1.简介
幽门螺杆菌是一种螺旋形革兰氏阴性细菌,定植于人类胃中。它定植于世界上大约一半的人口,其胃粘膜感染与各种上消化道疾病有关,如慢性胃炎、消化性溃疡、粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤和胃腺癌(Roesler等。2014年; 库斯特等。, 2006).幽门螺杆菌被国际癌症研究机构归类为I类致癌物,并被视为胃癌发展的主要因素(国际癌症研究署,1994年). 近年来,幽门螺杆菌感染也与一些消化外疾病有关(鲁鲍德·鲍德伦等。, 2013). 相对有效的治疗方案可用于幽门螺杆菌通常由质子泵抑制剂如奥美拉唑、抗生素克拉霉素和阿莫西林(或甲硝唑)组成的感染。然而,抗生素耐药性的增加需要新的治疗方法和新抗生素的发现(马尔弗海纳等。, 2012).
高运动性幽门螺杆菌对其在人类胃中的定植及其在胃粘膜中的存活至关重要(Ottemann&Lowenthal,2002; 施赖伯等。, 2004; Lertsethtakarn公司等。, 2011). 螺旋或螺旋细胞形状幽门螺杆菌被认为有助于粘稠上皮粘液层的有效定植通过螺旋塞机制(Berg&Turner,1979); 榛子等。, 1986; 沃尔库等。, 1999).幽门螺杆菌细胞形状改变的突变体的定殖能力减弱(Bonis等。, 2010; 西库罗等。, 2010, 2012; 弗里迪奇等。, 2012; 威科夫等。, 2012). 这个肽聚糖细菌细胞壁的一层不仅在承受膨胀压力方面发挥作用,而且在保持细胞形状方面也发挥作用(Scheffers&Pinho,2005; Vollmer&Bertsche,2008年). 细菌的重要组成部分肽聚糖是由交替排列的线性多糖链β-1,4-连接N个-乙酰氨基葡萄糖(NAG)和N个-乙酰氨基甲酸(NAM)双糖,与NAM相连的五肽(Vollmer,Blanot等。, 2008). 呈螺旋形幽门螺杆菌,五肽序列是L(左)-阿拉1-γ-D类-谷氨酸2-米目的地交货三-D类-阿拉4-D类-阿拉5,其中米DAP指中尺度的-2,6-二氨基苯丙酸及其邻体肽类仅由D类-阿拉4单链和侧链米目的地交货三另一股(科斯塔等。, 1999)形成网状结构(Meroueh等。, 2006). 在许多细菌中肽聚糖层由许多细胞壁重新建模水解酶类以及合成酶肽聚糖成熟,调节细胞壁生长,细胞分裂,肽聚糖周转和再循环、细胞裂解和释放肽聚糖宿主与病原体相互作用的片段(Vollmer,Joris等。, 2008).
至少7个幽门螺杆菌确定螺旋细胞形状所需的基因:csd1型,csd2型,csd3型/高密度蛋白A,立方厘米安,csd4型,csd5型和csd6型(西库罗等。, 2010, 2012, 2013; 博尼斯等。, 2010). 它们在确定幽门螺杆菌通过放松肽聚糖交联或将五肽剪短肽类在里面肽聚糖。其中,Csd3/HdpA蛋白以及Csd1和Csd2属于MEROPS M23B金属肽酶家族(Sycuro等。, 2010; 博尼斯等。, 2010). 删除csd1型,csd2型和csd3型基因减少了D类,D类-内肽酶(D类,D类-EPase)活性,可裂解D类-阿拉4-米目的地交货三四肽和五肽交联二聚体中的肽键-L(左)-阿拉1-γ-D类-谷氨酸2-米目的地交货三-D类-阿拉4和穆拉梅尔-L(左)-阿拉1-γ-D类-谷氨酸2-米目的地交货三-D类-阿拉4-D类-阿拉5分别为;博尼斯等。, 2010; 西库罗等。, 2010).
有趣的是csd3型基因(Δcsd3型)表示Csd3有一个额外的D类,D类-羧肽酶(D类,D类-CPase)裂解D类-阿拉4-D类-阿拉5胞壁五肽与胞壁四肽的结合D类-阿拉(Bonis)等。, 2010; 西库罗等。, 2010). 根据这一观察,Δcsd3型显示不规则的C形或粗壮的分支细胞,与Δcsd1型和Δcsd2型细胞(骨骼等。, 2010; 西库罗等。, 2010). H259A突变使Csd3失活,预计会影响活性部位的金属配位,也会导致与Δcsd3型(骨头等。, 2010).幽门螺杆菌含有高水平的非交联五肽肽聚糖球囊(科斯塔等。, 1999). Csd3的双功能肽酶活性以及这一观察结果使Csd3成为幽门螺杆菌形态学。
尽管螺旋细胞的形状决定蛋白发挥着重要作用幽门螺杆菌在促进胃定植方面,关于它们的结构报道非常有限。我们最近确定了幽门螺杆菌Csd4,a锌2+-从属的D类,L(左)-CPase和M14金属肽酶家族的一个独特成员(Kim等。2014年). 它切断了两者之间的联系γ-D类-谷氨酸2和米目的地交货三非交联的胞壁酰三肽(胞壁酰-L(左)-阿拉1-γ-D类-谷氨酸2-米目的地交货三)的肽聚糖产生胞壁酰二肽(胞壁酰-L(左)-阿拉1-γ-D类-谷氨酸2)和米DAP公司。虽然Csd3和Csd4在决定螺旋细胞形状方面都起着重要作用,但它们的氨基酸序列是无关的。遗传相互作用研究csd3型和csd4型基因显示Csd4D类,L(左)-CPase活性不依赖于Csd3 CPase/EPase活性反之亦然(西库罗等。, 2012).
为更好地理解幽门螺杆菌Csd3,我们在这里报道晶体结构N末端截断的Csd3,包含残基42–403(Csd3Δ41). 它由三个域组成:域1(残基Glu42–Ile124)、域2(残基Ile125–Gly228和Ala360–Phe403)和C末端LytM域(残基Phe229–Thr359)。尽管序列同源性很低,但Csd3结构域1和结构域2的核心(残基Ile125–Gly228)共享一个共同的折叠。Csd3的LytM结构域在结构上与其他MEROPS M23家族金属肽酶的相应结构域相似。与LytM结构域活性位点结合的底物被我们结构中的结构域1阻断,这表明结构域1是抑制结构域,我们的Csd3结构处于潜在状态。结构域2的核心通过从LytM结构域伸出的C末端延伸尾部区域与LytM区域保持稳定。这项工作可以作为发现新型抑制剂的基础,这些抑制剂可能有助于对抗主要人类病原体的感染幽门螺杆菌.
2.材料和方法
2.1、。蛋白质表达和纯化
编码N-末端截短形式的基因(残基42-403;Csd3Δ41)第页,共页幽门螺杆菌利用NdeI和XhoI限制性酶位点对Csd3(来自26695菌株的HP0506)进行PCR扩增并克隆到表达载体pET-21a(+)(Novagen)中。该重组蛋白在其C末端与含有六组氨酸的标签(LEHHHHH)融合,在大肠杆菌Rosetta 2(DE3)pLysS细胞。细胞在37°C下在含有50µg ml的Terrific Broth培养基中生长−1氨苄西林。蛋白质表达由0.5米诱导M(M)异丙基β-D类-1-硫代吡喃半乳糖苷和细胞在30°C下再培养15小时。细胞在5600℃离心收集克在4°C下保持15分钟,然后在冰镇缓冲液中通过超声波进行溶解A类[20米M(M)Tris–HCl pH值7.9500 mM(M)氯化钠,50 mM(M)咪唑,10%(v(v)/v(v))甘油],添加1mM(M)苯甲基磺酰氟,60米M(M)氯化铵和15 mM(M)醋酸镁。裂解液在36000下离心克在4°C下放置1小时以丢弃细胞碎片。将上清液涂敷在之前与缓冲液平衡的HiTra螯合HP亲和色谱柱(GE Healthcare)上A类用咪唑线性梯度从50 m处洗脱柱M(M)缓冲区内A类至500米M(M)缓冲区内B,包括20米M(M)Tris–HCl pH值7.9500 mM(M)氯化钠,500米M(M)咪唑,10%(v(v)/v(v))甘油。Csd3蛋白在125−150 m处洗脱M(M)通过在HiLoad 16/60 Superdex 200预颗粒色谱柱(GE Healthcare)上的凝胶过滤,在两种不同的盐条件下,使用缓冲液进一步纯化咪唑浓度C类(20米M(M)Tris–HCl pH值7.9400 mM(M)氯化钠)或缓冲液D类(20米M(M)Tris–HCl pH值7.9200 mM(M)氯化钠,0.1 mM(M)氯化锌)。两个不同批次的Csd3产生不同的晶体形式,如下所述。经SDS-PAGE分析,纯化的蛋白质是均一的。将含有重组Csd3的组分混合并浓缩至10 mg ml−1(0.24米M(M))使用Amicon Ultra-15离心过滤装置(Millipore)进行结晶。
2.2. 结晶
使用蚊子机器人系统(TTP Labtech),通过坐滴蒸汽扩散法在23°C下生长晶体。在不同的结晶条件下,我们获得了两种类型的天然晶体(形式1和形式2)。对于形态1晶体,通过混合0.4µl储液罐溶液[160 mM(M)硫酸铵,80 mM(M)醋酸钠pH 4.6,20%(v(v)/v(v))聚乙二醇4000,20%(v(v)/v(v))甘油]和0.4µl纯化蛋白缓冲液C类在几天内,伸长的矩形晶体生长到大约0.3×0.3×0.3 mm的尺寸。对于形态2晶体,重组Csd3Δ41缓冲液中纯化的蛋白质D类用缓冲液预先培养D类补充1mM(M)结晶设置前,氯化锌在冰下放置30分钟。通过混合0.3µl储液罐溶液[200 m制备坐液M(M)磷酸氢二铵,pH 7.9,20%(v(v)/v(v))PEG 3350]和0.3µl蛋白质溶液。六角双锥晶体在几天内生长到约0.2×0.2×0.3 mm的尺寸。
2.5. 反常散射法识别结合金属离子
测试金属结合部位是否被锌占据2+在浦项光源光束线5C上,在100K、1.2820μl的X射线波长下,从形态1和形态2晶体中收集离子、SAD数据(补充表S1)。异常差异图使用快速傅里叶变换(Immirzi,1966年; Ten Eyck,1973年)来自中央处理器4软件包。
2.6. 平衡沉降
平衡沉降实验是使用Beckman ProteomeLab XL-a分析超离心机在缓冲液中进行的C类温度为4°C。重组Csd3Δ41通过使用六个扇形细胞在三种转速(12000、14000和18000转/分)下测量280nm处的吸光度来监测蛋白质样品−1,对应于9660、13 148和21 734克半径分别为6.0 cm)和三种不同的蛋白质浓度(3.77、5.03和6.29µM(M)). 重组Csd3的蛋白质浓度Δ41使用估算∊280纳米= 39 770 M(M)−1 厘米−1分子量为42 562 Da,包括C末端六组氨酸标签。这个部分比容蛋白质和缓冲液密度的计算方法如下塞登特普(劳厄等。, 1992). 通过数学建模进行进一步的数据操作和数据分析,使用MLAB公司(诺特,1979年).
2.7. 接入代码
坐标和结构因子已按加入码存放在蛋白质数据库中第四年和4毫米分别用于形式1和形式2晶体。
3.结果和讨论
3.2. Csd3的寡聚状态Δ41溶液中
在形式1晶体中非对称单元埋藏相对较大的1130°表面积2每个单体(单体表面积的6.0%),而形式2晶体的最大埋表面积为7102每个单体(单体表面积的3.8%)。大部分晶体界面的面积低于1000Å2,很少有代表超过该值(Duarte等。, 2012). 众所周知,生物界面往往表现出大面积,大多数情况下面积为1000°2及以上(Duarte等。, 2012). 这对Csd3的寡聚状态提出了一个问题Δ41溶液中。因此,我们平衡沉降实验。所有测量数据均符合均相单体模型,表明Csd3Δ41以单体形式存在于浓度高达6.29µ的溶液中M(M).在18000转/分时测得的代表性结果−1使用3.77µ的蛋白质浓度M(M)如补充图S2所示。
4.讨论
我们已经确定了第一个晶体结构来自的Csd3幽门螺杆菌,一种影响螺旋细胞形状的蛋白质,对幽门螺杆菌在胃里。我们注意到,Csd3结构域1的折叠与莫奈林/胱抑素超家族蛋白质极为相关,其中一些作为半胱氨酸肽酶的抑制剂。C末端LytM结构域的活性位点被抑制结构域1阻断,特别是螺旋α3与锌2+-协调Glu74。AmiB直系亲属的结构巴尔通氏体发现AmiB的活性部位同样被保守的α-带有锌的螺旋2+-谷氨酸残基(Glu290)的配位作用,提示自身抑制是调节肽聚糖革兰氏阴性菌(Yang)细胞分裂所需的酰胺酶等。, 2012). 我们测量了幽门螺杆菌Csd3对抗合成的胞壁五肽(Csd3的CPase活性底物)质量分析。胞壁五肽(5 mM(M))用重组Csd3在37°C下培养150分钟Δ41(5 µM(M))在2.5 m处M(M)金属离子(锌2+或镁2+)或2.5米M(M)EDTA公司。我们使用两种不同的缓冲液溶解反应混合物:(i)20 mM(M)HEPES pH值7.9100 mM(M)氯化钠或(ii)20 mM(M)磷酸钠pH 6.0。在我们测试的所有反应条件下均未观察到反应产物。作为阳性对照,我们可以在与五肽孵育时检测到四肽产物屎肠球菌VanY。该结果与Csd3的潜在非活动状态一致Δ41在水晶中。
我们的研究表明,抑制域1,包括α3螺旋,应从LytM结构域的活性部位移开,以激活潜在的Csd3。激活幽门螺杆菌Csd3可能通过自蛋白水解发生,或者可能需要其他内肽酶进行蛋白水解裂解,以将催化LytM结构域从抑制结构域1中释放出来。当我们尝试用胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶进行有限的蛋白水解时,在特定位置没有发生离散的裂解。为了从Csd3中物理去除抑制结构域1,我们尝试过表达缺乏螺旋的各种结构体(残基80-403、81-403、83-403、124-403、125-403、127-403、130-403、227-403、230-403、233-403、125-359、127-359、227-359、230-359和233-359)α3.然而,它们都没有在大肠杆菌或者,变构调节剂引起的大的构象变化可能导致活性位点的开放。例如,当变构位点~60º远离D类,D类-转肽酶活性位点位于青霉素结合蛋白2a(PBP2a)中金黄色葡萄球菌(奥特罗等。, 2013).
为了提供底物与Csd3相互作用的详细信息,我们将形态1和形态2晶体浸泡在添加了胞壁五肽的冷冻保护剂溶液中。未观察到底物肽的电子密度。我们还试图使Csd3共结晶Δ41在与形态1和形态2晶体的结晶条件类似的条件下,存在过量的胞壁五肽,但这种尝试没有产生任何晶体。由于肌氨酰五肽的供应有限,不可能在其存在的情况下对结晶条件进行更广泛的筛选。Csd3的共结晶Δ41在存在交联二聚体的情况下,五肽和四肽(Csd3 EPase活性的底物)是不可能的,因为这种底物既不可商业化,也不容易合成。
幽门螺杆菌Csd1(HP1543)、Csd2(HP1544)和Csd3(HP0506)包含M23B金属肽酶家族的LytM结构域;它们都催化与EPases相同的反应。Csd2可能是M23B家族的非肽酶同源物,作为特征H的第一个组氨酸xxx个D和Hx个其LytM结构域中的H基序分别在残基165和残基246处突变为Glu和Lys。Csd3具有CPase活性,而Csd1可能具有或不具有这种活性。幽门螺杆菌与Csd1(312个残基)和Csd2(308个残基。Csd1和Csd2与Csd3结构域1或结构域2核心的序列比对表明,Csd1与Csd2的前区与结构域1具有较高的序列相似性。Csd1和Csd2的长度明显较短,表明其前区中只存在一个结构域。这可能会影响其CPase活性。然而,目前还没有关于Csd1和Csd2三维结构的信息,因此需要对其进行结构研究,以比较Csd1、Csd2和Csd3的结构,并了解结构术语中的功能差异。
细菌可能会改变其形态以适应生存环境(Young,2007). 在压力条件下,如抗生素的亚抑制浓度,幽门螺杆菌能够进入一种可存活但不可培养的状态,在这种状态下,微生物将其形态从螺旋状改变为球状(Cellini,2014). 活球状体在宿主和环境中更持久(Cellini,2014). 据报道,Csd3/HdpA的过度生产幽门螺杆菌菌株N6导致从杆状细菌转变为活的球状细菌(Bonis等。, 2010). 这增加了螺旋状向球状转变可能与Csd3过度表达有关的可能性。如果是这样的话,Csd3不仅可以消除螺旋形,还可以成为一个有吸引力的药物靶点幽门螺杆菌也可以抑制形态转化为持久性球状。
致谢
我们感谢光束线工作人员在浦项光源(光束线BL-5C和BL-7A)、SPring-8(光束线CL-44XU;提案编号2012B6741)和光子工厂(光束线PL-1A、BL-5A、BL-17A、NE3A和NW12A)进行X射线衍射实验期间提供的协助。SWS实验室的工作得到了韩国科学、信息通信技术和未来规划部、韩国国家研究基金会(NRF)(2013R1A2A1A05067303)和韩国卫生部代谢和炎症疾病创新药物研究中心的支持,福利和家庭事务(韩国医疗技术研发项目A092006)。BIL实验室的工作得到了基础科学研究计划(NRF-2010-0020993)的支持,该计划由韩国教育部资助。HSK得到了韩国教育部资助的NRF的支持(2012-039930)。HJY得到了韩国教育部资助的NRF的支持(2014R1A1A3A04050250)。美国的这项工作得到了美国国立卫生研究院(AI090348)的资助。
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| 生物 结晶学 |
国际标准编号:1399-0047
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