Structural and biophysical analysis of interactions between cod and human uracil-DNA N-glycosylase (UNG) and UNG inhibitor (Ugi)

Assefa, N.G.; Niiranen, L.; Johnson, K.A.; Leiros, H.-K.S.; Smalås, A.O.; Willassen, N.P.; Moe, E.

doi:10.1107/S1399004714011699

研究论文

生物
结晶学

国际标准编号：1399-0047

第70卷| 第8部分| 2014年8月| 第2093-2100页

doi:10.107/S1399004714011699

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cod与人尿嘧啶-DNA相互作用的结构和生物物理分析N个-糖基化酶（UNG）和UNG抑制剂（Ugi）

Netsanet Gizaw Assefa公司,^一莱拉·尼拉宁,^a、，^b条肯尼思·约翰逊,^一汉娜·克里斯蒂·施罗德·莱罗斯,^一阿恩·奥斯卡·斯马洛斯,^一尼尔斯·佩德·威拉森 ^一和艾琳·莫伊 ^a、，^c（c）^*

^一化学系/Norstruct，UiT挪威北极大学，挪威特罗姆瑟9037号，^b条图尔库大学生物化学系，FIN-20014芬兰图尔库，以及^c（c）葡萄牙奥埃拉斯共和国新里斯本大学基米卡生物技术研究所（ITQB），2780-157
^*通信电子邮件：elin.moe@uit.no

(收稿日期：2013年11月8日； 2014年5月20日接受；在线2014年7月25日)

尿嘧啶-DNAN个-大西洋鳕糖苷酶（cUNG）具有冷适应特性，与其中温同源人类UNG（hUNG）相比，具有催化效率高、低温最适活性和热稳定性降低等特点。为了了解与冷适应特性相关的酶-底物相互作用的作用，已经确定了cUNG与噬菌体编码的天然UNG抑制剂（Ugi）复合物的结构。用等温滴定法分析了相互作用热量测定法（ITC）。这个晶体结构cUNG–Ugi的分辨率为1.9º，在非对称单元通过关联非晶体对称性。将cUNG–Ugi复合物与先前确定的UNG–Ugi结构进行比较表明，它们非常相似，并证实了Ugi的核苷酸模拟特性。生物物理方面，cUNG和Ugi之间的相互作用非常强，并显示出一个结合常数(K（K）_b条)这比hUNG–Ugi大一个数量级。cUNG和hUNG与Ugi的结合被焓力和熵力所支持；然而，cUNG与Ugi的结合主要由焓，而熵项在hUNG中占主导地位。观察到的结合性能差异可以用整体上更大的正静电来解释表面电位在cUNG的蛋白质-Ugi界面和hUNG的稍微疏水的表面。

关键词：冷适应;尿嘧啶-DNAN个-糖化酶;大西洋鳕鱼;蛋白质抑制剂复合物;蛋白质-蛋白质相互作用;等温滴定量热法;结合亲和力。

三维视图：4升

PDB参考：UNG–Ugi综合体，4lyl

1.简介

尿嘧啶可能在DNA复制过程中通过错误地结合dUTP而不是dTTP或通过胞嘧啶脱氨基作用在DNA中产生（克罗肯等。, 1997 ). 如果不加以修复，尿嘧啶损伤可能会对生物体产生有害后果。高度诱变的U–G病变可导致G:C到T:a的颠换，从而改变基因组序列。尽管尿嘧啶可以与腺嘌呤形成足够的碱基对，但其掺入也会干扰DNA结合蛋白的DNA相互作用，并影响基因表达的调节（Visnes等。, 2009 ; 卡夫利等。, 2007 ; 扎尔科夫等。, 2010 ). 尿嘧啶-DNAN个-糖基化酶（UNG）是一种DNA修复酶，它通过切割DNA序列，启动碱基切割修复（BER）途径中尿嘧啶的清除N个-尿嘧啶和脱氧核糖骨架之间的糖苷键。已从许多生物体中鉴定出UNG，并已确定人类UNG的晶体结构（摩尔、阿瓦伊、斯拉普豪格等。, 1995 )，单纯疱疹病毒1型（Savva和Pearl，1995年 ),大肠杆菌（肖等。, 1999 )、大西洋鳕鱼（Leiros等。, 2003 ),耐辐射球菌（雷罗斯等。, 2005 )和霍乱弧菌（雷德等。, 2010 ). 所有六种酶都具有相似的结构，并由一个经典的单一结构域组成α/β-用中心四股平行绞合折叠β-由11包围的薄板α-螺旋线。N和C端子位于中心的相对侧β-板和活性部位位于β-表。

UNG的一个共同特征是被Ugi（Zharkov）抑制等。, 2010). Ugi是一种由枯草芽孢杆菌噬菌体（PBS1和PBS2），使用尿嘧啶代替胸腺嘧啶作为DNA的正常成分（Wang和Mosbaugh，1988 ; 圆锥体等。1980年 ). Ugi能抑制多种生物的UNG，并能形成一种在正常生理条件下无法被破坏的非常稳定的复合物（Acharya等。, 2002 ; 贝内特等。, 1993 ).

这个晶体结构已确定Ugi复合体中的UNG为来自人类的UNG（Mol、Arvai、Sanderson等。, 1995 )，单纯疱疹病毒1型（Savva和Pearl，1995年),大肠杆菌（西克里希南等。, 2002 ; 拉维尚卡尔等。, 1998 ; 普特南等。, 1999 )爱泼斯坦-巴尔病毒（Géoui等。, 2007 )和结核分枝杆菌（考沙尔等。, 2008 ). 这些复杂结构表明，UNG–Ugi相互作用与UNG与DNA的相互作用非常相似（Mol、Arvai、Sanderson等。, 1995; 普特南等。, 1999; Savva&Pearl，1995年); 因此，研究UNG-Ugi相互作用似乎有助于理解UNG-DNA相互作用的本质。Ugi与UNG的相同保守区结合，这些保守区通常与DNA相互作用：4-Pro环（165-PPPPS-169）、Gly-Ser环（246-GS-247）和小凹槽插入环（Leu272环；268-HPSPLSVY-275）（hUNG编号；图1一).

图1
(一)cUNG–Ugi复合体（蓝色为cUNG，绿色为Ugi）叠加在hUNG–乌吉复合体（PDB条目）上1个小时; 灰色）带有一些标记的回路。与hUNG–Ugi相比，cUNG–Ugi没有大的构象变化，除了一些灵活的环区。(b条)cUNG–Ugi复合物（cUNG为浅蓝色，Ugi为绿色）的带状表示，叠加在hUNG（灰色）复合物结构上，带有含有DNA（PDB条目）的未分离底物（尿嘧啶）1个小时). (c（c）,天)计算的静电表面电位第页，共页(c（c）)cUNG（链EF）和(天)hUNG与Ugi（灰色）复合。选定的残留物显示为棒状模型并贴上标签。UNG表面根据25°C（−12）下的静电势呈渐变色千吨/e到+12千吨/e）从负电位（红色）到正电位（蓝色）。不同之处在于表面电位cUNG的变化可以看作是接触表面上的微小变化，特别是在容纳Ugi的凹槽中β-模拟DNA磷酸骨架的薄片。

Ugi由五股反平行线组成β-床单和两张α-螺旋线。它通过插入其β1条链进入酶的保守DNA结合槽，而不接触尿嘧啶特异性口袋（Mol、Arvai、Sanderson等。, 1995; 普特南等。, 1999). hUNG和Ugi之间的界面涉及12条酶侧链和14条抑制剂侧链，这解释了复合物的高度稳定性，在生理条件下不能被破坏（Bennett等。, 1993; Mol、Arvai、Sanderson等。, 1995). 尽管来自不同生物体的UNG与Ugi结合的机制相似，但结合亲和力存在差异（Acharya等。, 2003 ; 考沙尔等。, 2008; 盖伊等。, 2007). 这被认为是由氢键数量、疏水相互作用和其他静电相互作用的差异引起的。

这个催化域来自大西洋鳕鱼的联合国天然气（UNG）之前已被鉴定，于年重组生产大肠杆菌纯化并表征，及其晶体结构已确定（车道等。, 2002 ; 莱罗斯等。, 2003; Moe公司等。, 2004 ). 生物化学表征实验和分子动力学模拟数据表明，与重组人UNG相比，cUNG具有特征性的冷适应特征，如活性最佳的低温、高催化效率、降低的温度稳定性和更大的结构弹性（Lanes等。, 2002; 奥卢夫森等。, 2005 ). 的确，差示扫描量热法（DSC）对cUNG和hUNG的研究表明，cUNG的热稳定性低于hUNG（Assefa等。, 2012 ). 此外晶体结构表明cUNG具有更积极的静电表面电位在底层绑定站点（Leiros等。, 2003; Moe公司等。, 2004)这可能解释了生化研究（Lanes等。, 2000 , 2002). 在这方面，非极性Val171在cUNG表面的存在，而不是像hUNG中那样带负电荷的Glu，已被确定为至关重要的（Moe等。, 2004).

这里，我们给出1.9º的分辨率晶体结构cUNG与Ugi的复合物以及cUNG和hUNG与Ggi的实验结合分析。我们进行了比较结构滴定和等温滴定热量测定法（ITC）分析，以解决酶-底物相互作用如何针对cUNG的寒冷环境进行优化的问题。我们的结果表明，在25°C时，cUNG比hUNG与Ugi的结合更紧密。此外焓cUNG–Ugi相互作用中的结合自由能大于hUNG–乌吉相互作用中熵项占主导地位的自由能。这个晶体结构cUNG–Ugi复合物使我们能够解释更大的约束力焓通过优化的正静电表面电位在cUNG的Ugi结合位点及其附近。此外，更疏水的hUNG表面解释了hUNG–Ugi结合中更大的熵贡献。

2.材料和方法

2.1. cUNG、hUNG和Ugi的表达和纯化

如前所述进行UNG的表达和纯化（Assefa等。, 2012). 由Thibault Géoui博士（EMBL，Grenoble）善意提供的Ugi重组质粒pRSETb用于转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS细胞。纯化和表达程序根据Bennett&Mosbaugh（1992）修改 ). 简言之，Ugi蛋白在37°C下表达，在用1 mM（M）IPTG。细胞悬浮在25米处M（M）Tris–HCl pH值7.5，10 mM（M）氯化钠，1米M（M）EDTA、1%甘油并进行超声波处理。通过在48000℃下离心细胞裂解液15分钟来收集上清液克然后将上清液加热至95°C 15分钟，并在48000下离心1小时克将所得上清液涂敷在Q-Sepharose柱上，然后涂敷在Superdex 75柱上。将Ugi蛋白溶液浓缩并储存在−20°C下。

2.2。联合国大会-乌吉综合体的准备工作

通过将cUNG和Ugi以1:2的比例混合（过量Ugi）并将溶液稀释至约3 mg ml，制备cUNG–Ugi复合物⁻¹在25 m的缓冲区内M（M）Tris–HCl，10 mM（M）氯化钠，1米M（M）EDTA，1%甘油，pH 7.5。让蛋白质在室温下结合10分钟，然后在4°C下结合20分钟。随后，将溶液涂敷在1 ml HiTrap Q柱上（GE Healthcare），以将cUNG–Ugi复合物与未结合的Ugi和cUNG分离。将纯化的复合物浓缩并保存在4°C下。

2.3. 结晶、数据收集、，结构测定和分析

cUNG–Ugi复合物在4°C下使用吊滴法结晶，加入7.5 mg ml⁻¹25m内的蛋白质复合物M（M）Tris–HCl pH值7.5，10 mM（M）氯化钠，1米M（M）EDTA公司。将1µl蛋白质与0.2µl 0.1混合制成滴液M（M）NaBr和0.8µl储液罐溶液，含0.1M（M）Tris–HCl pH 7.4，270 mM（M）锂₂SO公司₄4%PEG 550 MME，17%PEG 4000。将尺寸约为200×200×50µm的晶体转移到由17%PEG 4000、10%甘油和其他初始浓度的储层添加剂组成的低温保护剂溶液中，然后在液氮中闪蒸冷却。

衍射数据是在法国格勒诺布尔（de Sanctis）欧洲同步辐射设施（ESRF）的束线ID-29上收集的等。2012 )使用ADSC Quantum 315r探测器。水晶属于空间组 P（P）2₁，带有单位-细胞参数一= 98.21,b条= 86.92,c（c）= 175.37 Å,β=90.35°，具有伪对称平移(x个+ 0.17,年+ 1/2,z+0.17）和孪生（−小时, −k个,我; 孪晶分数0.235）。在不对称单元，溶剂含量为54.8%，马修斯系数为2.7º^三 Da公司⁻¹。

使用XDS公司程序包（Kabsch，1993 ). 数据中观察到两个相关但不一致的晶格，导致许多重叠反射。有必要降低WFAC1参数的值XDS公司为了增加在缩放和合并数据之前拒绝的不匹配数。该结构由分子置换使用MOLREP公司（Vagin&Teplyakov，2010年 )英寸中央对手方清算所4没有PST矢量信息。搜索模型是cUNG–Ugi复合物的模型，由重叠的cUNG（PDB条目）构成1行b; 莱罗斯等。, 2003)关于hUNG–Ugi复合体的结构（PDB条目呃; Mol、Arvai、Sanderson等。, 1995). 该结构于年进行了改进REFMAC公司5（穆尔舒多夫等。, 2011 )使用基于振幅的双胞胎精炼（没有TLS改进）穿插着几轮手动模型构建库特（埃姆斯利等。, 2010 ). 自动生成的NCS约束用于前十个精炼仅循环，而双循环精炼在所有步骤中都使用了。最终的模型R（右）_工作和R（右）_自由的数值分别为23.7%和28.3%，具有可接受的几何形状，并使用摩尔概率（陈）等。, 2010 ). 数据收集和细化统计如表1所示。

表1
X射线数据采集和晶体学细化统计用于cUNG–Ugi

括号中的值用于外部分辨率外壳。

数据收集
X射线源	ID-29，欧洲战略参考框架
“空间”组	P（P）2₁
单位-细胞参数（Ω，°）	一= 98.21,b条= 86.92,c（c）= 175.37,β= 90.35
分辨率（Ω）	30–1.94（2.04–1.94）
波长（Ω）	1
独特反射次数	199006 (26370)
多重性	2.94 (3.17)
完整性（%）	91.2 (86.6)
〈我〉/〈σ(我)〉	10.76 (3.29)
R（右）_合并†(%)	7.3 (41.3)
威尔逊B类系数（Ω²)	29.9
精炼
R（右）因子（所有反射）（%）	23.7
R（右）_自由的‡(%)	28.3
原子数	21002
水分子数量	1483
R.m.s.d.，粘结长度（Ω）	0.011
R.m.s.d.，粘结角（°）	1.669
平均B类系数（Ω²)
所有原子	25.2
蛋白质	25
水分子	27.6
拉马钱德兰阴谋
受欢迎地区（%）	96.2
允许的区域（%）	100
PDB代码	4升

†R（右）_合并= $[\textstyle\sum_{hkl}\sum_}|i_{i}（hkl）-\langle i（hk1）\rangle|/]$ $[\textstyle\sum_{hkl}\sum_{i} 我_{i} （香港）]$ ，其中我_我(香港特别行政区)是我反射测量香港特别行政区和〈我(香港特别行政区)〉是加权平均数的所有测量香港特别行政区。
5%的反射用于R（右）_自由的计算。

cUNG–Ugi、hUNG–Ugi（PDB条目）的UNG–U gi接口呃)和单纯疱疹病毒1 UNG–Ugi（PDB条目1乌迪; Savva&Pearl，1995年)使用蛋白质界面、表面和组装服务(国际学生成绩评估; Krissinel&Henrick，2007年 ). 此外如果…怎么办web界面（Vriend，1990 )用于识别原子间距小于6º的界面静电相互作用。这些数字是使用PyMOL公司(https://www.pymol.org/)和静电表面电位使用APBS公司插件PyMOL公司（贝克等。, 2001 ). 可及表面积（ASA）计算如下曲面赛车5.0（茨奥迪科夫等。, 2002 )探针半径为1.40Å。cUNG（链条E类)和hUNG（链条E类)使用了UNG–Ugi复合物。

2.4. ITC的约束性研究

使用Nano-ITC III量热计在25°C（标准ITC条件）下进行ITC测量热量测定法Sciences Corporation（CSC；美国犹他州），电池体积为997µl。细胞中的UNG浓度为20–50µM（M）注射器中的Ugi浓度为267–667µM（M）Ugi溶液以5µl等分溶液的形式注入UNG溶液中，注射和搅拌之间的间隔为300 s，转速为150转/分⁻¹所有实验均在20 m范围内进行M（M）磷酸钠pH值7.5200 mM（M）氯化钠。通过凝胶过滤或使用赛默飞世尔科学公司（美国罗克福德）的皮尔斯Slide-A-Lyzer透析盒透析，在3 kDa截止值下，使用0.2µm注射器过滤器过滤（美国比勒里卡州米利浦），与该缓冲液进行缓冲液交换。使用NanoDrop 2000c分光光度计（美国特拉华州威明顿市NanoDrot Technologies）在280 nm处的吸光度和计算出的每个蛋白质的消光系数来测定蛋白质样品的浓度。

在单独的实验中测量了Ugi在溶剂中的稀释热。对原始数据进行整合，对非特异性加热进行校正，对浓度进行标准化，并使用纳米分析CSC提供的程序。根据配体和细胞内大分子的摩尔比绘制每摩尔注射剂的热值。绑定亲和力的值，K（K）_b条，以及绑定焓， ΔH（H）_b条，是通过将原始数据拟合到简单单位点结合模型的最佳拟合曲线而获得的。结合吉布斯自由能变化，ΔG公司_b条和约束熵项，T型ΔS公司_b条，然后根据关系计算ΔG公司_b条= −无线电发射自然对数K（K）_b条=ΔH（H）_b条−T型ΔS公司_b条。

cUNG–Ugi晶体结构已作为条目存入蛋白质数据库4升。

3.结果

先前的生化和结构分析结果表明，与hUNG相比，cUNG的催化效率提高是因为大量正静电产生的底物亲和力增加表面电位在cUNG的基底结合区域。为了获得关于酶-底物相互作用的更详细信息，我们确定了晶体结构并通过ITC实验测量了cUNG和hUNG的Ugi-结合特性。

3.1、。这个晶体结构cUNG–Ugi的分辨率为1.9º

这个晶体结构cUNG–Ugi复合物的分辨率为1.9º，在不对称单元，所有这些都与非晶体学对称性有关。由于伪对称翻译（PST）的存在和高拷贝数，数据处理变得复杂非对称单元。观察到的数据重叠导致R（右）_合并值非常大，并且数据在开始时不可用。我们在中使用了WFAC1参数XDS公司通过减少WFAC1值从而增加不匹配的数量来解决此问题。由于PST和孪生，数据的行为就像它们属于空间组 P（P）2，但在此处理时空间组他们只给出了不完全的分子置换溶液，这些溶液无法精炼。在正确处理后空间组， P（P）2₁，该结构很容易通过分子替换，无论是否使用PST矢量信息，都会给出相同的解决方案。在精细化，这个R（右）当孪生时，前十个周期的数值下降到30%以下精炼已使用。A类孪生定律在随后的所有步骤中也实施了，尽管其效果很小（在R（右）值）。

除了一些柔性表面残基以及与天然cUNG（PDB入口）叠加时的根平方（r.m.s.）偏差外，八个cUNG结构几乎相同1行b)为0.3º。因此，与原生cUNG相比，复合cUNG结构没有大的变化。将八个cUNG–Ugi分子相互叠加时的r.m.s.偏差平均为0.3Å，hUNG–Ugi的r.m.s.偏差为0.4Å（PDB条目呃; 图1一). 差异最大的是Ugi分子，它们在一些不涉及复杂形成的环区（环29–35、48–53和74–78）非常灵活，尤其是在环29–35中，它的电子密度低，且大B类因素。X射线数据采集和晶体学细化统计cUNG–Ugi结构如表1所示。

3.2. cUNG–Ugi复合物结构中分子间静电相互作用更加优化

使用国际学生成绩评估（Krissinel&Henrick，2007）). 对八种cUNG–Ugi络合物中的每一种进行了详细的相互作用分析（界面面积、每个键的能量贡献和界面形成时的溶剂化自由能增益），并使用平均值与hUNG–乌吉络合物（Mol、Arvai、Sanderson等。, 1995). 根据分析，cUNG–Ugi的界面面积（平均值1043 Au²)小于hUNG–Ugi（1093²)（补充表S1¹). 界面分析还表明，在cUNG–Ugi结构中，平均氢键距离略短（2.8Å，而在hUNG中为2.9Å），尽管大多数氢键是在与hUNG–Ugi相同的残基之间形成的。cUNG–Ugi中似乎还有更多的替代氢键和侧链到主链的氢键，以及cUNG-Ugi界面中的两种静电相互作用（Lys218–Asp40和His250–Glu28），这在hUNG–Ggi中没有发现（表2和补充表S2）。为了确定检测到的键距差异不是由使用不同的精炼程序（REFMAC公司5.8与X-PLOR相比3.851）在结构确定过程中，PDB入口的沉积结构系数呃从PDB中检索到hUNG–Ugi复合物结构，并使用相同的精炼用于cUNG–Ugi的程序。尽管与原始结构相比观察到一些微小变化（数据未显示），但总体结果与原始表面积和键距计算结果几乎相同。

表2
氢键和静电相互作用EF公司cUNG–Ugi和hUNG–Ugi复合物的分子

cUNG–Ugi链E类和F类被选为八个综合体的代表。使用国际学生成绩评估、和如果…怎么办网络界面用于识别原子间距小于6°的静电相互作用。独特的债券以粗体显示。

cUNG–乌吉语			hUNG–乌吉语
UNG公司	距离（Ω）	乌吉	UNG公司	距离（Ω）	乌吉
氢键
Gln144欧^∊1	2.64	亮氨酸23 N	Gln144欧^∊1	2.97	亮氨酸23 N
Gln144牛顿^∊2	2.73	亮氨酸23 O	Gln144牛顿^∊2	2.94	亮氨酸23 O
His148 N型^∊2	3.09	21 O系列^γ	His148 N型^∊2	2.79	21 O系列^γ
Gln152牛顿^∊2	2.78	Gln19 O型	Gln152牛顿^∊2	3.05	Gln19 O型
序列169 N	2.85	谷氨酸20 O^∊1	序列169 N	2.98	谷氨酸20 O^∊1
Ser169 O系列^γ	2.56	谷氨酸20 O^∊2	Ser169 O系列^γ	3.06	谷氨酸20 O^∊2
			阿拉214 O	2.84	Tyr65 O型^η
阿拉214 N个	2.76	Tyr65 O型^η
Asn215牛顿^δ2	2.76	Asp61 O型^δ1	Asn215牛顿^δ2	3.04	Asp61 O型^δ1
Lys218牛^ζ	2.68	阿斯普61^{O（运行）δ2}	Lys218牛^ζ	2.64	Asp61 O型^δ2
Ser247 N系列	2.38	谷氨酸28 O^∊2	Ser247 N系列	3.08	谷氨酸28 O^∊2
Ser247 O系列^γ	2.76	谷氨酸28 O^∊2
Pro271 O系列	2.57	Gln73牛顿^∊2	Pro271 O系列	2.80	Gln73牛顿^∊2
亮氨酸272 N	3.46	符合56 S^δ
Arg276牛顿^η1	3.27	Glu31 O型
			Arg276牛顿^η2	2.98	Glu31 O型^∊1
平均	2.81			2.93
静电相互作用
Lys218牛^ζ	2.68	Asp61 O型^δ2	Lys218牛^ζ	2.64	Asp61 O型^δ2
Lys218牛^ζ	5.95	Asp40 O型^δ2
His250牛顿^δ1	5.22	谷氨酸28 O^∊2
His268 N系列^δ1	5.46	谷氨酸20 O^∊2	His268 N系列^δ1	5.93	谷氨酸20 O^∊2
			Arg276牛顿^η2	2.98	Glu31 O型^∊1
平均	4.83			3.85

3.3. Ugi模拟DNA底物的静电和形状互补性

hUNG–DNA的叠加（PDB条目1个小时; 帕里克等。, 2000 )和cUNG–Ugi构造（图1b条)表明Ugi与UNG的DNA-结合位点结合，并与UNG产生与DNA相同的非特异性接触。如Mol、Arvai、Sanderson所述等。(1995)，Ugi通过与保守的UNG活性位点残基形成氢键和调节疏水囊中突出的Leu272，模拟双链DNA的形状和电荷互补性。在cUNG–Ugi结构中，这些接触通过更短的距离、额外的氢键和远距离静电相互作用进一步加强。例如，插入的β-表和Glu28α-螺旋）紧密结合在cUNG–Ugi中（表2).

3.4. cUNG通过主要由焓力驱动的相互作用使Ugi更紧密地结合

为了分析cUNG和hUNG与抑制剂Ugi之间相互作用所涉及的力，通过ITC在20 m内对其结合特性进行了实验测量M（M）磷酸钠pH值7.5200 mM（M）25°C时的氯化钠。图2显示了25°C下UNG和Ugi组合的典型ITC曲线。反应焓校正空白运行和蛋白质浓度的值，并绘制Ugi:UNG摩尔比图（图3). 两种样品的结合化学计量比约为1:1。热力学结合参数如表3所示并表明cUNG与Ugi的结合比hUNG更紧密，具有结合常数(K（K）_b条)3.25×10⁷和0.15×10⁷ M（M）⁻¹分别是。的大小和负值ΔG公司_b条从热力学角度来看，这两种酶都强烈支持这种结合。的负值ΔH（H）_b条以及T型ΔS公司_b条in-hUNG和cUNG表明，结合过程是焓驱动和熵驱动的。然而ΔH（H）_b条和T型ΔS公司_b条到ΔG公司_b条从而达到K（K）_b条在这两种酶中似乎有所不同，焓贡献在cUNG中占主导地位，熵项在hUNG中占据主导地位（表3).

表3
25°C下20 m内Ugi与cUNG和hUNG结合的热力学结合参数M（M）磷酸钠，200 mM（M）氯化钠pH值7.5

配合的标准偏差(χ²)给出了。在95%置信水平下分析了实验直接测量的参数的标准偏差。

	联合国大会	挂
ΔG公司_b条（千焦摩尔⁻¹)	−42.9	−35.2
ΔH（H）_b条（千焦摩尔⁻¹)	−25.1 ± 0.8	−9.4 ± 1.1
T型ΔS公司_b条（千焦摩尔⁻¹)	17.8	25.8
K（K）_b条(M（M）⁻¹)	(3.25 ± 2.88) × 10⁷	（0.15±0.13）×10⁷
K（K）_天（n）M（M）)	31	685
n个	0.994 ± 0.013	0.921 ± 0.055
χ²	1.69	2.95

图2
ITC原始热脉冲数据，用于UNG与20 m内25°C Ugi的关联M（M）磷酸钠，200 mM（M）氯化钠pH值7.5。将20 5µl等分Ugi注入含有UNG的997µl反应池中，测量热量。667 µM（M）乌吉被滴定到缓冲液中(一)和50µM（M）hUNG输入(b条); 267 µM（M）乌吉被滴定到缓冲液中(c（c）)和20µM（M）cUNG输入(天).

图3
25°C下20 m内UNG与Ugi结合的ITC结合等温线M（M）磷酸钠，200 mM（M）NaCl pH 7.5：曲线表示亲和力的非线性最小二乘拟合（线）(K（K）_b条),焓更改(ΔH（H）_b条)和化学计量(n个)通过将积分的热脉冲数据（散射点）拟合到单位点结合模型而获得。键：hUNG，闭合圆；cUNG，打开圆圈。

4.讨论

来自几个物种的UNG与Ugi的相互作用已经得到了广泛的研究，主要是因为它可能被用作药物靶点（Priet等。, 2005 ). 通过模拟DNA的形状和静电互补性，Ugi与UNG保守的DNA-结合槽结合，使其成为研究UNG与底物相互作用的有用模型（Mol、Arvai、Sanderson等。, 1995). 事实上，在UNG和Ugi界面上的所有静电相互作用中，负电荷的相互作用伙伴始终是Ugi残基，而正电荷的相互作用力伙伴始终是UNG残基。虽然大多数研究主要集中在UNG–Ugi关联的结构方面，但我们在此能够将结构研究与UNG–-Ugi相互作用的热力学数据结合起来，目的是将研究结果外推到UNG–DNA结合。大量重组Ugi的易生产性及其在一系列实验条件下的相对稳定性满足了ITC的应用要求。

鳕鱼酶cUNG是一种冷适应酶，与热活性同系物hUNG相比，其催化效率更高，热稳定性更低。增加的正静电表面电位在cUNG的DNA结合区，有人认为可以解释观察到的对带负电荷的DNA底物的更高催化效率（Leiros等。, 2003; Moe公司等。, 2004; 奥卢夫森等。, 2008 ). 我们的ITC结果表明，结合常数(K（K）_b条)因为cUNG与Ugi的关联比hUNG大一个数量级。这一观察结果与较小的K（K）_米与hUNG（Lanes）相比，cUNG酶动力学研究中确定的值（更好的底物亲和力）等。, 2002). 低温适应酶K（K）_米值的负值更大ΔG公司_b条比那些有更大K（K）_米价值观（Siddiqui和Cavicchioli，2006 ; Tsuruta&Aizono，2003年 )在本研究中，cUNG–Ugi也证明了这一点。

这个焓cUNG–Ugi组合的变化大于hUNG–Ugi组合。人们可能会认为ΔH（H）_b条可能是由结合后的显著构象变化引起的（小原等。, 2003 ). 然而晶体结构对cUNG–Ugi复合物的分析表明，cUNG的构象几乎与未复合的cUNG结构相同。观察到的大焓因此，变化必然源于界面区域残基之间有利的静电或非极性相互作用。事实上，我们观察到cUNG–Ugi复合物的界面区域具有更积极的静电势表面（图1c（c）和1天)与hUNG–Ugi（PDB入口）相比，静电相互作用数量增加呃). 较大的绑定焓cUNG–Ugi（−25.1 kJ mol⁻¹25°C时，与−9.4 kJ mol相比⁻¹对于hUNG–Ugi），明确表明cUNG–Ugi中的静电相互作用比hUNG-Ugi复合体中的静电作用更稳定。特别是，与hUNG相比，cUNG中的Glu171Val、Val185Lys、Gln250His和Tyr275His取代导致与带负电荷的Ugi和DNA底物发生更有利的相互作用。这些发现进一步支持了分子间静电相互作用增强导致cUNG结合亲和力增强的假设。

如上所述，焓主导的cUNG–Ugi络合物的形成可以用优化的极性接触和不太有利的构象来解释熵随后更稳定的复合体。埋藏界面表面积平均为50º²hUNG–Ugi中的较大值，表明在这种情况下熵该术语可能起源于非极性基团的更广泛埋藏，导致更大的去溶剂化能量增加，因此更大熵（补充表S3）。此外，更大的构象熵不太稳定的hUNG–Ugi复合体有助于熵控制。

这个共晶本研究中cUNG–Ugi的结构支持先前报道的Ugi DNA模拟特性。ITC对结合亲和力的测定表明，cUNG比hUNG对Ugi的结合力更强。我们从以前的生物化学研究中了解到，cUNG对其含U损伤的DNA底物（Lanes）的催化效率高于hUNG等。, 2000, 2002). 基于先前的生物化学和结构研究，以及本研究的结构和生物物理分析，我们认为cUNG的高催化效率主要是由于它通过增强与DNA底物的温度适应性相互作用而增加了底物结合亲和力，与DNA模拟抑制剂Ugi相同。

支持信息

三维视图：4升

PDB参考：UNG–Ugi综合体，4lyl

支持信息。内政部：10.1107/S1399004714011699/gm5031sup1.pdf

脚注

¹支持信息已存放在IUCr电子档案中（参考：GM5031标准).

致谢

我们感谢挪威研究委员会、国家功能基因组计划（FUGE）和特罗姆瑟大学资助该项目。感谢法国格勒诺布尔欧洲同步辐射设施（ID29）提供的束流时间。

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