2.1、。方法概述

图1描述了筛选候选配体化合物数据库的方法具体地，使用自由原子来参数化指定的电子密度，并且基于生成的稀疏密度点的位置来计算一系列数学特征。将这些特征与为候选配体的每个构象计算的相同特征进行比较，并根据每个特征得分的加权和推导出排名。排名最高的化合物，依次以其最高的构象排列，受到短暂的真实空间的影响精炼在电子密度图中。最终排名基于相关系数在精制配体和电子密度之间。

图1 配体识别协议的示意图，所示为假定的N型ATP焦磷酸酶（PDB条目）结构中的三磷酸腺苷（ATP）3千克1; 福鲁哈尔等。, 2011)分辨率为2.3Å。(F类o个负极F类c（c）,αc（c）)差异密度图的等高线为1.0σ高于平均值；自由原子显示为球。已针对每个图像调整可视板的厚度，以提供最佳视图；然而，它在(b条)为了阐明蛋白质模型显示后感兴趣的电子密度(一).

2.2. 独特配体的选择

我们创建了晶体结构中常见的配体的大量数据集，包括内源性配体和MX常见实验程序中衍生的化合物。蛋白质数据库分析（PDB；Berman等。, 2000)2013年5月，共有超过15000个不同的配体实体。其中294个存在于至少40个不同的沉积构造中，因此被认为是常见的。由于我们关注的焦点是非共价结合配体，这些配体通常会在MX电子密度图中产生孤立的斑点，因此修饰的氨基酸，如磷酸丝氨酸（SEP）和O（运行）-硫-L（左）-酪氨酸（TYS）以及糖类未考虑参与翻译后糖基化。还排除了少于五个非H原子（主要是单原子离子）的配体实体。

对其余140种配体的仔细检查表明，其中许多配体彼此非常相似。例如，配体，例如腺苷-5′-三磷酸（ATP）、磷酸甲基膦酸-腺苷酸酯（ACP）和磷酸氨基膦酸酯（ANP）具有相同的亚结构（相对于其非H原子），并且仅在原子组成上不同。取代ATP中第二和第三磷酸盐之间的O原子的是ACP有一个C原子，而ANP则有一个N原子。只有在可以识别原子身份或氢键网络的非常高分辨率的图谱中，才能从这些配体的电子密度中识别这些配体，从而排除了通过本文所述方法进行区分的可能性。因此，将配体聚集在一起以减少这种亚结构冗余。基于小分子中原子间键模式的描述符，如广泛使用的BCUT描述符（对称矩阵的特征值，其中的术语表示原子间的键和键序；Burden，1989, 1997)，是构象不变的，非常适合这样的聚类任务。对所考虑的每个配体计算了这些特征。k个-平均数聚类，然后人工处理结果，得到82个大小不等的独特配体（硫酸盐、SO₄、咪唑、IMD）和100个非H原子（心磷脂、CDL），最多由8种不同配体组成。

2.3. 选择培训和测试数据集

下载了含有配体测试集中82种配体中至少一种配体的PDB中所有条目的实验结构和结构因子。仅使用X射线晶体学导出的结构，分辨率在1.0到2.5º之间，并存在于电子密度服务器（EDS；Kleywegt等。, 2004)使用了。MTZ数据文件使用成本加保险费、运费2MTZ公司来自的程序中央处理器4个套餐（优胜者等。, 2011).

为了减少密度图中沉积配体结构的“记忆”，对“apo”蛋白进行了重新定义。具体来说，所有配体和溶剂原子都从PDB文件中删除约束细化使用REFMAC公司（穆尔舒多夫等。, 2011).

根据相关系数根据沉积配体结构计算的图谱与之后获得的差异图谱之间REFMAC公司 精细化，其中施加0.75的阈值；相关系数使用中央处理器4个程序SFALL公司和覆盖层[例如，参见Muller（2013)或波扎尔斯基等。(2013)有关相关系数阈值的讨论]。这导致删除了三分之二的条目，突出了一些报告（Kleywegt，2007）中提到的许多PDB病例中配体电子密度的质量较差且解释不充分; 库珀等。, 2011; 利贝舒埃茨等。, 2012; 波扎尔斯基等。, 2013)并且为模型构建和验证带来了明显的困难。尽管如此，仍有1100多个不同的PDB条目可供使用。其中160个被放入了“培训组”精炼而剩下的970个条目用于后面描述的评估。

2.4. 参数化电子密度

差分电子密度以0.3º的间距计算，用户提供感兴趣的密度簇的近似位置。形状比较用最终网格的制备过程如下。

图2 对伪原子网格簇进行修剪，以便与配体特征进行特征比较。差异(F类o个负极F类c（c）,αc（c）)地图的等高线为2.5σ高于平均值。(一)放置的自由原子的密度值按降序排序，并计算相邻值之间的差异。绘制了密度差的标准偏差，仅输出密度高于标记点的原子。为PDB条目显示数据4英寸（李等。, 2010). (b条)输出原子（显示为球）将根据距离截止值进行进一步修剪，以生成最终的筛选形状，如十字所示。它与沉积的配体THP非常匹配。(c（c）)如中所示(一)但PDB沉积中的数据有三个簇3毫巴5（盖洛吉特等。, 2010)用箭头标记。(d日)第三个簇由箭头3标记，与最后一个配体SAM很匹配。

网格细化和聚类需要晶体对称性以便正确识别位于不同不对称单元之间正式边界的配体。

2.5. 数字特征描述符

以前使用形状和拓扑特征将分子碎片建模为晶体电子密度的经验突出了一系列可以使用的此类特征（兰格等。, 2012; Hattne&Lamzin，2008年, 2011; 赫斯等。, 2009).

共选择了22个特性供使用，并在表1中列出它们对配体的平移和旋转都是不变的，除原子数外，其他所有都对配体大小是不变的。仅连通矩阵的特征值（Burden，1989, 1997)当然，原子数是构象不变的；其他人都是依赖的。

表1 用于比较稀疏网格密度表示与多构象配体集的22个特征 功能类型 此类功能的数量 参考（如适用） 三阶矩不变量 11 洛登（1989）); Hattne&Lamzin（2008年) 手性指数 1 Hattne&Lamzin（2011年) 基于原子间距的特征 2 Crippen&Havel（1988年) 基于原子间连接性的特征 4 负担（1989, 1997) 原子坐标系欧氏距离的中心矩 三 塔巴奇尼克和菲德尔（1996）) 原子数 1

预先计算了82个配体中每个配体的所有构象（最多200个）的特征：总共约10000个条目。对密度簇中的稀疏网格进行形状比较（最多五个）σ阈值。自由原子之间的伪关联如兰格所述等。(2012). 排名是基于所有配体相对于所有稀疏网格的所有分数的合成。

由于这些特征是以不同的单位定义的，因此它们都是基于计算的值归一化为单位方差的，以描述训练集中的配体。这使得它们的方差-协方差矩阵成为一个方便的相关矩阵，其对角元素等于1，非对角元素的绝对值小于1。特征组合的初始权重是根据应用于训练集的每个特征所解释的方差范围设置的，根据经验公式计算，

哪里w个_我是特征的计算权重，米是五个最高值特征值，λ_j个是j个相关矩阵的特征值和u个是对应的特征向量。随后使用交叉熵方法对重量进行训练（Rubinstein&Kroese，2004)根据训练集中的数据计算出的特征，最大化82个候选配体中正确配体的等级。最佳稀疏网格是指与正确配体的最小最近邻根平方偏差（NNRMSD），如§3.1.

2.6. 小分子排列和真实空间精细化

除了训练外，在形状匹配之后，还需要配体与伪原子稀疏网格的构象灵活对齐，以便将识别的配体适当地放置到后续实际空间的映射中精炼以及基于真实空间相关系数进行排名。独立软件利加林是为了最小化配体和稀疏网格之间的最近邻距离而开发的。

配体的立体化学根据前面描述的坐标自动计算（Langer等。, 2012). 配体的三个主轴（以任意构象）在所有四种可能的组合中与网格的主轴对齐(+x个+年+z（z）, −x个负极年+z（z）, +x个负极年负极z（z）和−x个+年负极z（z）)每个都是独立考虑的。通过围绕键旋转实现对齐(即被认为可旋转的键以60°的增量随机旋转，以产生所有可能的构象，其中不会发生原子内碰撞），使用遗传算法（惠特利，1994年). 配体坐标是叠加在最近邻稀疏网格点上的最小二乘法。对于每个符合者，分数计算如下

哪里k个是最近邻对的数量d日_我是每对的最近邻距离。选择这样一个目标函数，以便在一个模型的原子在另一个模型中有两个相邻原子的情况下，第一个模型的偏移偏向于一个原子对的匹配，而使第二个相邻原子“未配对”。在算法的每个循环中，与最佳得分覆盖相关联的旋转被交叉，而精炼通过最大±10°晃动这些交叉的结果来实现构象的变化。

本质上，通过数据库进行基于形状的搜索时确定的最佳构造被以下内容取代利加林，根据数据库中的离散构象提供可能不可能（或不够准确）的更紧密匹配。利加林可以看作是一个初步的真实空间精炼通过围绕键的旋转，可以更好地匹配模拟密度而不是密度本身的网格。

将识别的配体放置在稀疏网格上后精炼如前所述（兰格等。, 2012). 这一步骤突出了与实际密度匹配的配体，而不仅仅是稀疏的网格。这个实空间相关系数计算密度图的配体区域。

3.1. 训练集中配体与稀疏网格子结构的匹配

早在1974年，就描述了“稀疏网格”结构的制备，以指示电子密度内潜在的候选原子位置（Koch，1974; Main&Hull，1978年; Isaacs&Agarwal，1985年)，并已由Zwart使用等。（2004年)由兰格详细阐述等。(2012)以模拟配体结构。至关重要的是，稀疏网格的构建是建立在对要构建的结构以及因此要放置的自由原子数量（或者，换句话说，稀疏网格簇的大小）的了解基础上的。空间电子密度的可能极限(即与目前的情况相比，低阈值下的相邻密度可能属于相邻配体或溶剂或是虚假的可能性要清楚得多，因为在目前的情况下，配体的性质及其大小、形状和构象都可以找到。

使用上述和图2中描述的方法，我们可以生成密度的伪原子表示，在训练集中，93%的病例的密度在实际配体的1.0°最近邻根平方偏差（NNRMSD）以内。

网格下部结构密度值的第一、第二和第三阈值导致了与真配体的最低NNRMSD（见图2c（c）)在几乎相同数量的情况下。只有一次，第五格是最好的。

配体中的原子数与所选网格点数量的比值变化很大，在0.25到1.7之间波动；分布类似高斯分布，平均值为0.8，标准偏差为0.3。我们注意到，这里我们并不像标签摆动法（Zwart）那样从稀疏网格构建配体等。, 2004). 稀疏网格仅包含允许使用形状描述符的自由原子数。正如NNRMSD值所示，网格子结构的整体形状往往与配体匹配良好，并且由于所使用的大多数特征都集中在身体的整体形状上，因此预计实体之间的数量差异将通过应用特征来克服。

基于电子密度值细微变化的网格细化概念与Langer提出的碎片树非常相似等。(2012)当密度与不同分子实体之间的相邻分子片段相邻时，在密度-簇体积与等容线-σ阈值的曲线中观察到特征性断裂。在这里描述的情况下，使用原子位置而不是密度体积，可以根据距离更准确地细化外部自由原子点，如图2所示(b条)和2(d日).

3.2、。依赖于训练集中的数据分辨率、配体大小和构象

进一步分析（图3)表明性能取决于数据的分辨率，但网格子结构对配体的NNRMSD在所有尺寸的配体中都是一致的。

图3 比较训练集计算的稀疏网格和PDB中存放的配体坐标之间的NNRMSD差异(一)各种分辨率和(b条)不同大小的配体。误差条描述了值在集合中的标准偏差。

我们目前的构象生成方法没有测试环系统的不同褶皱。因此，我们在数据库中包括了一些配体的多种构象，如表2所示所有测试的数据库包含96个不同的分子实体，代表82种不同的配体，每个配体有多达200种构象。

3.3. 功能比较的性能

使用上述训练集对特征进行加权，可以在32%的情况下选择正确的化合物作为顶级实体，而无需实际空间精炼以及密度的使用相关系数作为额外的过滤标准。我们注意到，在86%的病例中，正确的配体在基于特征的排名后的前十名中被确定，在94%的病例中排在前20名中。我们决定将排名前20的配体传递到最终的真实空间精炼步骤。

如引言所述与蛋白质或核苷酸建模相比，单独使用数学特征将配体与其密度匹配的成功率更有限。由于配体在化学和构象上相对于大分子及其碎片变化更大，因此必须假设捕获配体或密度形状各个方面的单一特征不足以进行构象依赖性配体识别。基于这些结果，我们得出结论，应该使用更全面地描述此类形状的特征组合。

尽管在上一段中进行了讨论，但根据（3）对检测到的重量进行分析，表明基于原子间距的特征特别适合于配体与其稀疏网格的匹配任务。三阶矩不变量也在合理程度上有助于匹配过程，基于原子间连接性的特征也是如此。后者是构象不变描述符，因此很好地补充了构象变异特征。值得注意的是，作为特征的配体椭球体的三个主要成分仅占表1中22个特征总贡献的0.1%这突出了三阶和高阶特征的重要性。

在（3）中歧视性权力，第页_（f），计算为所有特征的总和我这些特征的权重除以所有22个特征的权重之和(n个)功能。

3.4. 取决于数据的分辨率和评估集中配体的大小

将该方法整体应用于大型实验数据评估集表明，在61%的情况下，单独的特征匹配可以识别排名前20的化合物中的配体。实时空间精炼在这20名候选人中，有31%的人将正确的化合物添加到表格中，并由CC重新排名。如图4所示(一)，正确的化合物始终排名靠前。鉴于该方法是在低NNRMSD的正确构象中寻找正确的配体，我们得出结论，如果准备了适当的稀疏网格，从而可以通过特征比较进行识别，那么应用利加林真实空间遵循的程序精炼CC的排名非常有效。

图4 (一)真实空间后正确化合物的最终等级精炼CC对通过基于特征的配体选择的550种化合物进行排名。(b条)在这些配体之间传递到最终真实空间的不同分辨率数据的性能精炼步骤。(c（c）)不同大小配体在传递到最终真实空间的配体中的性能精炼步骤。

进一步强调这一点的是，性能非常依赖于数据的分辨率，就像稀疏网格构造一样。如图4所示(b条)当化合物进入最终阶段时，大约70%的配体可以在最高等级准确识别，数据分辨率在1.0到1.6°之间精炼步骤。大多数化合物的分辨率仍高于2.0º，但在较差的分辨率下性能会下降。其原因可能是基于自由原子的方法，即必须识别单个原子，特别是它们之间的间隙，以便根据原子间距离准确细化簇。该程序仍然显示分辨率高达2.5º的数据的实用程序。

如图4所示，性能受拟安装配体的大小影响较小(c（c）). 事实上，正如特威利格之前指出的那样，可能是配体的组成以及其典型密度在形状上是否独特对性能影响最大等。(2007).

3.5. 软件实施

开发的技术已在ARP协议/wARP7.4晶体模型构建软件包于2013年10月与中央处理器4 v.6.4.0。考虑到所有配体构象，软件中使用的最终数据库包含近10000个分子实体。配体识别可以通过在图形用户界面中简单地选择电子密度簇来直观地完成Arp导航器（兰格等。, 2013)并通过鼠标单击调用分析。由于配体数据库中使用了预先计算的数值特征，因此该程序可以快速执行。在台式工作站的单核上运行时，平均执行时间约为2.5分钟。执行后，顶级化合物将在密度范围内建模。与该配体簇合的化合物，如方法部分所述，也输出（例如，将特定的电子密度团簇归因于硫酸根离子，提供磷酸根离子作为替代溶液），从而能够根据可能的晶体含量考虑最合适的配体。因此，虽然筛选数据库仅包括82种配体，但该软件可以帮助识别多达140种不同的化合物。筛选的化合物列表见表2.