. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Weierstall，美国。等。(2014).自然社区。 5, 3309. 科学网交叉参考谷歌学者
 Weierstall，U.，Spence，J.C.H.&Doak，R.B.（2012）。科学评论。仪器。 83, 035108. 科学网交叉参考公共医学谷歌学者
 Wells，G.M.（1992）。J.真空。科学。Technol公司。B类,10, 3252–3255. 交叉参考中国科学院谷歌学者
 Zarine-Afsar，A.，Barends，T.R.M.，Müller，C.，Fuchs，M.R.，Lomb，L.，Schlichting，I.&Miller，R.J.D.（2012）。《水晶学报》。天68, 321–323. 科学网交叉参考 IUCr日志谷歌学者
 Zheng，B.、Tice，J.D.、Roach，L.S.和Ismagilov，R.F.（2004）。安圭。化学。国际编辑。 43, 2508–2511. 科学网交叉参考中国科学院谷歌学者