2.4.1. 潮湿的水流

先前描述的用于保持大分子晶体样品湿度的设备主要用于室温数据采集，并侧重于小面积的精细控制和稳定湿度（基费绍尔等。2000年; 舍格伦等。2002年; 桑切斯·威瑟比等。, 2009; 爸爸等。, 2013). 在这里，我们希望将覆盖一个或两个盖玻片和一个小瓶的较大区域加湿，因此流速必须更高。此外，由于我们使用湿流进行晶体安装，而不是数据收集，因此长期稳定性不太重要。湿度控制装置由非现成组件构成（图1). 储水器、湿度探头室和输出端口均主要由附表40 PVC管和配件制成（美国加利福尼亚州博蒙特的杜拉塑料制品公司；美国华盛顿州奥本的斯皮尔斯制造公司；美国俄亥俄州利马的美国塑料公司）。蓄水池，4–8’长管道（公称直径2或3’’），带盖（底部）和三通或四通（顶部）；湿度探头室，异径三通（1×1×½〃）；输出端口，异径三通（1½×1½x 1〃）。用四通管将储水罐盖上，可以提供一个额外的端口，用于补充水。减速器衬套将腔室和输出端口连接至油管[任一级通过滑动/螺纹（½〃）或两级，更模块化，通过外卡瓦/卡瓦（1〃）–卡瓦（2〃）/螺纹（½〃）]。为了连接到储液器中的空气通道，使用两块粘合在一起的Dura Plastics制成了一个专用连接器：卡瓦（2′′）/卡瓦（1′′）和卡瓦（¾′′）/螺纹（½′′），在最顶部安装一个卡瓦（1′′）/螺纹（½′）摩擦件，以接受管道连接器。该系统主要由聚乙烯管（内径¼〃，外径3/8〃，压力极限55 psi）、带压缩配件的黄铜针阀、黄铜软管倒钩和快速连接配件（美国马萨诸塞州北安多佛市瓦茨）组成。为了灵活性，在湿度探针室和输出端口之间使用了硅胶管。使用内联浮球流量计（美国伊利诺伊州巴林顿市吉尔蒙特仪器公司）监测流速，使用湿度/温度探针监测湿度（HH314；美国康涅狄格州斯坦福德市欧米茄工程公司）用一段15毫升离心管连接到湿度探针室。加湿效果和可持续性取决于水库的细节和水库底部的空气输送。本文介绍的工作使用了一根4’长2’’直径的管道作为蓄水池，使用了一根4’长½’’直径的管道作为空气通道，在间歇使用时产生了约95%的最大湿度。在要求的流速下连续使用（10 l min⁻¹)由于加湿效果降低，1h内最大湿度降至<90%。我们目前的配置是一根6’长、直径3’’的储水罐管、一根55’’的水柱和一根柔性软管，末端位于储水罐底部的水族箱气石（¾×¾×2’’）中，用于气路，最大相对湿度为～99%，2h以上降至95%。

图1 湿度控制系统。调压室内空气分为干燥和潮湿路径（A）。后者流经黑管（B），从储水罐（C）底部流出。（为了清晰起见，已将黑管从加湿室中取出。）空气向上流经水，变湿，然后与干流（D）重新结合。在线测量流速（E）和湿度（F），潮湿空气从1.9〃直径的管（G）中排出。参见§2了解详细信息。

对于湿流下的晶体操作，最初只需将晶体盖玻片放在湿度控制器输出处的显微镜台上，并用粘土将小瓶放在湿度路径中。随后，设计了一个适配器，带有一个水晶盖卡瓦平台和一个连接到湿度控制器输出端口的连接器。设计创建于草图大师并首次使用标准白色聚酰胺塑料进行在线三维打印(https://www.sculpteo.com). 聚酰胺塑料的粒度使得除非使用凸起的盖玻片，否则很难观察到晶体(例如EasyXtal平板，Qiagen），所以我们后来改用透明树脂(https://www.i.material.com). 适配器就位后，湿度为10 l min⁻¹足以在水晶盖玻片上形成一个潮湿的封套。适配器还包括一个小瓶安装端口，该端口具有一个空腔，用于容纳一个小型稀土磁体，该磁体有助于将小瓶定位在端口中（1/4〃直径×1/8〃厚度；K&J Magnetics；https://www.kjmagnetics.com). 除了“小瓶安装微调”晶体（补充表S1¹)，适配器用于描述的每个小瓶安装晶体。有关获取适配器的信息，请联系作者。

2.4.2. 小瓶安装

对于小瓶安装，标准低温小瓶（美国纽约州伊萨卡市汉普顿研究所；MiTeGen）是通过用少量粘土或粘合剂堵住液氮逸出孔来制备的，以防止潮湿空气从小瓶中扩散出来，并在小瓶开口边缘涂上少量润滑脂。水晶瓶盖的制作方法是在瓶盖上放置一个O形圈，使其位于瓶盖和小瓶边缘之间。用移液管将冷冻溶液（500µl）移到小瓶中，并将湿流量设置为根据拉乌尔定律（惠勒）预测的冷冻溶液湿度值等。, 2012). 然后按照图2所示进行小瓶安装程序.

图2 小瓶安装的工作流程详细信息。(一)湿度控制器，适配器位于安装显微镜上。小瓶配有水晶盖和O型环，包括500µl冷冻溶液。(b条)小瓶和晶体生长盖玻片在潮湿的气流下放置在适配器中。将晶体从生长液滴转移到冷冻溶液中，并浸泡约2分钟(c（c）)晶体形成环状并转移到小瓶中。(d日)魔杖从小瓶中取出。(e（电子）)在冷却之前，用木镊子将小瓶从适配器上取下，放在衍射仪附近。在平衡期（2分钟到过夜）后，将晶体直接安装在低温流上。(（f）)角度计的位置应确保晶体水平安装，并用手（如图所示）或木制镊子将小瓶移向角度计。(克)安装从水晶盖开始，小瓶旋转到位。虽然只显示了一只手（为了清楚起见），但为了保持稳定性，通常是用两只手进行的。(小时)沿着轴向移除小瓶。另一只手的一根手指可以放在水晶盖上，确保环固定到位。我们试图限制小瓶在冷流中的总时间(e（电子）和（f）)小于2秒。安装程序的确切细节取决于测角头上磁铁的强度。

为了保持小瓶内均匀恒定的湿度，晶体盖和小瓶之间的密封非常重要。理想情况下，晶体位置的湿度应与小瓶中液体表面的湿度相同。对于在25%RH（294K）下含有500µl水的开瓶，我们测量了蒸发率（重量）为3 mg h⁻¹或3µl h⁻¹假设一维扩散（沿着小瓶圆柱形对称轴）稳定状态水面之间的线性水浓度（100%RH或23.0 g m⁻³;https://www.tis-gdv.de/tis_e/misc/klima.htm)和瓶口（25%相对湿度或5.7 g m⁻³)也产生3µl h的速率⁻¹298 K和1 atm。众所周知，湿度的微小变化会导致单元间参数的可测量变化。例如，氧化酶晶体显示出对c（c）每1%相对湿度的电池边缘高达2.5º（Kiefersauer等。2000年). 使用我们的冷冻针和小瓶中500µl的液体，晶体距离液体表面9 mm，或距离小瓶口约三分之一的距离。假设表面蒸气压等于纯水的蒸气压，目标湿度下降<1%，我们需要水蒸汽梯度，因此蒸发率至少减少75%或25倍。仅使用针，蒸发率仅比打开的小瓶减少四倍。因此，我们研究了密封盖-小瓶连接处的方法。使用了两种方法。最初，在插入瓶盖后，将结晶粘土（Hampton Research）包裹在小瓶的薄片周围，覆盖瓶盖-小瓶接缝，从而将蒸发率降低了约700倍，从而密封了连接处。然而，这种粘土密封方法需要手指、小瓶和瓶盖之间的大量接触，这似乎会破坏小瓶-瓶盖系统的热平衡，从而破坏晶体和内部空气的蒸汽平衡，增加单位-细胞的变化。因此，寻求一种需要较少处理的方法。在采用3/8〃内径×1/16〃厚的O型环之前，我们对许多不同材料和尺寸的垫圈、垫圈和O型环进行了测试，包括是否使用真空润滑脂(https://amazon.com网站; 丁腈橡胶，50A硬度计硬度），将其放置在盖上。使用少量真空润滑脂密封O形圈和小瓶之间的接口。带润滑脂的O型环将水的蒸发速度降低了约170倍，确保溶液和晶体之间的湿度降为约0.2%RH。正在改进小瓶和盖子之间的密封机制。此外，我们使用磁性底座（汉普顿研究所）制作了一个木制手控冷冻棒，并通过打磨凹槽来改进一些竹制烤面包钳（美国新泽西州莱克伍德哈罗德进口公司），以接受冷冻瓶。使用O型环密封机构和木制工具，可以完成整个小瓶安装过程，而无需实验者的手指与瓶盖或小瓶直接接触。

2.5.1. 空气路径依赖性

将晶体在各自的冷冻溶液中浸泡2–3分钟。使用五种不同的安装显微镜-冷却介质布置来实现不同的空气通道长度：0 m（使用直接油冷却技术的柱塞冷却）、0.25 m（显微镜到液氮杜瓦）、1.2和3 m（显微镜至冷冻流）和5 m（3 m显微镜位置，步行至衍射仪时需要额外的距离）。晶体特征和环境湿度如下。索马丁：双锥酰胺，基部140–200µm，相对湿度=24–31%。溶菌酶：具有100–350µm边缘的块，相对湿度=26–30%。嗜热菌蛋白酶：直径100–200µm的棒材，相对湿度=23–29%。对于所有晶体，环境温度为294–297 K。

2.5.2. 环境湿度相关性

Thaumatin晶体浸泡在冷冻溶液中[35%(w个/v（v）)乙二醇，0.8M（M）酒石酸钾钠]持续2分钟。0.1毫米的线圈是汉普顿研究公司的“0.1–0.2毫米”线圈，测量的内侧短轴为110–118µm。0.05 mm环为“0.05–0.1 mm”环，内短轴为70–75µm。环境温度为294–297 K。使用小型房间加湿器来获取最高湿度数据点。晶体的尺寸为130–190µm，每个数据点的平均晶体尺寸为162–173µm。

2.5.3. 晶体尺寸依赖性

Thaumatin晶体在冷冻溶液中浸泡约2分钟。将小瓶上的晶体密封在O型环上，并在室温（294 K）下平衡过夜（约15小时）。使用两个循环大小范围大致维持额外溶液的相对体积。对于大于120µm的晶体，使用“0.1–0.2 mm”环（125–155µm小轴内径）。对于120µm和更小的晶体，使用了“0.05–0.1 mm”的环（小轴内径70–80µm）。每个系列的环境湿度如下：小瓶安装，相对湿度22–24%；1.2 m显微镜距离，20–23%RH；3.0 m显微镜距离，18-20%相对湿度；柱塞冷却，24-27%相对湿度。

2.5.4. 低温蒸汽流速

Thaumatin晶体浸泡在冷冻溶液中[35%(w个/v（v）)乙二醇，0.8M（M）酒石酸钾钠]持续约2分钟，小瓶安装，粘土密封，并在室温（294 K）下平衡过夜（约15小时）。通过改变氮气流速来控制低温流速度，样品和屏蔽设置为相同的值。设定温度为120 K，因为较低流速无法实现更典型的100 K。晶体尺寸为140–210µm。

2.5.5. 低温溶解浸泡时间

Thaumatin晶体浸泡在冷冻溶液中[35%(w个/v（v）)乙二醇，0.8M（M）酒石酸钾钠]放置30 s至5 min，并如上所述在液氮中插入冷却。晶体尺寸为150–190µm。

2.5.6.F类_o个−F类_o个地图

Thaumatin晶体浸泡在冷冻溶液中[35%(w个/v（v）)乙二醇，0.8M（M）酒石酸钾钠]含0.3和不含0.3M（M）KCl或NaCl放置8分钟，装在小瓶中并平衡2分钟。然后直接将晶体从小瓶中装入冷冻流中，或在显微镜下从小瓶取出（显微镜距离3米），然后直接装入冷冻流。X射线数据是用CrysAlis公司^赞成（安捷伦、雅顿、英格兰）和SCALA公司（埃文斯，2006年). 地图是用中央对手方清算所4个套餐（优胜者等。, 2011)并对结构进行了改进（使用PDB条目1小时作为启动模式；让开等。, 1994)使用REFMAC公司（穆尔舒多夫等。, 2011)和库特（埃姆斯利等。, 2010).F类_o个−F类_o个地图创建为F类_o个（低温+KCl或低温+NaCl）−F类_o个（仅低温）中央对手方清算所4包装。将来自两个晶体的数据，以及根据纯低温晶体（小瓶安装或小瓶/直接安装）的精确坐标计算的相位合并到计算机辅助设计和缩放比例电子秤，并使用快速傅里叶变换.

2.5.7. 室内温度控制

从生长液滴中直接环装索玛丁晶体，插入微RT管（加里宁等。, 2005; MiTeGen）中含有井溶液的储层，并在收集衍射数据之前在室温下培养几分钟。

3.1.1. 换乘距离

图3显示了低温单元电池体积对标准直接安装中涉及的一些参数的依赖性。索姆丁、溶菌酶和嗜热菌蛋白酶的晶体都显示出较小的单位细胞体积和较长的转移距离，这与脱水模型相一致，在该模型中，晶体在转移到冷冻剂中时会略微干燥（图3一). 晶胞体积相关性约为-0.25%m⁻¹或-0.25%⁻¹，对于索默丁来说，这大约对应于−10^三 Å^三 秒⁻¹（图3一). 假设水分子体积为30º^三, 10^三 Å^三对应于约33个水分子/单位单元格。对于图3所示尺寸的晶体(一)（140–200µm）这对应于通量晶体表面的水分子数量在每奥约30–40个水分子范围内²每秒。从低温保护溶液的宏观平面上测得的扩散速率大约低三倍，即每奥约10个分子²每秒，而一个简单的扩散模型预测，一滴与这些晶体体积相似的静止球形冷冻溶液中的水蒸发量为通量10倍以上，或～10²–10^三水分子/Ų每秒。我们期待通量从环形安装晶体到低于通量从纯溶液滴中，因为（i）暴露的晶体可能只会从溶剂通道中失水，溶剂通道只占表面的一部分，以及（ii）晶体安装过程中出现的任何额外溶液将起到缓冲作用。因此，相对于纯溶液的液滴，晶体的速率降低十倍是合理的。

图3 单位-细胞体积依赖于低温贴装方面。(一)对于三种不同的蛋白质晶体，依赖于安装显微镜和制冷剂之间的空气通道长度。每个数据集均归一化为直接注入油技术（0 m）的单位体积。每个标绘点是4-9个晶体的平均值，误差线为测量体积的标准误差。转移时间仅为近似值：更准确的转移时间见补充表S1。(b条)取决于环境湿度值和索姆丁晶体回路中的晶体取向。从1.2 m显微镜位置直接安装晶体。每个数据点是4-5个晶体的平均值，误差条显示标准误差`平行和垂直是指晶体长轴相对于环长轴的方向。

3.1.2. 环境湿度、回路尺寸和回路中晶体的方向

对于索默丁，我们还研究了对环境湿度的依赖性，如图3所示(b条). 直接安装的单元体积随着环境湿度的降低而减小，这也符合脱水模型。这个相对湿度thaumatin EG基冷冻液的含量约为80%。由于蒸发速率与溶液和环境之间的湿度差成正比，因此湿度较低会导致在同一时间段内蒸发更多的水。在九个月的时间里相对湿度从图3判断，我们实验室的变化范围为9%到50%(b条)可以产生1%范围的thaumatin单位细胞体积。

使用了三种不同的环尺寸/晶体取向。对于平行晶体取向，较小的环在所有湿度下产生较小的单位-细胞体积，体积差异为1000–5000º^三。较小的环通常在循环时带来较少的额外溶液，增加晶体对脱水的敏感性。0.1 mm/垂直方向具有中间单位-细胞体积。虽然此方向的晶体似乎有中等量的额外溶液，但在冷却过程中，它们在冷冻流中的位置也会有所不同。脱水和相对于低温流的取向这两个方面都有助于形成垂直取向的晶体中间体积。

3.1.3. 晶体尺寸

图4显示了单位细胞体积对索姆丁晶体尺寸的依赖性。对于标准的直接安装，较小的晶体产生较小的单元体积。这一一般行为适用于两种测试的低温保护剂EG（图4)和TMAO（补充表S1），可以用脱水模型来解释，因为水的体积离开晶胞应直接取决于晶体的表面积：体积比，对于较小的晶体来说，表面积比更大。位于1.2 m处的显微镜的尺寸依赖性最为明显，紧邻衍射仪。对于较大的显微镜距离（3 m；坐在衍射仪室的桌子上），尺寸依赖性仍然很明显，但单位-细胞体积的分散性更大。对于骤降冷却，在这个晶体尺寸范围内，尺寸依赖性要小得多，这在基于脱水的模型中是预期的，因为暴露时间比直接安装短五到十倍。

图4 四种不同低温安装安排的低温索姆丁单元-细胞体积对晶体尺寸的依赖性。所有晶体在冷冻溶液（EG）中浸泡约2分钟。小瓶：晶体在小瓶中平衡过夜，然后从小瓶装入冷冻流中。插入：晶体在液氮中插入冷却。直接：晶体从两个不同的显微镜-冷冻流距离直接安装到冷冻流中。

3.1.4的规定。低温蒸汽速度和低温溶液浸泡时间

尽管图4中的索姆丁晶体的尺寸依赖性可以用脱水模型定性地理解，应该考虑其他因素，包括冷却速度。对于气流冷却，冷却时间与L（左）^3/2，其中L（左）是一个特征长度水晶（克里姆斯基等。, 2003). 因此，在晶体尺寸的三个范围内，最小的晶体的冷却速度应该是最大晶体的五倍。然而，尚不清楚较高的冷却速度是否会产生较大或较小的单位体积。由于冷却速度很慢，冰可能会形成并增加单位晶胞体积，但没有证据表明最大晶体中的结冰衍射模式。在完全玻璃化的情况下，较高的冷却速度可以限制与热收缩相关的松弛，增加单位细胞体积，这与我们观察到的情况相反。

冷却速度也与u个^−1/2，其中u个是气流之间的相对速度（Kriminski等。, 2003). 因此，我们改变了u个通过将氮气流的流速改变三倍，并使用装有小瓶的晶体作为冷却速率影响的单独测试（图5一). 然而，如果图4中的尺寸相关性是图5中预期为负斜率的冷却速率效应(一)但事实并非如此。

图5 (一)thaumatin单位细胞体积对冷冻流流速的依赖性。样品和屏蔽流均设置为水平轴上的值。每个数据点（黑色）平均为4–10个晶体（灰色圆圈）；误差条显示±标准误差。(b条)索马金单位细胞体积对冷冻溶液浸泡时间的依赖性。每个数据点（黑色）平均为4-5个晶体（灰色）；误差条显示±标准误差。该图显示，无论是冷冻流流速还是冷冻溶液浸泡时间，晶胞体积都不存在系统依赖性。

还应考虑低温保护剂在晶体中的扩散速度。虽然我们的标准冷冻溶液浸泡时间（2分钟）相对较短，但我们测试了不同的浸泡时间（30秒和5分钟），发现对单位细胞体积没有影响（图5b条). 因此，250µm晶体的单位细胞体积比80µm的大约0.6%，这似乎不是因为冷冻溶液不完全扩散到较大的晶体中。

因此，对于索姆丁晶体，冷却速度和冷冻溶液浸泡时间似乎都不会影响单位细胞体积，至少在测试范围内，以及图4中的晶体尺寸相关性很可能是脱水作用。重要的是要记住，冷却速度和浸泡时间可能与其他晶体有关。

3.2.1. 柱塞冷却的变化：直接到油输送

限制脱水的一种方法是使用动力屏障，我们实施了这一方法通过一种直接对油安装方法，将一滴油与含有晶体的水溶液接触。使用一个环，晶体被直接从冷冻溶液中推入油中，从未与周围空气直接接触。然后将晶体环起来（不去除晶体周围残留的任何水溶液），并投入液氮中，在短暂的～0.5 s的时间内，油降低了从晶体到氮气杜瓦瓶的失水率（Juers&Matthews，2004). 这种方法具有很高的重复性(σ_体积= 248 Å^三使用基于EG的冷冻溶液，针对七个160–190µm的索姆丁晶体的样品尺寸；补充表S1）和我们测量的一些较大的单位细胞体积（501 665^三)，这与安装过程中损失很少的水的概念一致。（这可以与标准柱塞冷却的类似样品进行比较：σ_体积= 363 Å^三对于140–190µm的七个索姆丁晶体的样品尺寸；补充表S1.）

3.2.2. 深冷变化：高湿度下的深冷

另一种方法是调整环境空气的湿度。我们通过用冷冻溶液平衡晶体来测试这种方法（3.5分钟内5分钟M（M）TMAO），然后在将其放入液氮之前将其移入一个冷藏室。我们的冷藏室没有湿度控制，但通常湿度较高相对湿度(90–95%). 冷藏室安装也可实现高重复性(σ_体积= 295 Å^三对于八个150–170µm的thaumatin晶体的样品尺寸；补充表S1）。安装在冷藏室的另一个好处是降低了水的蒸汽压，从而降低了水从晶体中蒸发的动力学。

3.2.3. 湿流小瓶安装

为了提高直接安装的再现性，开发了湿流小瓶安装，它有三个基本组成部分：在可调湿流下进行晶体操作，将晶体转移到含有晶体浸泡溶液的小瓶，以及将晶体从小瓶直接转移到低温流。在微调该技术的某些方面时，我们安装了九组5-9个索玛丁晶体，每组的实验条件略有不同（补充表S1）。这些集合的单位细胞变异范围从σ_体积=114至757奥^三，平均（〈σ_体积〉）第页，共324页^三或单位体积的0.06%（约为直接安装变化的两倍）。

一旦开发完成，小瓶安装程序便用于图4所示的较大尺寸范围的索姆丁晶体（80–230µm）和表1。与直接安装或插入冷却晶体相比，小瓶安装晶体的单位间距变化较小，并且显示出测试晶体的最低镶嵌性。

相比之下，在直接安装中单位-细胞体积变化最大的系统（补充表S1）的嗜热菌蛋白酶晶体也安装在小瓶上。随着浸泡时间的延长（1小时），两组晶体产生了单位-细胞变化σ_体积=680和890º^三（0.07%和0.09%），比直接安装的变化小2-3倍（补充表S1）。

4.3.1. 标准低温贴装通用指南

可以考虑一些简单的指南来提高标准低温贴装的可重复性，其总体目标是确保离开晶胞每个样品都是一致的。传输时间、晶体尺寸和回路中晶体的方向应一致。相对于晶体的线圈尺寸应留有一些外部溶液，并应避免大量的芯吸、吸墨剂和其他程序。[如果不考虑重复性，则通过增加信号到噪声和降低所需的冷冻保护剂浓度（Kitago等。, 2005)]. 应注意限制晶体通过干燥冷冻流的路径长度(即垂直于冷冻流的速度移动晶体）。理想情况下，安装所在房间的物理环境应控制在恒定湿度下。上述考虑应有助于任何特定的研究人员使用标准低温贴装技术实现特定晶体单元-细胞参数的更高重复性。

然而，冷冻安装过程的许多方面很难控制，并且会影响脱水量。因此，可以预期不同尺寸的晶体，具有不同的冷冻溶液（具有不同的湿度），由不同的人（具有不同循环力学）在不同的日子（具有不同环境湿度），以不同的循环，在不同的方向安装将倾向于具有不同的单元间参数，并且差异可能太大，无法成功合并数据。如果两个实验室的相对湿度不同，那么在一个实验室有效的技术可能在另一个实验室无效。限制或控制脱水的方法将有助于开发一种稳健的晶体安装程序，该程序对上述实验条件的变化不敏感，并实现单元-细胞参数的更高再现性。

4.3.2. 限制脱水的改良低温贴装技术

柱塞冷却增强功能。限制水分损失的最简单方法是减少向制冷剂的转移时间，如柱塞冷却，这减少了单位体积对晶体尺寸的依赖性（图4). 然而，插入式冷却晶体仍需短时间（～0.25 m和～0.5 s）暴露于环境空气中，并表现出可测量的单位间变化（表1). 这里探讨的柱塞冷却的增强功能是直接油传输和高湿度下的柱塞冷却。这两种方法显示了索姆丁晶体中单位-细胞参数的高度可重复性，并且应比标准深冷（§3.2.1).

湿流小瓶安装。上述两种方法都需要浸入液态制冷剂中，并且涉及晶体可能不兼容的介质（油）或温度（4°C）。因此，我们寻求一种更通用的方法来限制低温安装过程中的水分损失，该方法在室温下适用，无需使用油。湿流小瓶安装允许在原则上以任意距离和时间将晶体输送至冷冻流，同时保持晶体与其生长或浸泡溶液的平衡，从而限制冷冻转移过程中的水分损失，并减少基于脱水的变化。

小瓶安装方法将thaumatin单位-细胞体积对晶体尺寸的强正依赖性转变为弱负依赖性，并可以减少单位-细胞变化（图4). 对于大尺寸范围的晶体，小瓶安装的thaumatin晶体显示出比插入冷却或直接安装的晶体更大的晶胞参数再现性（表1). 尽管同构涉及的不仅仅是单位-细胞参数（晶胞同样重要的是），值得注意的是，作为一个组，小瓶安装的晶体与佐丹奴成功合并数据的任何一个组相比，单位-细胞参数标准偏差更低等。(2012)SAD阶段化（表1).

此外，与直接安装或柱塞冷却晶体相比，小瓶安装晶体的镶嵌性平均较低（10–15%），且两种晶体之间的差异最小一和b条单元-细胞边缘。因此，小瓶上的晶体看起来更加有序。一种可能的解释是，暴露在环境空气中时，通过直接安装和插入冷却启动扩散过程可能会在晶体内产生浓度梯度，导致冷却不均匀。

报告的仪器单位体积不确定度CrysAlis公司^赞成因为测试的索姆丁晶体通常约为50℃^三或0.01%，约为小瓶安装晶体典型变化的7倍。因此，有可能进一步提高可测量的再现性。小瓶安装基线变化的来源可能是冷却前存在的固有室温变化，或冷却过程本身的变化；例如，晶体相对于低温流的方向。用微RT管测量的室温单位细胞体积显示出σ_体积= 689 Å^三（补充表S1），因此我们不能排除冷却前的固有室温变化。使用小瓶安装或增强柱塞冷却的进一步实验可能有助于澄清这些问题。

4.4.1条。湿度和湿流流速

可以调节湿流的特性。这里使用的湿度设置基于拉乌尔定律，并通过在充满冷冻溶液的离心管上使用湿度探针进行确认。根据经验选择流速，以形成包括小瓶和结晶滴在内的潮湿外壳。原则上可以使用其他湿度和流速。

4.4.2. 小瓶中溶液的成分

在大多数情况下，我们使用与冷冻浸泡溶液相同的小瓶溶液。然而，情况并非如此，使用不同的浸泡和小瓶溶液为低温冷却提供了一些新的可能性。

4.4.3. 小瓶中晶体的平衡时间

最初，我们选择了2分钟的平衡时间，因为扩散方程的数值解预测小瓶内的线性水汽梯度应在几秒钟内消散。然而，我们发现单位细胞体积的变化发生在超过2分钟的时间尺度上。大于～150µm的晶体显示为～500℃^三更大的单位-细胞体积与隔夜平衡，而相反的影响发生在较小的晶体。（其他实验表明^三大晶体的增加发生在<60分钟内。）因此，小瓶的负晶体尺寸依赖性与过夜平衡有关，如图4所示在2分钟的平衡中更强。延长时间依赖性的来源尚不清楚，但已经指出，湿度依赖性的晶体填充变化可能会缓慢发生（桑切兹·威瑟比等。, 2009). 实际上，对于我们的许多实验，我们采用了一种标准做法，即在晚上设置小瓶支架，在一夜之间平衡，然后在早上收集衍射数据。我们测试的最长平衡时间是几天，晶体衍射与较短的平衡时间相似。不影响衍射的最大平衡时间可能与生长液滴中晶体的限制时间类似，主要取决于小瓶和瓶盖之间的密封。

4.4.4。针-瓶组件的温度

因为湿度对温度非常敏感(https://www.tis-gdv.de/tis_e/misc/klima.htm)针-瓶组件的温度会对单位-细胞体积产生重大影响。当我们试图分离两个不同的实验者在单位细胞体积（高达0.4%）上的系统差异时，我们发现了这一点。单位细胞体积差异可追溯至手指温度的10°C差异。我们假设温热的手指会增加水晶盖的温度，增加小瓶中气体的温度，减少相对湿度在小瓶中，使更多的水从小瓶中的晶体和溶液中蒸发，产生更小的单位细胞体积。冰冷的手指有相反的效果。因此，我们使用木制手柄和经过凹槽改造的木镊子来接受冷冻瓶，以限制晶体盖或冷冻瓶的加热或冷却。

4.4.5. 在低温流中的转移时间

将小瓶转移到低温流中可以冷却系统，促进水在晶体上的冷凝，这会增加晶胞体积，并可能导致结冰。对于这里测试的索姆丁晶体，冷冻瓶的热质量似乎为安装提供了充足的时间（2–3秒）。我们对浸泡在液体塑料中或包裹在橡胶或玻璃纤维绝缘材料中的小瓶进行了一些测试（使用位于冷冻回路中晶体位置的热电偶），这将可用于安装的时间增加了两到五倍。对于比索姆丁晶体对湿度更敏感的晶体来说，这可能是必要的。

4.5.1条。湿流下的晶体操作

在收获和浸泡晶体时，由于环境条件的影响，在可控的湿流中操作晶体会限制脱水效果。由于水的蒸发速率与晶体溶液和环境之间的湿度差成正比，因此使用湿流可以将蒸发速率降低几倍，从而为晶体操作留出更多时间。对于任何结晶学实验室来说，具有易于定位的输出端口的湿度控制器都是有益的。类似的考虑也适用于机器人安装设备的开发（Deller&Rupp，2014). 为了最大限度地提高再现性，湿度控制需要成为结构确定管道的一个组成部分。

例如，我们尝试去除晶体外部的溶液，这会增加信噪比（Kitago等。, 2005)在某些情况下，其本身具有足够的低温保护作用（佩莱格里尼等。, 2011). 在湿流中的盖玻片上涂抹十次（约5秒）后，将索姆丁晶体装入小瓶，得到平均单位细胞体积V（V）= 501 594 (400) Å^三（补充表S1），在300°以内^三小瓶安装晶体的预期体积。相比之下，在直接安装（1.2 m显微镜距离）之前，在环境湿度（27%RH）下进行吸墨V（V）= 495 278 (925) Å^三，如图3所示(一)（补充表S1）。

4.5.2. 低温平衡通过蒸汽扩散

挥发性防冻剂。尽管很难使用，但长期以来人们都知道有机溶剂对低温结晶学很有用（Petsko，1975). 安装小瓶后，有机溶剂的高蒸汽压可以通过平衡而变为优势通过蒸汽扩散。图7显示了晶体的衍射图案，这些晶体直接从生长缓冲液中循环，然后放置在小瓶中，在有或没有甲醇的情况下放置在井液上。这里，甲醇是一种合适的低温保护剂（表3)并且平衡不需要浸泡。这种方法的优点是需要最少的处理，对于脆性晶体和使用有机溶剂作为沉淀剂的条件下生长的晶体可能特别有用。

图7 利用蒸汽平衡实现索姆丁晶体的低温保护。按照§2. (一,b条)晶体直接安装在生长滴上，并在小瓶中平衡(一)井溶液45分钟或(b条)井液（稀释至80%）+35%(w个/v（v）)甲醇9分钟(c（c）,d日)晶体在井水溶液中浸泡2分钟+10%(w个/v（v）)EG并在小瓶中平衡(c（c）)相同溶液2小时或(d日)井液+30%(w个/v（v）)EG 45分钟。

非挥发性防冻剂。低温平衡通过蒸汽扩散也有助于非挥发性冷冻保护剂。如果晶体是从相对较低浓度的沉淀剂（如低分子量PEG、丙二酸钠和其他盐）中生长出来的，这些沉淀剂是天然防冻剂，晶体可以直接从生长液中循环到含有较高浓度沉淀剂的小瓶中。这将导致水从晶体中流出，晶体中的低温保护剂浓度逐渐增加。示例如图7所示将晶体浸泡在10%乙二醇中，然后与30%乙二醇平衡以完成低温保护。另见表3这可能被视为一种补充技术，可以简单地将晶体直接浸泡在较高的冷冻保护剂浓度中，因为蒸汽平衡情况下应该更加脱水。

4.5.3. 系统低温退火

有许多改进低温衍射的例子通过低温退火技术（Yeh&Hol，1998; 竖琴等。, 1998; 汉森等。, 2003; Juers&Matthews，2004年). 低温退火通常包括在重新安装之前短暂地阻断冷流或将晶体转移到某种外部溶液中一段时间。小瓶安装提供了在重新安装之前使用含有已知湿度溶液的小瓶直接拆卸晶体的可能性。我们用小瓶安装进行了三次退火测试。在每种情况下，将五个晶体安装在小瓶上，隔夜平衡，衍射，直接用同一小瓶卸下，重新平衡数小时，然后再次衍射。在每种情况下，σ_体积减少（1143至427欧^三，468至355奥^三和545至395º^三)平均衍射极限略有提高（2.47至2.41欧、2.17至2.15欧和2.36至2.26欧）（补充表S1）。