2.1. 蛋白质表达和纯化

含有野生型的pCS150表达载体的构建阿兹A基因在别处也有描述（斯科特等人。, 2009). 突变体阿兹A编码AtzA Ala170Thr、Met256Ile、Pro258Thr、Tyr261Ser变体的基因从Life Technologies（澳大利亚）获得，并在pMK-RQ中提供NdeI和BamHI位点，用于亚克隆到pCS150载体中。含有野生型或突变型的pCS150质粒阿兹A基因被用来转化电能力大肠杆菌BL21型λDE3细胞（Invitrogen），并在310 K下在Luria–Bertani（LB；Lennox，1955）上生长)琼脂[1.5%(w个/v（v）)]补充100µg ml的平板⁻¹氨苄西林。用一个菌落接种50 ml的过夜发酵剂培养物。将过夜培养物以1:20的比例稀释到950 ml LB培养基中，并在310 K和200转/分下摇晃⁻¹直到OD₆₀₀得到0.6–0.8。通过添加100µM（M）异丙基β-D类-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）。诱导培养物在310 K下保存过夜，同时以200转/分的转速摇晃⁻¹.

然后通过在4000下离心来收获细胞克在Avanti J-E离心机（美国印第安纳波利斯Beckman Coulter）中停留10分钟，再悬浮在裂解缓冲液中（50 mM（M）HEPES，pH 7.5，100 mM（M）NaCl），并通过在124MPa下通过Avestin C3均化器裂解三次。不溶性细胞碎片在21000℃下通过离心作用清除克使用Avanti J-E离心机。

AtzA和AtzA变体通过三个步骤从裂解细胞中纯化：His-tag亲和层析使用Ni–NTA超流筒（美国马里兰州齐根市），坡度为0–300 mM（M）咪唑50米M（M）HEPES pH 7.5，100 mM（M）氯化钠和尺寸排阻色谱法使用装有Superdex 200预颗粒树脂（澳大利亚GE Healthcare Life Sciences）的130 ml色谱柱，缓冲液由50 m组成M（M）HEPES pH 7.5，100 mM（M）氯化钠。通过凝血酶蛋白水解去除His标签，然后通过尺寸排除色谱法带有Superdex 200列。将蛋白质在具有Ultracel-30膜的Amicon Ultra-15离心过滤单元（Millipore，Carrigtwohill，Ireland）中浓缩至11.6 mg/ml⁻¹和snap在100µl等分液中的液氮中冷冻。考马斯染色凝胶的最终纯度估计为98%，典型产量为1 l LB培养基中5–7 mg纯化蛋白。

2.2. 结晶和结构溶液

所有结晶实验均在96 well SD-2板（IDEX，美国）中针对50µl储液罐进行。使用由150 nl浓缩蛋白溶液（～11 mg ml）组成的液滴获得初始晶体⁻¹)结合150nl储层溶液进行了播种试验。最终晶体是使用由150 nl浓缩蛋白溶液、120 nl储液罐溶液和30 nl种子储备组成的液滴获得的。使用Phoenix（ARI，美国）或Mosquito（TTP Labtech，英国）机器人放置结晶液。晶体（补充图S1）从含有5.5%的储层中不可靠地生长(w个/v（v）)聚乙二醇8000，2.7%(v（v）/v（v）)二甘醇，50 mM（M）HEPES pH 7.1，281 K，用于在澳大利亚同步加速器的MX-2光束线上收集0.9537 Au（13 000 eV）波长的X射线数据。在液氮中进行低温冷却之前，通过添加补充有20%二甘醇的储液罐溶液对晶体进行低温保护₂。数据被编入索引XDS公司（卡布施，2010年)并使用缩放无AIMLESS（埃文斯，2011年). 该结构使用分子置换(相位器; 麦考伊等人。, 2007)带有PDB条目3千帕（32%序列一致性，15个间隙；霍尔等人。, 2010). 只有当二聚体3千帕使用了六个二聚体非对称单元。这个空间组被发现是P（P）22₁2₁数据的分辨率扩展到2.8°（见表1). 该模型最初是使用海盗（Cowtan，2006年)然后用手工重建库特（埃姆斯利等人。, 2010)并使用REFMAC公司（穆尔舒多夫等人。, 2011). 发现两个完整的六聚体存在于非对称单元，每个都是二聚体的三聚体。模型细化为R（右）_工作和R（右）_自由的值分别为19.3%和22.2%（表1). Ramachandran阴谋（来自库特)最有利区域的残差为94.9%，允许区域为3.9%，异常区域为1.1%。在建立了这个原始结构之后，在类似的条件下获得了第二组晶体[50mM（M）HEPES pH值7.3，4.6%(w个/v（v）)PEG 10 000]和另一个数据集是在MX-2波束线上获得的，数据分辨率扩展到2.2º。这颗水晶被确定属于空间组 P（P）2₁2₁2₁在非对称单元。这两种结构的模型和结构系数已作为条目保存在PDB中4对1x（2.2°分辨率）和4v1年（分辨率2.8°）。

2.3. 分子建模

利用密度泛函理论，利用B3LYP泛函和6-31+G*基组（LANL2DZ赝势用于铁芯电子），计算了AtzA金属配位位的气相平衡构象高斯09（弗里希等人。, 2009).

使用罗塞塔配体带有PDB入口坐标的对接协议4对1x。使用AM1BCC哈密顿量计算配体的部分原子电荷，如QuacPac公司（v.1.6.3.1；OpenEye Scientific Software，美国新墨西哥州圣达菲）和符合者使用欧米茄（v.2.5.1.4；OpenEye Scientific Software，美国新墨西哥州圣达菲）。使用罗塞塔配体对接协议（Davis等人。, 2009). 根据总能量（根据罗塞塔能量函数）。从这个较小的集合中，考虑对前20个蛋白质-配体复合物（根据蛋白质-配子相互作用能）进行最终检查。

2.4. 动态光散射

浓缩AtzA（11.6 mg ml⁻¹)以50米的连续方式稀释了50%M（M）HEPES pH 7.5，100 mM（M）NaCl以获得11.6至0.09 mg ml的浓度范围⁻¹将20µl体积的每个样品（一式两份）放置在384孔板中，空白仅由缓冲液组成。将平板放置在DynaPro平板阅读器DLS机器中（美国加利福尼亚州圣巴巴拉市怀亚特科技公司），在297 K下获得每个样品的50个光谱，并取平均值。前三种浓度给出了回转半径5.9纳米，而最低浓度（0.09毫克毫升⁻¹)平均半径为5.2–5.3 nm。测量六聚体的直径总是大于10 nm（10.5至13.0 mm，取决于所选的点），而二聚体的最长尺寸为8.3 nm。

3.1. 六聚体AtzA的结构

使用进行分析PDB折叠揭示出PDB中与AtzA最接近的结构是用于分子替换，PDB条目3千帕（均方根深1.6°；霍尔等人。, 2010)也是氨基酸序列同源性最高的结构（411个残基中32%以上）。另一个结构基因组学目标，PDB条目3磅（库贝等人。, 2013)结构同源性次之，其次是两种腺苷脱氨酶campestris黄单胞菌（PDB条目4dz小时; 纽约结构基因组研究联合会，未发表的工作）和铜绿假单胞菌（PDB条目3人; 纽约结构基因组研究联合会，未出版作品）。TrzN结构（Seffernick等人。, 2010; PDB条目3磅)在414个残基上具有26%的序列同一性，r.m.s.d.为1.8Å，是PDB中与AtzA第五相似的结构。所有这些分子都被归类为酰胺水解酶3千帕被认为是一种8-氧鸟嘌呤脱氨酶。尽管3磅具有高度同源的活性位点（四个组氨酸残基和一个天冬氨酸残基），一个钙离子被模拟成密度而不是铁²⁺或锌²⁺; 名单上所有其他热门歌曲都有Fe²⁺或（更常见的）锌²⁺在他们的活动站点中。

AtzA六聚体（分子量约315 kDa）是二聚体的三聚体（图2一)，二聚体界面明显大于用于组成六聚体的单个原聚体界面（图2一和2b条): 3295 Ų与585欧相比²DLS和尺寸排除色谱法（SEC；补充图S2），与之前关于蛋白质溶液状态的报告一致（de Souza等人。, 1996; 斯科特等人。, 2009). 二聚体表面覆盖17–18%的单体（单个单体的表面积为～18 600Ω²; 图2c). 二聚体界面与在其他酰胺水解酶中发现的界面相似，二聚体的整体结构与搜索模型所用的结构非常相似分子置换（PDB条目3千帕)当使用二聚体代替单体时，给出了一个明显更稳健的解决方案。在非对称单元的晶体结构在里面空间组 P（P）22₁2₁而在空间组 P（P）2₁2₁2₁两种结构基本相同（r.m.s.d.为0.3º），更高分辨率的数据使氨基酸位置更加清晰，并在模型中添加了更多的水分子。从六聚体的三重轴往下看，最明显的相互作用是11-氨基酸插入（相对于PDB进入）3千帕)形成环和螺旋，包含残基160–183，这是迄今为止在其他酰胺水解酶结构中未见的。六聚体中的“空腔”在入口处的直径约为14°，尤其是一个残留物Arg163，形成了这个入口的大部分表面（图3).

图2 AtzA的结构。(一)AtzA六聚体的X射线结构是二聚体的三聚体，由单体着色。二聚体的结构(b条)（按单体着色），单体(c)（由二级结构着色）和活性部位(d日)如图所示。活性中心金属（Fe2+)显示为橙色球体。

图3 AtzA六聚体中央空腔的入口和六聚体稳定界面的氨基酸残基。AtzA六聚体中心腔的入口主要由每个单体贡献的Arg163形成。六聚体中形成的洞在入口处的直径约为14°。残基Ala170、Met256、Pro258和Tyr261处的氨基酸取代使六聚体不稳定。图中显示了三个单体在六聚体的一面（左侧）和单体-单体界面（右侧）上的相互作用。

这个阿兹A基因来自氨基沃氏氨基杆菌最近从法国葡萄园（努尔等人。2014年)积累了多种突变，这些突变被证明可以改变底物特异性并改变K（K）_d日铁的酶²⁺有趣的是，这些突变产生的四种氨基酸变化（Ala170Thr、Met256Ile、Pro258Thr和Tyr261Ser）位于负责协调AtzA六聚体的界面（图3). 在A.氨基voransNoor研究中的分离物等人。(2014). 由于这些氨基酸可能影响六聚体形成的变化，AtzA Ala170Thr、Met256Ile、Pro258Thr、Tyr261Ser变体被表达和纯化，其大小由SEC确定。与野生型蛋白质不同，野生型蛋白质从SEC洗脱，估计分子量为～300kDa，估计分子量为～100 kDa的洗脱变体(即二聚体；数据未显示）。这表明，与来自原始菌株的AtzA相比，有一些因素在较新的法国菌株中选择了二聚体AtzA假单胞菌属从美国获得的分离物，尽管尚不确定二聚体AtzA变体是否早于六聚体形式或反之亦然.

3.2. AtzA活性位点分析

每个单体的基底结合囊和催化中心都是可接近的通过一条长的疏水通道。通道、底物结合囊和活性位点由His66、His68、Gln71、Phe84、Tyr85、Trp87、Leu88、Phe89、Val92、Tyry93、Asp128、Met155、Phe157、Met160、Asp161、Ile164、Gln165、Val168、Leu180、Ser182、Iled183、Met184、Ala216、Thr217、Thr229、Ala220、His243、Glu246、Asp250、His276、Leu305、Asp327、Asn328和Ser331组成（图4). 这些残基的特性与用于成功预测突变位点的同源模型很好地一致，以大幅降低K（K）_米用于阿特拉津(即Ala216、Thr217、Thr318、Ala219和Asp250；斯科特等人。, 2009).

图4 访问AtzA的活动站点。活性中心和溶剂进入通道（形成从活性中心金属到溶剂的单一连续通道）的表面显示在已被二级结构着色的AtzA单体中。形成该表面的氨基酸（His66、His68、Gln71、Phe84、Tyr85、Trp87、Leu88、Phe89、Val92、Tyr93、Asp128、Met155、Phe157、Met160、Asp161、Ile164、Gln165、Val168、Leu180、Ser182、Ile 183、Met184、Ala216、Thr217、Thr229、Ala220、His243、Glu246、Asp250、His276、Leu305、Asp327、Asn328和Ser331）显示为棒状物，但没有贴上清晰的标签。氨基酸驻留物标记在补充图S5中。活性位金属（Fe2+)显示为橙色球体。图像围绕垂直轴彼此旋转180°。

单核活性中心金属由His66、His68、His243、His276和Asp327配位（图2d日); 它是一种亚型III氨基水解酶金属结合基序，类似于大肠杆菌腺嘌呤脱氨酶（Seibert&Raushel，2005). 结合阳离子和连接氨基酸侧链之间的键长比这种金属中心预期的长，其长度范围如下：Fe–His66，2.68–2.88º；Fe–His68，2.76–2.96奥；Fe–His243，3.01–3.14欧；Fe–His276，2.76–2.99奥；Fe–Asp327，2.41–2.49奥。虽然在活性部位发现的金属配位侧链的构象表明存在八面体络合物（如铁的预期²⁺结合），几何结构与气相电子结构计算预测的几何结构发生畸变（补充图S3）。在PDB的其他结构中观察到这些距离处的铁配位组氨酸残基，尽管它们的出现频率远低于键长较短的结构（平均His–Fe键长为2.2º，标准偏差为～0.2º；补充图S4）。虽然当铁原子被设置为100%占有率时没有发现负密度，但结果是B类这些因素是附近残留物的两倍多。因此，我们将铁原子的占有率设置为50%，这更为合理B类因素。这些结果表明，铁原子在活性中心是结合的，但没有紧密配位，这与观察到的异常高一致K（K）_d日对于铁（～5µM（M）; 努尔等人。2014年). 有趣的是，Fe²⁺结合相关酰胺水解酶(例如。胞嘧啶脱氨酶；PDB条目1拉0,1千70和88年第4季度; 伊雷顿等人。, 2001; 马汉等人。, 2004)也发现其配位不如锌紧密²⁺阳离子，尽管有铁²⁺是生理上相关的阳离子。

有许多与活性位点His66、His276、Glu298、Asp327和Asn332相关的Ramachandran异常值，它们都具有良好的电子密度（图5)并明确放置。His66、His276和Asp327结合铁²⁺直接在活性部位，并将应变引入活性部位。大多数其他Ramachandran异常值也具有良好的电子密度。唯一的例外是Glu251，它位于弱电子密度区域，可能在蛋白质中流动。该可移动区域位于基板上方，可以移动以允许基板进入或退出。另一个Ramachandran异常值Thr368很有趣，因为它位于螺旋线的中间；前面的残基Ala367也是螺旋结构的一部分，它的羰基氢与另一残基（Ile63）结合，而不是与螺旋中的其他羰基结合。

图5 AtzA活性部位的密度。使用中央对手方清算所4包，图中显示了活性部位中的“额外”密度，这可能是由于阿特拉津（图顶部，蓝色网格）。活性中心铁显示为橙色球体，水显示为红色球体，几个活性中心残留物显示为相关密度。OMIT映射设置为1σ.

对结合囊的检查表明，阿特拉津可能难以以允许活性水进行亲核取代的方向结合（如TrzN的情况）。阿特拉津被浸泡在晶体中，并与蛋白质共结晶，共结晶实验得到的晶体衍射分辨率为2.2º。然而，在共晶体的一些单体中的活性部位只发现了少量的断裂密度（图5). 活性位点的密度不足以明确放置阿特拉津。由于这个原因，阿特拉津对接的研究使用了大量的分子锁计算罗塞塔配体对接协议（Davis等人。, 2009). 这些计算结果表明，阿特拉津的非生产性结合模式很常见。

制作了一个高分姿势，将阿特拉津的适当C原子放置在金属结合水的亲核攻击位置。与我们之前提出的基于同源模型的机制相反（Scott等人。, 2009)，的N个-乙基和N个-底物的异丙基部分朝向远离金属中心的方向，与Val92、Trp87、Leu88、Tyr85和Phe84形成疏水接触（图6). Phe84提供了一种不同于无基质中发现的旋转体晶体结构。阿特拉津的Cl原子和环状N原子与铁配位²⁺它将底物放置在理想的位置，以便配合亲核试剂进行亲核攻击。

图6 阿特拉津在AtzA活性部位的模拟对接：使用罗塞塔配体带有PDB入口坐标的对接协议4对1x这使得阿特拉津在物理上与活化水的亲核取代物保持合理距离。虽然理论上可以将阿特拉津环的平面旋转180°，但结合囊的空间环境似乎禁止这种替代结合模式。这个晶体结构（灰色）和对接模拟期间生成的模型结构（青色）如图所示。活性中心金属（Fe2+)显示为蓝色球体。

为了确定是否可能存在双齿配位模式，或者是否存在通过Cl原子的单齿配位，不需要His243旋转，但需要上述疏水囊略微向外移动，这将涉及超出当前工作范围的进一步研究。无论如何，形成单齿配位模式的横向位移将小于1Å，并且能够在没有活性位点的重大重组的情况下被调节。

有两种氢键相互作用N个-乙基和N个-Asn328侧链O原子和Glu246新转子异构体侧链的异丙基取代基。这些残基中的后一种可能在形成四面体中间体期间起到稳定环N原子上负电荷的作用。亚基三嗪环的对称性可能使N个-阿特拉津的烷基侧链以与此处所示相反的方向结合；然而，容纳N个-异丙基侧链与N个-从空间位阻的角度来看，乙基侧链使这种交替结合模式不太可能发生。

AtzA的底物结合口袋似乎不适合结合阿特拉津，关键氨基残基的构象发生了应变，金属结合位点亲和力低，底物结合不成功的可能性高。这些观察结果与高K（K）_米阿特拉津的野生型AtzA，超过底物的水溶性(即>159 µM（M）; 斯科特等人。, 2009)这可能解释了为什么我们无法捕捉到AtzA–阿特拉津复合物的清晰X射线结构。

3.3. 区分AtzA和三聚氰胺脱氨酶TriA的九种氨基酸的位置

三聚氰胺脱氨酶TriA与AtzA的区别仅在于九个氨基酸残基的身份：Leu84（Phe）、Leu92（Val）、Asp125（Glu）、Ile217（Thr）、Pro219（Thr等人。, 2001). 在这九个氨基酸残基中，有六个是AtzA中底物结合囊/通路的一部分：Phe84、Val92、Thr217、Thr229、Asn328和Ser331（图7).

图7 AtzA和三聚氰胺脱氨酶TriA之间的差异。区分AtzA与TriA的Phe84、Val92、Asp125、Thr217、Thr229、Ile253、Gly255、Asn328和Ser331的位置显示在AtzA单体中（通过二级结构着色）。活性中心金属（Fe2+)显示为橙色球体，并且显示了活性位/溶剂访问通道的表面。图像围绕垂直轴彼此旋转180°。

Phe84、Asn328和Ser331在底物结合袋中的存在并不令人惊讶，因为这三种氨基酸之前已被证明分别是AtzA和TriA中阿特拉津/三聚氰胺特异性的主要决定因素（努尔等人。, 2012; 斯科特等人。, 2009; 拉亚尔等人。, 2001). 特别是，Ser331和Asn328位于活性中心金属附近，这与它们之前在催化TriA-介导的三聚氰胺脱氨和被动促进阿特拉津介导的阿特拉津脱氯（Noor等人。, 2012; 斯科特等人。, 2009).

在实验室进化实验中，改变Thr217和Thr219已被证明可以显著改善K（K）_米和k个_猫/K（K）_米阿特拉津的AtzA值（斯科特等人。, 2009). Thr217和Thr219是诱变的靶点，因为同源性模型预测了它们在底物结合囊中的存在，并且此处显示的AtzA结构证实了这一点（图7). Ile253和Gly255不位于基板绑定袋中。然而，有趣的是，Ile253和Gly255确实在Thr219附近聚集（图7)，其中Ile253在Thr219的4Å范围内。因此，位置253和255处残留物的变化可能会影响基质结合袋残留物包装(即位置217和219），这与它们在“调节”酶对三聚氰胺或阿特拉津（努尔等人。, 2012; 拉亚尔等人。, 2001). AtzA和TriA之间的剩余差异位于第125位（AtzA中的Glu和TriA中的Asp），并且已经证明对AtzA与TriA脱氯或脱氨基的特异性有很大贡献（Noor等人。, 2012). 尽管Glu125被埋入地下（图7)，它确实有助于活动站点的几何结构通过Glu125侧链与Val69主链N原子之间的氢键相互作用，紧邻与Fe结合的His68²⁺.

3.4. AtzA的催化机理

我们提出了AtzA水解阿特拉津脱氯的两种替代潜在催化机制，它们与生物信息学尽管需要经验数据来测试这些和之前提出的反应机制，但对接在这里提出。第一种是直接基于唯一的对接姿势中显示的相互作用，该姿势使阿特拉津适合亲核攻击，第二种是基于上述阿特拉津的单齿配位模式（图8）一和8b条（分别为），使Glu246能够更好地稳定另一个环N原子上的负电荷。在这两种机制中，Cl原子与Fe的配位²⁺从C-Cl键中提取电子密度，增加C原子对亲核攻击的敏感性。在第一种机制中，配位水被Asp327脱质子，随后在含氯环C原子上产生的活性氢氧化物发生亲核攻击。四面体中间体的负电荷稳定在Fe上²⁺-配位芳香族N原子，之后释放氯化物，并在羟基化产物中重新建立芳香性。

图8 AtzA的合理反应机制。提出了两种可能的反应机制，涉及双齿化合物(一)或二齿(b条)阿特拉津Cl原子与铁的配位2+AtzA活动场地的中心。

单齿阿特拉津与铁配位的第二种机理²⁺涉及到Glu246对配位水的脱质子作用，然后Glu244旋转，在底物结合时向阿特拉津的N环原子提供氢键。然后，该N原子获得四面体中间体的负电荷，由质子化的Glu246的氢键稳定，然后按照第一种机制生成产物。

Fe的“松散”配位几何结构可能²⁺已进化为促进阿特拉津的双齿配位，这在四种理想的配位残基和一种配位水的情况下是不可能的。尤其是His243，距离Fe超过3度²⁺，为双齿配位提供了足够的空间，尽管采用了更高的能量构象。然而，我们注意到，这种绑定模式是前所未有的，而且没有晶体结构关于AtzA–阿特拉津复合物，没有实证证据支持。

虽然我们提出的阿特拉津脱氯机理晶体结构和对接，不同于我们之前基于同源模型和底物人工放置的报道，新提出的机制与其他地方报道的经验确定的生化和突变数据保持一致（de Souza等人。, 1996; 拉亚尔等人。, 2001; 斯科特等人。, 2009; 努尔等人。, 2012). 先前报道的序列突变（Scott等人。, 2009)降低阿特拉津脱氯活性并提高脱氨酶活性的方法可能是通过改变氢键网络调节金属结合水的位置，改变其pK（K）_一底物结合和产物释放中的空间位阻因子发生变化。

3.5. 两种金属依赖性阿特拉津氯水解酶AtzA和TrzN的比较

这个第三系结构AtzA与TrzN（Seffernick等人。, 2010). AtzA和TrzN的单体在C上重叠，根-平方差为1.8º^α414个残基上的原子（图9一). 金属结合组氨酸侧链和金属覆盖层（图9b条)，主要差异是金属-组氨酸距离较长（AtzA中的His66、His68和His243为2.7–3.1Å，而TrzN中为2.0–2.1Å；图9b条)，铁²⁺代替锌²⁺作为金属，His276与Fe的额外相互作用²⁺以及额外的Fe–Asp327相互作用（2.4–2.5℃）。在TrzN结构中，相当于His276（His274）的组氨酸与与锌离子配位的水形成2.7μl氢键。在酰胺水解酶家族中独一无二的是，TrzN结构在325位有苏氨酸残基，使其成为第九个家族的第一个成员子组酰胺水解酶家族的金属配位位点（Seibert&Raushel，2005; 杰克逊等人。2014年; 授库拉纳等人。, 2009).

图9 AtzA与替代阿特拉津氯水解酶TrzN的比较。(一)AtzA单体（绿色）和TrzN单体（青色）的叠加。(b条)AtzA（绿色）和TrzN单体（青色）活性中心的重叠。活性中心金属（Fe2+和锌2+; 分别以橙色和灰色显示），AtzA金属结合配体以绿色标记。TrzN独特的苏氨酸（Thr325），相当于AtzA中的Asp327，也标记为青色。

与AtzA的活性位点不同，TrzN活性位点与其底物具有很好的互补性，这几乎可以肯定地解释K（K）_米阿特拉津的TrzN（～20µM（M）; 沙皮尔等人。, 2002)与AtzA相比，对于相同基底（>159µM（M）). TrzN的机制不同于任何针对AtzA提出的机制，其中锌活化的水形成四面体中间体，并且高度活化的离去基团（如卤化物）容易离去。离开p较高的组K（K）_一值（如胺）在质子化时可被TrzN水解；Glu241首先向三嗪环提供一个质子，然后三嗪环将离开组。因此，TrzN是一种具有广泛底物范围的高效水解酶，而AtzA是一种活性较低的酶，可根据328和331位氨基酸残基的特性进行脱氨或脱卤反应。AtzA变体是AtzA和TriA之间的有效中间产物，同时具有这两种活性，但其特异性低于AtzA或TriA（Noor等人。, 2012).