1.简介
烯醇化酶(酶代码EC4.2.1.11)普遍存在于生命的三个领域,是一种催化2-磷酸脱水的基本酶-D类-甘油在糖酵解中生成磷酸烯醇丙酮酸,在糖异生中发生逆向反应。除了在新陈代谢中起主要作用外,烯醇化酶还进化出一系列令人印象深刻的“兼职”功能。例如,原核烯醇化酶已被证明可以共同组装成RNA降解体(Nurmohamed等。, 2010; Chandran和Luisi,2006年)而真核生物烯醇酶是线粒体的组成部分tRNA运输(Brandina等。, 2006). 一些哺乳动物的烯醇化酶作为表面受体,结合人纤溶酶原和细胞外基质,促进正常细胞迁移(伯格曼等。, 2005; Ghosh&Jacobs-Lorena,2011年). 有趣的是,许多病原体烯醇化酶似乎也进化出纤溶酶原结合特性,使它们能够协同纤溶酶途径,促进宿主组织的降解和病原体的入侵(Bergmann等。, 2005; 高希等。, 2011).
一些研究报告称,烯醇化酶定位于细胞核,与DNA结合并充当转录调节器。例如,拟南芥ENO2/LOS2结合转录因子STZ/ZAT10的启动子并抑制植物冷反应的基因转录(Lee等。, 2002). 全长人类ENO1(hENO1)和替代剪接变异体(hMPB1)与顺式-启动和抑制关键细胞周期调控因子的表达,如c-Myc癌基因和环氧合酶2(COX-2)(Sedoris等。, 2010; 徐等。, 2009). 虽然这些生物体中的DNA结合潜力未知,但烯醇化酶定位于两种原生动物寄生虫的细胞核:疟原虫(帕尔·博米克等。, 2007, 2009)和溶组织内阿米巴(Tovy公司等。, 2010).
大脑寄生虫弓形虫为研究烯醇化酶的多功能作用提供了重要的生物体。这种机会性复合顶端寄生虫感染了大约三分之一的全球人口,在人类宿主中在两个发育阶段之间切换:在初次感染期间,病原体在循环和受感染组织中增殖为速殖子,然而,当免疫系统清除了速殖子后,它仅在大脑和肌肉中保持代谢静止,成为含有缓殖子的组织囊肿。在…之间弓形虫在许多病理学中,慢性脑感染被认为是神经疾病发展的相关因素,如精神分裂症和自杀风险(Flegr,2013; Kannan&Pletnikov,2012年).
遗憾的是,目前还没有药物和疫苗来消除慢性感染者大脑中的寄生虫囊肿。相对较差的结构数据库进一步阻碍了药物发现弓形虫>6000个弓形虫根据弓形虫基因组,仅测定了约50种不同蛋白质的结构。其中,~30是可能用作潜在药物靶点的酶。迄今为止,只有一种蛋白质(假醛缩酶)的结构在关键缓性循环期被明确上调(Tonkin等。, 2014).
弓形虫具有两种烯醇化酶亚型,以阶段特异的方式差异表达。烯醇化酶2(TgENO2)已被证明在速殖子中特异表达,而烯醇化酶1(TgEN O1)仅在缓殖子(Dzierszinski)中表达等。, 1999). 生物化学研究证实,这两种亚型均表现出烯醇化酶活性,但缓性子特异性TgENO1的酶活性仅为TgENO2的三分之一(Dzierszinski等。, 2001). TgENO1和TgENO2都定位于寄生虫细胞核,并受不同的热应激启动子元件调节(Ferguson等。, 2002; 穆沃(Mouveaux)等。, 2014).体内TgENO1和TgENO2都与启动子结合并调节基因表达(Mouveaux等。, 2014). 核TgENO2在主动复制的速殖子中升高,并已被证明与核染色质结合并占据至少242个基因的启动子区。速殖子TgENO2已被证明能特异性结合TTTTCT基序并激活启动子在体外(穆沃等。, 2014). 最重要的是,靶向阻断缓激肽TgENO1可以减少慢性感染小鼠(小鼠)大脑中的囊肿负担等。, 2014).
弓形虫烯醇化酶在寄生虫阶段发育中发挥重要的核功能(Coppin等。, 2003; Kibe公司等。, 2005)尽管缓性子TgENO1与基因启动子中TTTTCT基序的特异性相互作用需要进一步验证。在本研究中,我们提供了结构和生化数据,以深入了解烯醇化酶的多功能作用,特别是缓性子TgENO1。
2.方法
2.1. 质粒和蛋白质生产
的序列和RNA表达谱弓形虫从ToxoDB中提取烯醇酶(https://toxodb.org). 优化TgENO1和TgENO2的序列,以便在大肠杆菌,合成并亚克隆到pCCK-N′-HisTEV载体(美国加利福尼亚州MCLAB)。表达载体转化为BL21(DE3)Magic后,制备过夜培养物大肠杆菌细胞。接种过夜培养物后,细胞在37°C下生长4小时,并通过添加0.5 mM(M)25°C时的IPTG。收集的细胞悬浮在20 m内M(M)Tris–HCl,500米M(M)氯化钠,10米M(M)pH 8.3的咪唑缓冲液,在水浴-冰浴(0–4°C)中超声10分钟,并在7000转/分下离心10分钟−1利用固定化金属亲和力从可溶性细胞提取物中纯化重组蛋白色谱法该系统具有Ni–NTA琼脂糖柱和Sephadex G-25柱上的凝胶过滤。纯TgENO1和TgENO2在10 m的缓冲液中洗脱M(M)Tris–HCl pH值8.3500 mM(M)氯化钠,5米M(M) β-巯基乙醇。将蛋白质浓缩在同一缓冲液中,用于晶体筛选和在体外研究。
2.2. 结晶和X射线数据采集
使用1:1比例的TgENO1(7.0 mg/ml−1)和储层溶液。用于结构研究的晶体是在由0.1M(M)蒙脱土(1:2:2分力-苹果酸:MES:Tris碱)缓冲液pH 6.0和25%PEG 1500。在液氮中冷却之前,将晶体转移至贮存条件进行低温保护。衍射数据是在美国伊利诺伊州阿贡市高级光子源的生命科学协作访问团队光束线上100 K处收集的。沉积结构的衍射图像可在CSGID网站上获得(https://www.csgid.org/csgid/pages/home).
致谢
该项目得到了美国国立卫生研究院(NIAID Research Contracts HHSN2722007000058C和HHSN27201200026C以及NIDA Grant 3RO1DAO13141-08S1)和法国国家研究局(Laboratoire d'Excellence(LabEx)ParaFrap:ANR-11-LABX-0024,CNRS,INSERM和里尔巴斯德研究所)的支持。阿贡国家实验室先进光子源LS-CAT 21区的数据收集得到了密歇根经济发展公司和密歇根技术三走廊的085P1000817拨款以及美国能源部的DE-AC02-06CH11357合同的支持。我们还感谢大脑和行为研究基金会的资助。
工具书类
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