2.1. 重组蛋白的表达与纯化

pPICZ公司α如前所述，构建了含有成熟SmVAL4蛋白ORF的载体（Farias等。, 2012)，在成熟蛋白序列的末尾包含一个终止密码子。中的转化者毕赤酵母菌株X33在抗zeocin YPD平板上筛选，并用pPICZ进行PCR扩增鉴定α载体侧翼引物(α-因子和3′AOX1）。选取20个具有正确插入物的菌落，在30°C下用0.5%甲醇诱导重组SmVAL4蛋白72小时。用表达量最高的菌落制作研究种子库，从中培养出发酵剂培养物（29°C，250转/分钟）⁻¹)在25 ml缓冲的最小甘油中（BMGY；100 mM（M）磷酸钾pH 6.0，1.34%酵母氮碱，4×10⁻⁵%生物素、1%酵母提取物、1%甘油）置于250 ml带挡板的烧瓶中，29°C，300转/分⁻¹直到OD₆₀₀达到2.0（约18小时）。将发酵剂培养物接种到300 ml BMG中的2.0 l挡板烧瓶中，并继续生长直至OD₆₀₀达到2到6之间。细胞被轻轻地造粒（3000克，室温下5分钟），并重新悬浮在1000 ml缓冲的最小甲醇中（BMMY；100 mM（M）磷酸钾pH 6.0，1.34%酵母氮碱，4×10⁻⁵%生物素、1%酵母提取物、0.5%甲醇）启动诱导。每24小时，将100%甲醇添加到0.5%的最终浓度以保持诱导。诱导72小时后，通过10 000转/分离心分离酵母细胞中含有分泌SmVAL4蛋白（CSP）的培养基⁻¹。CSP通过0.22µm膜过滤器过滤，并在−80°C下储存，直至使用。解冻CSP后，在4°C下对500 ml CSP进行过夜透析，以0.1M（M）Tris–HCl pH 8.0，具有3.5 kDa分子量截止值的再生纤维素膜（Fisher Scientific）。在净化之前，大量透析去除了培养基和其他盐类。通过阳离子交换法在150 ml批次中纯化蛋白质色谱法在自然条件下，使用两个5 ml HiTra SP XL色谱柱（GE Healthcare），用0.1的七个色谱柱体积（CV）串联预平衡M（M）Tris–HCl pH 8.0，用0–1洗脱M（M）NaCl线性梯度。包含主峰的分数和制剂的纯度通过以下方法进行评估电泳使用NuPAGE Novex 4–12%Bis-Tris凝胶和MES运行缓冲液（Invitrogen）。1升振荡生长的典型产量约为25毫克>99%的纯蛋白质。

2.2。结晶

合并峰分并浓缩至8 mg ml⁻¹柠檬酸钠溶液pH 5.0。使用Cryos and PEG Suites（Qiagen）和Crystal Screen（Hampton Research）筛选晶体后，确定并优化结晶条件。通过将1.5µl蛋白质溶液与由0.085M（M）三水合醋酸钠pH 4.6，25%(w个/v（v）)聚乙二醇2000，0.17M（M）15%硫酸铵(v（v）/v（v）)甘油。这些晶体的形状通常类似于剑，尺寸为0.1×0.3×0.7 mm。我们用微酚切割每个晶体，得到一个较小的碎片，用于数据收集。由于晶体生长在含有足够低温保护剂的溶液中，所有晶体都直接在N流中闪蒸冷却₂在收集衍射数据之前，在113 K温度下对气体进行测量。

2.3. 数据收集和结构确定

使用Rigaku HTC探测器在贝勒医学院核心设施收集X射线衍射数据。X射线源是Rigaku FR-E+超亮微焦点旋转阳极发生器，带有VariMax高频光学元件。使用CrystalClear公司(d*TREK公司)包（Pflugrath，1999). 数据处理使用MOSFLM公司（莱斯利，2006年). 该晶体属于四方晶系空间组 P（P）6₁，具有近似的单位-细胞参数一= 78.65,b条= 78.65,c（c）= 83.52 Å,α=β= 90,γ= 120°.

正如我们实验室中解决的其他SCP/TAP蛋白结构的情况一样分子置换（MR）使用不同的搜索模型（Asojo等。, 2011, 2005; Asojo，2011年)带有相位器（麦考伊等。, 2005; 斯托罗尼等。, 2004). 唯一的MR搜索模型产生了一个具有R（右）_自由的小于40%的是sGLIPR1（PDB条目第三季度; Asojo公司等。, 2011)去掉主回路。正确的MR溶液意味着每非对称单元马修斯系数（Kantardjieff&Rupp，2003）; 马修斯，1968年)第3.97页^三 Da公司⁻¹溶剂含量为69%。通过自动建模改进了模型ARP协议/弯曲（莫里斯等。, 2003, 2004)然后使用库特（埃姆斯利等。, 2010)和结构精炼具有REFMAC公司5（穆尔舒多夫等。, 2011)在中央对手方清算所4包（Winn等。, 2011). 除非另有说明，否则使用PyMOL公司（德拉诺，2002). 结构质量和数据收集的详细信息如表1所示。原子坐标和结构因子已作为条目保存在PDB中第4页，共27页。

表1 数据收集和模型统计精炼用于SmVAL4（PDB条目第4页，共27页) 括号中的值用于外壳。 “空间”组 P（P）61 单位-细胞参数（Ω，°） 一= 78.65,b条= 78.65,c（c）= 83.52,α=β= 90,γ= 120 分辨率极限（Ω） 30.8–2.16 (2.23–2.16) 〈我/σ(我)〉 5.1 (1.0) 反射次数 342026 (28776) 独特反射次数 15770 (1361) 多重性 21.2 (21.1) R（右）合并†(%) 7.1 (76.2) 完整性（%） 99.7 (99.3) R（右）晶体‡ 0.175（0.218） R（右）自由的§ 0.208 (0.284) 相关系数  F类o个−F类c（c） 0.960  F类o个−F类c（c）（免费） 0.945 R.m.s.偏差  粘结长度（Ω） 0.024  粘结角度（°） 2.303 平均值B类系数（Ω2) 39.37 模型组成  单体 1  氨基酸残基 155  水分子 93  N个-乙酰-D类-葡糖胺 1 †R（右）合并=，其中我我(香港特别行政区)和〈我(香港特别行政区)〉是我用指数测量反射的平均强度香港特别行政区分别是。 ‡R（右）晶体=，其中F类光突发事件被观察到并且F类计算是计算出的结构系数振幅。 §R（右）自由的使用随机选择的5%的反射来计算。

2.4.尺寸排除色谱法和多角度光散射（剖面图）

SEC-MALS实验是通过以0.25 ml min的流速将10µg蛋白质样品加载到TSKgel SuperSW mAb HTP柱（美国宾夕法尼亚州普鲁士国王托索生物科学公司）上进行的⁻¹使用安捷伦1260 Infinity系列HPLC。柱缓冲液为1×PBS（pH 7.4）。紫外检测器（安捷伦）、miniDAWN三角光散射检测器（怀亚特技术）和Optilab rEX差动折射计（怀亚特技术）在柱下游串联。折射计提供了蛋白质浓度的连续指数。A和dn个/d日c（c）0.185 ml mg的（折射指数增量）值⁻¹已使用。牛血清白蛋白用作各向同性散射体，用于检测器归一化。蛋白质散射的光与其重量平均分子质量和浓度成正比。因此，使用ASTRA公司6.0软件。

2.5.体内突变酵母细胞的甾醇输出

乙酰化和出口甾醇按照蒂瓦里的描述，对培养上清液进行检查等。（2007年). 大麻(血红素1Δ)在含有胆固醇/Tween 80的培养基中培养缺陷酵母细胞，并用0.025µCi ml标记⁻¹[¹⁴C] -胆固醇（美国放射性标签化学品公司，美国密苏里州圣路易斯）。通过离心收集细胞，用合成完整（SC）培养基洗涤两次，稀释至OD₆₀₀在含有非放射性标记胆固醇的新鲜培养基中培养1个，隔夜培养。细胞离心脂类用氯仿/甲醇[1:1从细胞颗粒和培养上清液中提取(v（v）/v（v）)]。样品经干燥和分离薄层色谱法使用硅胶60板（TLC；德国达姆施塔特默克公司），使用溶剂系统石油醚/乙醚/乙酸（体积比70:30:2）。无线电标签脂类通过使用Berthold Tracemaster 40自动TLC线性分析仪（德国Bad Wildbad Berthold Technologies）进行扫描，对TLC进行定量。然后将TLC板暴露在荧光成像仪屏幕上并进行放射性标记脂类使用磷光体成像仪（Bio-Rad Laboratories，Hercules，California，USA）进行可视化。

2.6.体外固醇结合

如前所述进行放射性配体结合测定（Im等。, 2005; Choudhary&Schneiter，2012年). 在结合缓冲液（20 m）中纯化蛋白质（0-300 pmol）M（M）Tris pH 6.5，30 mM（M）NaCl，0.05%Triton X-100）与[^三H] -胆固醇（50或200 pmol）在30°C下保持1小时。然后通过Q Sepharose微球（GE Healthcare，USA）吸附将蛋白质从未结合配体中分离出来，冲洗微球并通过闪烁计数定量放射性配体。对于竞争性结合分析，结合反应中包括未标记的胆固醇（50或500 pmol）。为了确定非特异性结合，在没有添加蛋白质的情况下培养离子交换珠。

3.1. SmVAL4的解决方案结构

为了确定重组SmVAL4在溶液中的寡聚状态，通过尺寸排除色谱法和多角度激光器光散射（SEC-MALS）。蛋白质在上浆柱上出现一个单峰（图1b条). 蛋白质散射的光与其重量平均分子质量和浓度成正比。分子量测定为20.71±0.81kDa，这与电泳迁移率（图1一). 理论分子质量为18.81 kDa。理论分子量和实验分子量之间的差异可能是由于在巴氏杆菌结果表明，SmVAL4在溶液中形成单体，与之前报道的几种SCP/TAPS或CAP蛋白不同，包括GAPR-1和NaASP2，它们在溶液中生成二聚体（Asojo等。, 2005; 吉布斯等。, 2008).

图1 SmVAL4单体。(一)考马斯染色SDS凝胶显示SmVAL4样品的纯度及其约20 kDa的单体质量。车道M（M）含有分子量标记物（以kDa标记）。(b条)SEC-MALS分析表明，SmVAL4在溶液中是一种约20kDa的单体。(c（c）)适用于N个-糖化Asn118和近端残基转化为2F类o个−F类c（c）根据SmVAL4的精细模型计算出的电子密度图（灰色），并在1.2处绘制等高线σ.NAG公司，N个-乙酰基-D类-氨基葡萄糖。(天)SmVAL4结构的拓扑。

3.2. SmVAL4的总体结构

改进后的模型中有一个SmVAL4单体非对称单元。因此，结晶低聚物与溶液结构一致。一个Asn-连接的糖基化位点具有明确的密度，它被建模为N个-乙酰基-D类-与Asn118共价连接的氨基葡萄糖（图1c（c）). 寄生虫的天然SmVAL4被证明是N个-糖基化（Farias等。, 2012); 然而，尚不清楚巴氏杆菌-获得的重组SmVAL4与寄生源SmVAL5相同。最终精制的结构共包含155个氨基酸，其中153个具有清晰明确的主链和侧链电子密度，大于1.0σ连接氨基酸残基59–62的环在主链和侧链上都具有部分有序的电子密度，并且是结构中唯一包含任何具有Ramachandran异常值的氨基酸的区域，相关系数小于0.87。SmVAL4折叠为αβα四种混合品牌的三明治β-薄板夹在两个螺旋/环形区域之间（图1c（c）). SmVAL4的拓扑与其主序列对齐，如图1所示(天). SmVAL4的结构是独特的，无法从其他SCP/TAPS蛋白结构中预测；与其他CAP蛋白相比，这一点从结构中螺旋和链的独特位置可以看出（图2). SmVAL4保留了该特性α/β夹层CAP结构和一个大的中央空腔（图3). 然而，两个原核CAP基序并不保守，并且假定的结合腔除了一个外缺乏所有的特征性CAP腔四分体氨基酸残基（图2和4). SmVAL4的螺旋和股比所有其他报道的SCP/TAPS结构都短，并且缺少N端延伸（图2和3). SmVAL4具有独特的环路区域，包括带有终端螺旋的C端扩展环路（图2和3). SmVAL4的C末端环的形状与其他CAP蛋白（Asojo等。, 2011; Asojo，2011年). 虽然我们表明SmVAL4能够绑定脂质，电子密度图没有显示任何结合脂质的证据。

图2 SmVAL4的结构特征以及与选定的代表性CAP蛋白的初级序列比对。序列与ClustalW公司2和二级结构特征用SmVAL4和GLIPR2的坐标表示，使用电子脚本（痛风等。, 2003). 所示的不同二级结构元素包括α-螺旋线（标记的大波形符号α), 310-螺旋线（标记的小波形符号η),β-绞线（标有箭头β)以及β-圈数（标记为TT）。相同的残基在红色背景上以白色显示，保守的残基以黄色突出显示。参与二硫键的半胱氨酸残基的位置用绿色编号，标志性CRISP基序用红条识别。代表性CAP结构为NaASP2（PDB条目1个u53)，tablysin-15（PDB条目3个u3)，GAPR-1（PDB条目1兆字节)，sGLIPR1（PDB条目3平方英寸)和vCRISP（PDB条目1立方厘米9).

图3 SmVAL4结构与代表性CAP结构的比较。顶行显示SmVAL4（PDB条目）的功能区图第4页，共27页)，NaASP2（PDB条目1个53)，tablysin-15（PDB条目3个u3)，GAPR-1（PDB条目1兆字节)，sGLIPR1（PDB条目第2季度)和vCRISP（PDB条目1立方厘米9). 核心α–β–α三明治由三股绞合线构成β-标签螺旋之间的薄板。第二排是蛋白质的另一个视图，在该视图中可以看到中央空腔。第三行与第二行的观点相同，显示了这些CAP蛋白质电荷分布的差异，蓝色表示带正电荷的区域，红色表示带负电荷的区域。结构中靠近中心腔的电荷分布差异明显。锌2+与sGLIPR1复合并坐在中央空腔中，以洋红色显示。与tablysin-15结构结合的棕榈酸酯以黑色棒状物表示。

图4 CAP腔。(一)CAPs的重叠中央空腔揭示了与Zn相对应的关键残基2+-结合位点在典型CAP结构中叠加良好。CAP结构的颜色如下：SmVAL4，灰色；NaASP2，绿色；tablysin-15，蓝色；GAPR-1，黄色；sGLIPR1，品红色；vCRISP，青色。这些数字对应于GLIPR1和Zn的数字2+离子显示为红色球体。(b条)仅SmVAL4的同一区域和视图显示出缺乏协调Zn的His2+; 编号与SmVAL4的编号相对应。(c（c）)仅sGLIPR1的相同区域和视图；编号与sGLIPR1对应。

3.3. 甾醇结合研究

SmVAL4的结合能力甾醇通过在缺乏内源性CAP家族成员Pry1和Pry2的酵母突变体中表达该蛋白进行测试。酵母Pry蛋白结合胆固醇体外并且是将游离胆固醇和胆固醇乙酸酯输出到培养上清液中所需要的。测试SmVAL4的表达式是否撬1Δ 撬2Δ突变细胞挽救了胆固醇输出的缺陷，含有空质粒或SmVAL4质粒的血红素缺乏细胞被放射标记为[¹⁴C] -胆固醇过夜，在新鲜培养基中清洗和稀释，以允许胆固醇和胆固醇醋酸酯的出口。脂质从细胞颗粒（P）和培养上清液（S）中提取，并通过薄层色谱法（图5一). 通过放射扫描定量游离胆固醇和胆固醇醋酸酯的水平，并将细胞输出的胆固醇醋酸酯相对百分比绘制为输出指数（细胞外胆固醇醋酸酯与细胞内外胆固醇醋酸酯之和的比率；图5b条). 表达SmVAL4的细胞将高水平的胆固醇醋酸盐输出到培养上清液中，表明SmVAL5在功能上补充了Pry蛋白的缺失体内.确定SmVAL4是否能结合胆固醇体外，增加纯化蛋白（0-300pmol）的浓度[^三H] -胆固醇作为配体。通过吸附到阴离子交换基质将蛋白质从未结合配体中分离出来，并通过闪烁计数对结合放射性配体进行定量（图5c（c）). 这些实验揭示了放射性配体结合中的蛋白质浓度依赖性增加，这表明SmVAL4结合胆固醇体外此外，添加未标记的胆固醇（50和500 pmol）与放射配体结合竞争，表明氯酯结合是特异性的（图5天和5e（电子）). 这些结合研究的结果表明SmVAL4结合[^三H] -胆固醇浓度依赖性，放射性标记配体的结合可以通过与未标记胆固醇孵育来竞争。

图5 SmVAL4结合氯酯体内和体外. (一)SmVAL4的表达弥补了缺乏内源性CAP蛋白的酵母细胞的甾醇输出缺陷。含有空质粒或SmVAL4质粒的所示基因型的血红素缺乏细胞用放射标记[14C] -胆固醇过夜，在新鲜培养基中清洗和稀释，以允许胆固醇和胆固醇醋酸酯的出口。脂质从细胞颗粒（P）和培养上清液（S）中提取，并通过薄层色谱法。游离胆固醇（FC）、胆固醇乙酸酯（CA）和甾体的位置酯类（STE）显示在右侧。星号表示一种未知胆固醇衍生物的位置。(b条)缺乏内源性CAP蛋白的酵母细胞中乙酸胆固醇输出量的量化。出口指数表示细胞出口的醋酸胆固醇的相对百分比（细胞外醋酸胆固醇与细胞内外醋酸胆固醇之和的比值）。数据表示两个独立实验的平均值±SD。(c（c）)SmVAL4结合胆固醇体外通过增加纯化蛋白和50 pmol的量来评估甾醇结合[三H] -胆固醇作为配体。通过吸附到阴离子交换基质将蛋白质与未结合的配体分离，并通过闪烁计数对结合的放射性配体进行定量。(天)添加等摩尔量的未标记胆固醇（冷胆固醇）导致放射性标记配体（热胆固醇）的结合相应减少。(e（电子）)添加过量的未标记胆固醇会减少放射性标记配体的结合。纯化的SmVAL4（100 pmol）与200 pmol孵育[三H] -胆固醇作为配体（热胆固醇），其中放射性配体的结合与500 pmol未标记胆固醇（冷胆固醇）竞争。

4.1. SmVAL4是独一无二的，缺乏典型的CAP图案

使用的“结构相似性”选项确定了与SmVAL4最相似的结构PDB折叠(https://www.ebi.ac.uk/msd-srv/sm网站/)这使得三维结构线形能够同时考虑线形长度和r.m.s.d。与SmVAL4最相似的结构是带有Zn的sGliPR1²⁺（PDB条目第三季度; Asojo公司等。, 2011)这表明SmVAL4与人类CAP蛋白相比，与其他寄生虫的CAP蛋白更为相似。我们之前曾观察到钩虫GST的类似情况，与血吸虫同源物相比，钩虫GSTs在结构上更类似于人类GSTs（Asojo等。, 2007). NaASP2（PDB条目）的结构1个u53; Asojo公司等。, 2005)是第二个与SmVAL4最相似的CAP结构，其次是含有肌醇的人类GAPR-1（PDB条目4年; 范加伦等。, 2012)，GAPR-1 apo结构（PDB条目1兆字节; 塞拉诺等。, 2004)和pseudechetoxin（PDB进入第二天; 铃木等。, 2008)，然后通过17个蛇毒CRISP结构和表素-15（PDB条目3个u3; 徐等。, 2012). 这些代表性CAP的比对表明，最大的差异在于环区以及螺旋和股的长度。尽管SmVAL4是一种较短的CAP蛋白，但其螺旋比其他CAP蛋白长。SmVAL4还有一个额外的3₁₀-螺旋涉及α–β–α在任何其他代表性CAP蛋白结构中未观察到的三明治（图2和3).

与其他CAP或SCP/TAPS结构一样，SmVAL4具有一个较大的中央空腔（图3). CAP腔是在所有其他报道的SCP/TAPS蛋白质结构中观察到的暴露中央腔（Asojo，2011; Asojo公司等。, 2005, 2011; 吉布斯等。, 2008, ). 在许多SCP/TAPS结构中，CAP腔的特征通常是来自四个特征CAP基序CAP1、CAP2、CAP3和CAP4（Gibbs等。, 2008). PROSITE数据库中只定义了其中两个基序，即CAP1和CAP2(https://www.expasy.ch/文章). 有趣的是，SmVAL4的PROSITE扫描显示这些CAP基序都不保守。Gibbs和同事定义了另外两个CAP基序，他们的一致序列是HNxx个CAP3和CAP4基序的R和G（EQ）N（ILV）（吉布斯等。, 2008). SmVAL4中只存在CAP4基序，SmVAL5的CAP腔中除了一个外，其余都缺乏特征性CAP腔四元氨基酸残基（图2和4). 此外，没有与锌配位的组氨酸²⁺在拟定锌中²⁺和肝素硫酸盐依赖性炎症调节机制在眼镜蛇CRISP钠蛋白研究中的应用（Wang等。, 2010)在SmVAL4中保守（图2和4). 这些组氨酸的缺乏使SmVAL4不能与锌配位²⁺并暗示SmVAL4功能的不同潜在机制，与这些残基无关；事实上，在酵母CAP蛋白（Choudhary等。, 2014). 两种组氨酸的缺乏并不是SmVAL4独有的；另一种结构已知但不含组氨酸的CAP蛋白是tablysin-15（图2). 由于其他几种SmVAL保留了两种组氨酸（Chalmers等。, 2008). 此外，根据对第1组SmVAL序列和结构的比较，很明显，由于这些CAP结构中存在大量的环路和转弯区域，因此无法从SmVAL4的结构或其他代表性CAP结构的结构准确预测大多数其他SmVAL的结构（补充图S1¹). 此外，尚不清楚是否有SmVAL形成典型CAP四分体基序，未来的结构分析是必要的，以确定是否是这种情况。还不清楚许多SmVAL中的插入区域和附加末端区域是如何折叠的（补充图S1）。需要其他SmVAL的结构特征来回答这些问题。

4.2. SmVAL4和酵母CAP蛋白的进化保守固醇结合功能

在酿酒酵母基因组，Pry1-3和这些蛋白质是胆固醇醋酸酯转运所必需的（Choudhary&Schneiter，2012; 乔杜里等。, 2014). 序列比较表明，SmVAL4的CAP结构域与Pry3共有35%的序列同源性，与Pry1和Pry2共有28%的序列同源。Pry蛋白被证明是分泌的固醇结合蛋白（Choudhary&Schneiter，2012）)我们发现SmVAL4能够拯救缺乏内源性CAP蛋白Pry1和Pry2的酵母的固醇结合功能（图5). 虽然GAPR1和SmVAL4的结构已经解决，但Pry蛋白的结构尚不清楚。CAP域Pry1和Pry2与SmVAL4和GAPR1结构的基于结构的序列比对表明，保守残基分布在CAP域之外，也存在于结构变异的区域（图6一).

图6 卡维奥林结合图案。(一)在SmVAL4、GAPR1、Pry1和Pry2序列的比对中，保守的calveolin-binding基序（CBM）很明显。所示的二级结构元件适用于SmVAL4和GAPR1（PDB条目4aiw个). CBM的位置用蓝线标识，而CRISP1图案用红线表示。该图是使用生成的EsPript公司和ClustalW公司和结构元件标记如图2所示. (b条)SmVAL4（灰色）和GAPR1（青色）的重叠带状结构揭示了煤层气的构象灵活性（以棒状表示显示，并用蓝色箭头标识）。与GAPR1共结晶的六磷酸肌醇（IP6）以青色棒表示。(c（c）)叠合煤层气的特写显示了环的构象差异。

Schneiter小组最近的研究表明，Pry1包含一个钙化蛋白结合基序（CBM），该基序对这两种蛋白都很重要体内和体外通过Pry1（Choudhary）结合甾醇等。, 2014). CBM保存在CAP蛋白中，这些CAP蛋白与甾醇的输出有关体内和体外：Pry1、Pry2、GAPR1和SmVAL4（图6一). CBM位于一个具有几个极性氨基酸残基的柔性环区，能够与脂质。CBM回路在SmVAL4和GAPR1中具有不同的构象（图6b条和6c（c）)，两个结构中都没有甾醇靠近环路。可以想象，环能够呈现不同的构象，以允许不同的脂质。CBM环位于与GAPR1结构中观察到的报道的六磷酸肌醇（IP6）相反的面上（图6c（c）). SmVAL4缺乏典型的CRISP1基序，但仍能进行甾醇转运，这与突变研究一致，突变研究表明体内和体外通过Pry1（Choudhary）结合甾醇等。, 2014).

4.3。推测棕榈酸酯结合位点

SmVAL4的结合能力甾醇已由确认体内突变酵母细胞的甾醇输出，以及体外脂质结合研究。这些研究结果表明SmVAL4结合甾醇 体外以及体内此外，SmVAL4在缺乏内源性CAP功能的酵母细胞中的表达可恢复固醇输出的阻滞，SmVAL 4结合胆固醇体外作为将甾醇结合与结构相关联的工作的一部分，我们研究了CAP蛋白与类甾醇复合体的任何结构脂类已解决。之前曾报道过tablysin-15与棕榈酸酯复合物的结构，脂质结合在两个螺旋之间的一个空腔中，该空腔也被证明能结合白三烯（Xu等。, 2012). 在相应的α-SmVAL4结构中的螺旋1和4（图3和7). 参与tablysin-15结构中脂质结合的残基网络包括来自α-螺旋线1，His130来自α-螺旋线4和Trp59之间的挠性环α-螺旋线1和β-股1。tablysin-15中的Trp59相当于SmVAL4中的Trp 41，tablysin-16中的Lys46相当于SmVAL4中的Asp21，tablysin-15中的Val50相当于SmVAL4中的Cys25，而tablysin-14中的His130相当于SmAL4中的阿斯111。虽然残基在代表性CAPs中不保守，但等效螺旋之间有足够的空间以促进棕榈酸酯结合（图7). 这些分析表明，SmVAL4在结构上能够适应脂类例如棕榈酸酯，SmVAL4中的棕榈酸酯结合可能与观察到的tablysin-15类似。重要的是要指出，棕榈酸酯在与钙化蛋白结合基序不同的区域与tablysin-15结合，这表明至少有两个脂质结合区域。需要进一步的结构分析来确定脂类SmVAL4、Pry1和其他CAP蛋白。

图7 tablysin-15中的棕榈酸酯结合基序。(一)tablysin-15中棕榈酸酯的结合方式；色带显示为灰色，相互作用的残基和棕榈酸酯显示为灰色条。图中还显示了空腔中的表面电荷。(b条)表赖氨酸-15的侧翼结合区（以青色条带显示）与SmVAL4（以灰色显示）的叠加表明，SmVAL4可以具有与表赖氨酸-15相同的棕榈酸结合模式。