1.简介

产气荚膜梭菌是一种厌氧、孢子形成细菌，广泛存在于各种环境条件中，包括土壤、海洋沉积物、人类肠道和其他脊椎动物（McClane，2007; 布林斯塔德和格拉姆出版社，2002年; 草地等。, 2013). 这种高致病性的革兰氏阳性细菌是美国第二大食源性疾病的常见病因，据估计每年有100万份报告（Scallan等。, 2011). 此外，产气荚膜杆菌分离物可能导致非食源性人类胃肠道疾病的发展，包括散发性腹泻和抗生素相关腹泻（柯利犬等。, 1998). 发病机制产气荚膜杆菌-衍生食源性疾病通常源于生食和熟食中的孢子在含氧条件下的萌发（Jenuja等。, 2010). 值得注意的是，孢子的形成与生物体的生存模式有关，这种生存模式使其能够抵抗极端温度，包括热处理和制冷（Jenuja等。, 2010; 强大等。, 1966; Traci&Duncan，1974年). 一旦消化，产气荚膜杆菌分离物在肠道中发芽，在那里产生产气荚膜杆菌肠毒素（CPE），导致胃肠道疾病（Jenuja等。, 2010).

致病性的确切机制产气荚膜杆菌分离物仍不清楚，已经确定了一些促进该生物体存活的因素（奥尔斯本等。, 2008). 与许多致病性革兰氏阳性菌一样，产气荚膜杆菌在其细胞壁上显示并锚定多种表面蛋白，具有适应极端环境条件、逃避宿主免疫系统和毒力（Hendrickx等。, 2011; Marraffi&Schneewind，2006年). 其中许多蛋白质的共价连接是由所谓的分拣酶介导的，分拣酶是一个独特的膜结合半胱氨酸转肽酶家族，最初在金黄色葡萄球菌（马兹马尼亚语等。, 1999). 机械上，分拣站催化活性最适合用于金黄色葡萄球菌排序酶A，其中该酶识别一个独特的五肽排序基序（Leu-Pro-X（X）-Thr-Gly，LP公司X（X）TG，其中X（X）表示位于羧基末端（克鲁格）的细胞壁分选信号（CWSS）区域内的任何氨基酸等。, 2004; 吨-那等。, 1999). 识别后，排序酶A（SrtA）裂解Thr-Gly肽键，导致C末端甘氨酸的丢失和硫酰基中间体（Kruger等。, 2004; 吨-那等。, 1999). 随后，低聚甘氨酸的存在充当亲核剂离解酰基-酶中间体并促进低聚甘氨酸的自由氨基与Thr羧基的sortase辅助共价偶联（Suree等。, 2009; 韦纳等。, 2010).

除了通用的家政酶SrtA外，分拣酶在系统发育上还可以分为其他五个不同的类别（Suree等。, 2007). 后一类显示了更专门的角色。例如，分拣酶B家族的成员对铁的收购具有催化作用（马雷索等。, 2006; Maresso&Schneewind，2006年; 马兹曼尼亚语等。, 2002, 2003)和C类分拣酶主要负责菌毛的组装，菌毛参与微生物粘附和生物膜的形成（Spirig等。, 2011; 科齐等。, 2012, 2013; 哈雷等。, 2011; 曼扎诺等。, 2008; 奈尔斯等。, 2009; 佩尔森，2011年; 吴等。, 2012). 关于D类、E类和F类酶知之甚少。D类分类酶被认为可以在含氧环境中诱导孢子形成（Marraffi&Schneewind，2006）, 2007)，以及对炭疽杆菌SrtD显示出对Leu-Pro-Asn-Thr-Ala（LPNTA）信号基序的专属偏好（Marraffi&Schneewind，2006）). 有趣的是，炭疽杆菌还表达识别典型LP（A/N/K）TG信号基序的A类分类酶。尽管信号基序在序列上只略有不同炭疽杆菌SrtA和SrtD功能无冗余，表明对各自信号基序的进化特异性（Marraffini和Schneewind，2006). 功能分析进一步表明炭疽杆菌SrtD在孢子形成的不同阶段发挥作用，包括酸性表面蛋白BasH附着在发育中的前孢子（前体孢子；Marraffini&Schneewind，2006）的肽聚糖上)以及BasI表面蛋白在预先分裂的孢子细胞包膜上的呈现（Marraffi&Schneewind，2007).

在当前研究中，我们提出了晶体结构的产气荚膜杆菌转肽酶属于D类分类酶家族，提示该酶在产气荚膜杆菌孢子形成。生物化学，重组产气荚膜杆菌SrtD公司(内容提供商SrtD）具有催化活性，对Leu-Pro-Gln-Thr-Gly-Ser（LPQTGS）信号基序具有高度偏好性。此外，内容提供商SrtD公司催化活性也依赖于金属阳离子，镁的存在似乎增强了内容提供商SrtD对LPQTGS信号基序的催化作用。的结构内容提供商SrtD不同于先前报道的炭疽杆菌分拣基地D（罗布森等。, 2012)导致我们提出产气荚膜杆菌排序酶D是D型排序酶家族的一个新的亚类。

2.材料和方法

2.4. 数据收集和结构确定

在澳大利亚同步加速器的MX-2微焦点光束线上，从一个已经被低温冷却到100 K的晶体上获得了360 1°的图像。反射使用XDS公司（Kabsch，2010年)并使用缩放无AIMLESS（埃文斯，2011年).ClustalW公司用于对齐产气荚膜杆菌用PDB条目中的序列对序列进行排序第三代66（奈尔斯等。, 2009)、和CHAINSAW公司（斯坦因，2008)然后与PDB条目一起使用第三代66（估计序列一致性为21%）以获得相位器（麦考伊等。, 2007)，用于获得初始相位。首字母相位器输出LLG为21.5Z轴-5.8分。两个分子被放置在非对称单元解决方案的最终输出值为LLG=90.7，TFZ=7.2R（右）值为56.8。模型最初是使用重新构建的海盗（Cowtan，2006年)然后使用手动重建库特（埃姆斯利等。, 2010)并使用REFMAC公司（穆尔舒多夫等。, 2011). 数据完成99.5%，分辨率为1.99？，最终模型具有R（右）_工作17.6%和R（右）_自由的21.3%（见表1用于晶体统计）。根据PDB报告，97%的残留物位于Ramachandran图的最有利区域，3%位于允许区域，没有异常值。

表1 数据收集和细化统计对于内容提供商SrtD公司 括号中的值表示外壳。 数据收集  “空间”组 P（P）21  单位-细胞参数（Ω，°） 一= 38.8,b条= 65.6,c（c）= 68.1,α= 90.0,β= 93.86,γ= 90.0  分辨率（Ω） 47.2–1.99 (2.09–1.99)  R（右）合并† 0.074 (0.626)  R（右）下午。‡ 0.029 (0.252)  科科斯群岛1/2 0.999 (0.843)  〈我/σ(我) 18.0 (3.2)  完整性（%） 99.5 (97.1)  多重性 7.5 (7.0) 精炼  分辨率（Å） 47.2–1.99  独特的反射 22304  R（右）工作/R（右）自由的§(%) 17.6/21.3  原子数   总计 2621   蛋白质 2526   其他/离子 0   水 95  B因子（λ2)   蛋白质 38.4   水 37.2  R.m.s.偏差¶   粘结长度（Ω） 0.016   结合角（°） 1.687  PDB代码 4天70 †R（右）合并=. ‡R（右）下午。 . §R（右）工作=并且使用所有数据进行计算；R（右）自由的是R（右）基于排除在外的5%数据的因子精细化。 ¶R.m.s.d.是理想值的平方根偏差（Engh&Huber，1991）).

3.结果

3.1. 的总体结构产气荚膜杆菌转肽酶

在本研究中，我们报告了晶体结构的产气荚膜杆菌排序酶的分辨率为1.99º分子置换（表1). 重组产气荚膜杆菌分拣酶结晶于空间组 P（P）2₁晶体中有两个分子非对称单元（补充图S3b条). 从X射线数据得到的最终图谱显示，160个残基（28–187）的密度清晰，只缺少前五个残基以及N末端六组氨酸标签和凝血酶裂解位点。两个单体的比对显示，r.m.s.d.值小于0.53 Au，在α1–α2螺旋-转弯-螺旋结构（补充图S3c（c）). 每个单体都显示出典型的八种β-形成β-筒体结构（图1). 这种独特的桶结构也存在于其他分拣中（图2一)它是酶家族的标志。在所有分拣酶中观察到的第二个显著特征是保守活性位点的表面呈现，由组氨酸和精氨酸残基包围的催化半胱氨酸组成（图2一). 先前的研究表明组氨酸和精氨酸的存在对于保守的半胱氨酸残基（Frankel等。, 2007; 克兰西等。, 2010). 这些关键残留物也存在于产气荚膜杆菌分拣酶，催化半胱氨酸位于β171位置处的7股（图1). 相邻的精氨酸存在于β8链位于位置178，而组氨酸位于β3–α残渣109处的4个回路（图1).

图1 的总体结构产气荚膜杆菌排序酶D。的二级结构产气荚膜杆菌分拣酶D单体A类由红色3表示10-螺旋线和α-螺旋和黄色β-绞线（PDB入口第47天). 酶的N端和C端已标明。图中显示了由His109（蓝色）、Cys171（紫色）和Arg178（橙色）组成的保守催化三联体。黄色β-股形成β-通常在酶的分类酶家族中观察到的桶结构（右侧）。图形是使用生成的PyMOL公司（v.1.5.0.4；薛定谔）。

图2 比较产气荚膜杆菌分类酶D和转肽酶A~D类的代表。(一)的二级结构产气荚膜杆菌分类酶D(内容提供商SrtD；PDB条目第47天)，以及金黄色葡萄球菌分选酶A(Sa公司SrtA；PDB条目1t2便士; 宗等。, 2004)，金黄色葡萄球菌分类酶B(Sa公司SrtB；PDB条目1ng5（下一代）; 张等。, 2004)，肺炎链球菌分类酶C-2(服务提供商SrtC2；PDB条目第三代66; 奈尔斯等。, 2009)和炭疽杆菌分拣箱D（BaSrtC；PDB条目2磅7; 罗布森等。, 2012)用红色3表示10-螺旋线和α-螺旋线和黄色β-股。C类排序酶的“盖子”结构用黑色表示，而保守的半胱氨酸、组氨酸和精氨酸残基分别用紫色、蓝色和橙色表示。天冬氨酸的保守残基Sa公司SrtB显示为粉红色。图形是使用生成的PyMOL公司. (b条)全长之间的序列对齐内容提供商SrtD、，Sa公司SrtA、，Sa公司SrtB中，服务提供商SrtC2和文学士SrtC，显示相同的氨基酸（以红色突出显示）和高度相似的残基（以黄色突出显示）。保守的半胱氨酸、组氨酸和精氨酸用星号表示。序列比对是使用生成的ClustalW欧米茄（高戎等。, 2010; Sievers公司等。, 2011).

初步序列分析表明产气荚膜杆菌分选酶属于转肽酶的D类5亚科（Dramsi等。, 2005)，也称为E类分类酶（SrtE；Spirig等。, 2011). 对比序列分析产气荚膜杆菌用先前确定的对D进行分类金黄色葡萄球菌分类酶A(Sa公司SrtA）和分拣箱B(Sa公司SrtB），肺炎链球菌分类酶C-2(服务提供商SrtC2）和炭疽杆菌分选酶D(文学士SrtC）在其氨基酸序列中显示出约18、25、26和28%的同源性（图2b条). 氨基酸序列之间的稀疏相似性产气荚膜杆菌sortase及其家族中A~D类的成员进一步强调了产气荚膜杆菌转肽酶可能属于一个新的类别。

3.2.产气荚膜杆菌分拣酶识别LPQTGS信号基序以进行转录

在大多数分类酶中观察到的一个显著特征是它们能够优先识别催化的特定信号基序。识别优选的信号基序产气荚膜杆菌为了实现高效催化，我们进行了一系列在体外使用由淀粉样蛋白的前16个氨基酸残基组成的底物进行转肽反应-β（A）β_1–16)肽在C-末端与LPETG、LPNTGS、LPQTGS或LAETG排序基序融合。这组底物代表被不同类别的分选酶家族识别的信号基序，包括A类（LPETG）、D类（LPNTGS和LPQTGS）和E类（LAETG）。使用抗-A的蛋白质印迹分析β抗体检测内容提供商SrtD–底物硫酰基中间体显示无内容提供商SrtD公司催化活性朝向E类信号图案（图3一，车道5，顶部面板）和朝向LPETG的最小活动（图3一，通道2，顶板）或LPNTGS（图3一，3号通道，顶部面板）信号图案。相反，重组内容提供商SrtD表现出对LPQTGS基序的强烈偏好（图3一，通道4，顶部面板）。

图3 内容提供商SrtD识别并切割LPQTGS排序基序在体外. (一)重组内容提供商SrtD在不存在（通道1）或存在A的情况下培养β1–16 肽类融合到LPETG（车道2）、LPNTGS（车道3）、LPQTGS（车道4）或LAETG（通道5）排序图案。(b条)重组体的催化效率内容提供商SrtD朝向Aβ1–16-LPQTGS基板是在室温（RT，第2通道）、303 K（第3通道）、310 K（第4通道）、316 K（第一通道）或323 K（最后通道）下测量的。(c（c）)内容提供商SrtD在没有EDTA（第1通道）或存在EDTA的情况下预先培养，浓度为1mM（M）（车道2），2 mM（M）（车道3），5 mM（M）（车道4），10 mM（M）（车道5），20 mM（M）（6号车道），50 mM（M）（7号车道），100 mM（M）（8车道）或200 mM（M）（9号车道）。EDTA处理内容提供商然后用A培养SrtDβ1–16-测定LPQTGS和形成硫酰中间体的能力。(d日)EDTA处理（100 mM（M）)内容提供商SrtD与A孵育β1–16-不存在金属离子（泳道1）或存在10 m时的LPQTGSM（M）钙2+（车道2），Cu2+（3号车道），Co2+（4号车道），Fe3+（车道5），镁2+（6车道），Mn2+（7号车道），Ni2+（8号车道）或Zn2+（9号车道）。硫酰基中间体的形成(一), (b条)和(c（c）)用小鼠进行Western blot分析α-？A公司β（WO2）抗体（顶部面板），并使用小鼠评估等负荷α-他的5抗体（底部面板）。

4.讨论

之前的一份报告建议产气荚膜杆菌本研究中描述的分拣酶属于E类分拣酶家族（Spirig等。2011年). 在结构层面，重组产气荚膜杆菌sortase展示了经典β-在所有分拣酶中都发现了桶形结构，并且在171位显示了保守的催化半胱氨酸，两侧是组氨酸和精氨酸残基（图1). 尽管有以前的报告，我们的生化数据表明产气荚膜杆菌排序酶不属于转肽酶E类家族，因为它不能识别和催化LAETG基序（图3一，通道5），这类酶首选的排序信号基序（Duong等。, 2012). 相反，重组产气荚膜杆菌分拣酶对D类信号基序LPQTGS表现出有效的催化作用（图3一，泳道4），强调了产气荚膜杆菌分拣酶属于D类酶家族(内容提供商SrtD）在厌氧条件下负责孢子形成。额外的生化分析进一步证明了这一观点内容提供商SrtD在316 K时催化效率最高（图3b条)，这是报告的最佳诱导孢子形成的温度产气荚膜杆菌分离物（Garcia-Alvarado等。, 1992). 我们关于内容提供商SrtD衬底选择性也通过分析产气荚膜杆菌菌株13基因组，这表明该排序酶基因与一个假想的细胞壁锚定蛋白（CPE_RS01465）聚集在同一操纵子中，该操纵子具有C末端LPQTGS信号基序，因此，LPQTGS基序可能是该酶的天然底物之一（清水等。, 2002).

比较序列分析表明产气荚膜杆菌排序酶D与之前报道的从炭疽杆菌（不幸地称为文学士SrtC；罗布森等。, 2012)氨基酸序列的同源性仅为28%（图2b条). 二级结构的叠加揭示了这两种酶之间的进一步差异，计算的r.m.s.d.为1.7º（图4一). 最显著的区别是N末端的存在α-螺旋进入产气荚膜杆菌中缺少的SrtD炭疽杆菌SrtD结构。以前，只观察到B类和C类分拣显示长N端α-螺旋（图2一). C类排序酶的N末端区域在催化中起着重要作用，其中α-螺旋线位于形成所谓“盖子”结构的灵活环形区域的侧面（图2一)被认为负责控制基质进入SrtC催化现场（哈雷等。, 2011; 曼扎诺等。, 2009; 奈尔斯等。, 2009). 在所有C类分类酶的“lid”结构中，都存在由Asp-Pro-Try/Trp/Phe（DPY/W/F；Cozzi等。, 2013; 哈雷等。2011年; 曼扎诺等。, 2009)，并且“lid”域内的关键残基的点突变对于C类分类酶的激活是必要的在体外（科齐等。, 2013). 相反，重组内容提供商SrtD以野生型形式催化活性在体外（图3)，序列分析表明该酶中不存在保守的“lid”结构域（图2b条). 因此，N端可能α-螺旋出现在产气荚膜杆菌排序酶D具有不同的功能（尽管未知）。N端的作用α-排序酶B中的螺旋也未知；然而，两者金黄色葡萄球菌和炭疽杆菌排序酶B可以与其他类别的排序酶区分开来，包括产气荚膜杆菌通过活性位点内存在额外的保守残基（Jacobitz等。2014年; 张等。, 2004). 这些B类分类酶具有一个保守的天冬氨酸（位于223Sa公司SrtB；图2一)它在控制底物特异性而不影响整体转肽活性方面具有建议的作用（雅各比茨等。2014年). 分拣酶B的总体结构表示α和β结构，有八个β-形成β-筒体核心结构由若干长短包围α-螺旋（图2一). 相反金黄色葡萄球菌sortase结构主要由连接β-筒体结构（图2一). 因此，与内容提供商SrtD和分类酶B和C，其中它主要由螺旋-转向-螺旋组成Sa公司SrtA是非结构化的（图2一). 值得注意的是，与其他类别的分拣酶相比Sa公司SrtA位于活性部位的对面（图2一). 这表明了Sa公司细菌细胞壁上的SrtA，活性部位可能暴露在表面并远离细胞壁。如前所述Sa公司SrtB和文学士SrtB（张等。, 2004)，当锚定在细菌细胞壁上时，剩余类别的分选酶的活性位点可以被部分掩埋，因为活性位点与它们的N-末端位于蛋白质的同一平面上。

图4 产气荚膜杆菌分拣酶D不同于从炭疽杆菌. (一)的叠加产气荚膜杆菌（蓝色；PDB条目4天70)和炭疽杆菌（黄金；PDB入场券2磅7)对D结构进行分类。(b条)比较显示存在两个转弯的独特回路α-内螺旋产气荚膜杆菌分拣酶D（橙色）β2–β中不存在的3个回路炭疽杆菌SrtD回路（绿色）。这个β2–β3和βPDB结构中发现4–H1环无序2磅7但在产气荚膜杆菌对D结构进行分类。图形是使用生成的PyMOL公司.

对两种D类酶的分析进一步揭示了一种独特的α-螺旋结构内容提供商连接β2和β3股（图4b条). 相比之下β2–β3回路输入炭疽杆菌分类酶D是不间断的，NOESY谱表明这个环中的残基以及连接环中的残留β4和α1，表现出与蛋白质相关的共振线展宽齐聚（罗布森等。, 2012). 相比之下，我们的结晶研究表明内容提供商SrtD可能以单体形式存在。凝胶过滤分析支持这一观点，揭示了一个分子量与产气荚膜杆菌分拣酶D单体（补充图S1一). 此外，动态光散射（DLS）实验测量酶的流体动力学半径也表明，在结晶研究中使用的浓度（20 mg ml⁻¹)重组内容提供商SrtD可能是单体的（补充图S4）。尚不清楚是否存在α-螺旋结构内容提供商SrtD在迫使酶采用单体形式方面发挥作用；需要进一步的突变和结构研究来阐明这一点。总体α-螺旋结构内容提供商SrtD公司晶体结构与炭疽杆菌排序酶D。我们研究中使用的结晶缓冲条件可能提供了一个更具生理性的环境（氯化钠和醋酸铵盐在200米左右M（M）与核磁共振条件相比，核磁共振条件仅为20 mM（M）HEPES缓冲区），允许适当折叠表面二级结构；进一步的解决方案研究炭疽杆菌在更多生理缓冲条件下的排序酶D结构对提供更好的比较分析很重要。

这两种D类酶也可以在催化水平上进一步分化，其中分拣酶表现出对特定分拣信号基序的不同偏好。如前所述产气荚膜杆菌分类酶D对LPQTGS信号基序具有催化活性，但对LPNTGS信号基序的催化效率很低（图3一)与LPNTAS图案非常相似炭疽杆菌分拣基地D（罗布森等。, 2012). 此外，这两种酶在不同温度下都具有催化活性产气荚膜杆菌分拣酶D在316 K下证明有效催化在体外（图3b条). 有趣的是，虽然炭疽杆菌分拣酶D在室温下具有催化活性（罗布森等。, 2012)，我们的重组产气荚膜杆菌在这个温度下培养时，分拣酶D效率很低在体外（图3b条). LQPTGS信号基序在内容提供商SrtD催化裂缝尚不清楚；然而，与以往的结构研究相比Sa公司SrtA–LPAT综合体提供了一些见解（Zong等。, 2004). 而催化裂解的环境内容提供商SrtD在底物结合的疏水残基中同样丰富，由于小螺旋位于β6–β与相比时为7圈Sa公司SrtA公司。因此，有可能内容提供商SrtD需要底物诱导的构象变化来促进LPQTGS基序的正确结合，但还需要进行额外的结构研究来进一步阐明这一点。

总的来说产气荚膜杆菌本研究中报道的分拣酶D在结构和催化上与之前报道的从炭疽杆菌，表明内容提供商SrtD可能代表排序酶D家族的一个新的亚类。我们的结构和生化分析表明内容提供商SrtD促进孢子形成，这将进一步深入了解源于产气荚膜杆菌感染。最终，这些研究可能会导致开发新的抗菌剂来控制与这种高致病性细菌相关的食源性疫情。