2.1. 蛋白质表达和纯化

从人类NLRP14 cDNA（GenBank登录号NM_176822.3）中扩增出NLRP14 PYD的编码区（残基Met1–Gln100），并克隆到pET-28a终止载体（Novagen）中，连接凝血酶可裂解的N末端His₆标签。通过Round-the-Horn定点突变引入突变（D86V和L84R）。序列验证的野生型和突变NLRP14 PYD质粒（Eurofins MWG Operon，Ebersberg，Germany）被转化为大肠杆菌BL21星形（DE3）细胞（Invitrogen）。细胞在37°C至OD的600 ml Luria培养基中生长₆₀₀0.8，然后用420µM（M）异丙基β-D类-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）。在25°C下5小时后，通过离心收集细胞，并将其重新悬浮在裂解缓冲液（50 m）中M（M）千赫₂人事军官₄pH值7.8，300米M（M）氯化钠，5米M（M）咪唑，10%甘油，0.1 mg ml⁻¹溶菌酶）并储存在−20°C。他的₆-通过离心澄清标记的含NLRP14 PYD的裂解物，并将其两次装载到800µl预平衡镍上²⁺–固定化金属亲和力用NTA树脂（Qiagen）色谱法。用清洗缓冲液I（20 m）连续清洗步骤后M（M）Tris pH 8.0，1M（M）氯化钠，10米M（M）咪唑），然后是洗涤缓冲液II（20 mM（M）Tris pH 8.0，1M（M）氯化钠，20米M（M）咪唑），通过凝血酶消化（Sigma–Aldrich）洗脱蛋白质。通过以下方法进一步纯化未标记的NLRP14 PYD尺寸排除色谱法（SEC）在凝胶过滤缓冲液（20 m）中使用Superdex 75 10/300凝胶过滤柱（GE Healthcare）M（M）Tris pH值8.0，150 mM（M）氯化钠，5米M（M）TCEP）。通过使用来自独角兽软件包（GE Healthcare）。含有单体蛋白质的组分通过离心蒸发进行混合和浓缩，以用于随后的结晶实验。硒代蛋氨酸（SeMet）标记的NLRP14 PYD在SeMet取代的最小培养基（分子尺寸）中表达，并在相同条件下纯化。

2.2。结晶和数据收集

SeMet标记的NLRP14-PYD和天然NLRP14-PYD突变体（D86V和L84R）在20°C下通过蒸汽扩散在坐液中结晶。通过混合等体积的蛋白质溶液（浓度为8.5 mg ml的1.0µl纯化NLRP14 PYD）获得SeMet标记的晶体⁻¹凝胶过滤缓冲液）和沉淀剂溶液（1.0µl 0.1M（M）HEPES pH值7.5，2.6M（M）硫酸铵，2%聚乙二醇400）。NLRP14 PYD D86V用0.2的沉淀剂溶液结晶M（M）氯化铯，2.2M（M）硫酸铵和NLRP14 PYD L84R用0.2结晶M（M）醋酸铵，2.2M（M）蛋白质浓度为5.7和8.5 mg ml的硫酸铵⁻¹分别是。7天后形成的晶体，并通过在LV CryoOil（MiTeGen）或3.4中的快速浴制备用于冷冻晶体学的晶体M（M）丙二酸钠，pH 7.0。闪速冷却晶体储存在液氮中。衍射数据收集在BESSY II电子储存环、柏林Helmholtz Zentrum für Materialinge und Energie的束线BL14.1和ESRF Grenoble（Gabadinho）的微焦点束线ID23-2上等。, 2010). 数据处理使用iMosflm公司v.7.0.6（巴提耶等。, 2011).

2.3. 阶段化和细化

NLRP14 PYD结构使用4W-MAD协议求解汽车里克肖（潘基卡尔等。, 2005). 准备并转换输入衍射数据以用于汽车里克肖使用来自的程序中央对手方清算所4套（协作计算项目，第4期，1994年; 优胜者等。, 2011).F类_A类使用以下公式计算值SHELXC公司（谢尔德里克，2008年, 2010). 根据对数据的初步分析下部结构测定和初始相计算限制在3.2℃。16个硒位点中有13个是使用SHELXD公司（Schneider&Sheldrick，2002年). 正确的手下部结构使用确定防抱死制动系统（郝，2004)以及SHELXE公司（谢尔德里克，2010年). 所有人的入住率下部结构原子被细化，初始相的计算使用MLPHARE公司（合作计算项目，第4期，1994年）). 双重的非晶体对称性使用找到（NCS）运算符RESOLVE（解决）（亚当斯等。, 2010). 密度修改、相位扩展和NCS平均使用DM公司（Cowtan，1994年). A部分α-螺旋模型是使用HELICAP公司（南等。, 2004). NLRP4 PYD（PDB条目4ewi公司; 埃布尔等。, 2012)用作进一步建模的模板。部分模型包含424个残基中的385个残基。模型构建的迭代周期和精炼使用库特（埃姆斯利和考坦，2004年)以及菲尼克斯（亚当斯等。, 2010)最终生成了一个模型对_晶体和对_自由的分别为0.205和0.261，分辨率为2.4º(对_自由的使用5%的反射进行计算，这些反射从细化中随机删除）。

NLRP14 PYD的D86V和L84R突变结构都通过分子置换使用相位器来自中央对手方清算所4套房（McCoy等。, 2007; 协作计算项目，第4期，1994年; 优胜者等。, 2011). 从Ser6到Pro67的野生型NLRP14 PYD对应于α-螺旋线1-4作为模型。因此，OMIT图的计算排除了有趣的α-螺旋5-6区域受到原子模型的偏压。最后，模型构建和精炼使用库特（埃姆斯利和考坦，2004年)以及菲尼克斯（亚当斯等。, 2010)导致NLRP14 PYD D86V模型对_晶体和对_自由的分辨率分别为0.216和0.268。分辨率为2.0Å的NLRP14 PYD L84R的最终模型被细化为对_晶体和对_自由的分别为0.182和0.222(对_自由的使用5%的反射进行计算，这些反射从细化中随机删除）。表1总结了数据收集、模型和细化统计野生型和突变型NLRP14 PYD。NLRP14 PYD的最终模型包括四个分子（链A类，Ser7–Ile95；链B类，Ser8–Gln100；链C类，Ser7–Asn96；链D类，Ser6–Ala99）。

表1 数据收集和精炼统计学 括号中的值表示最高分辨率箱。   NLRP14 PYD公司       λ1个MADSe λ2个MADSe λ3马德塞 λ4个MADSe NLRP14 PYD D86V NLRP14 PYD L84R型 数据收集  “空间”组 P（P）6三 P（P）6三 P（P）21212  单位-细胞参数（Ω，°） 一=b条= 89.61,c（c）= 107.90,α=β=90.0，γ= 120.0 一=b条= 89.21,c（c）= 106.60,α=β= 90.0,γ= 120.0 一= 51.35,b条= 62.55,c（c）=29.11，α=β=γ= 90.0  同步加速器，束线 BESSY II，PX14.1 BESSY II，PX14.1 ESRF，ID23-2型  波长（Ω） 0.97973 0.97626 1.00801 0.97985 0.91841 0.87260  分辨率（Ω） 53.93–2.60 (2.79–2.60) 44.86–2.54 (2.68–2.54) 44.90–2.63 (2.77–2.63) 41.42–2.55 (2.69–2.55) 44.60–3.00 (3.16–3.00) 39.69–1.99 (2.09–1.99)  镶嵌度（°） 0.37 0.60 0.80 0.80 0.58 1.36  反射次数 114721 (14803) 120880 (16105) 108426 (13333) 118067 (14559) 73663 (10800) 44825 (6289)  独特的反射 14400 (1868) 15450 (2155) 13998年（1797年） 15255 (1979) 9722 (1418) 6909 (988)  完整性（%） 94.7 (84.4) 94.9 (91.6) 94.5 (83.8) 95.0 (85.2) 100.0 (100) 100.0 (100.0)  多重性 8.0 (7.9) 7.8 (7.5) 7.7 (7.4) 7.7 (7.4) 7.6 (7.6) 6.5 (6.4)  平均值我/σ(我) 8.9（1.8） 9.4 (1.3) 9.3 (1.2) 9.8 (1.6) 9.7 (1.8) 9.5（3.2）  对测量 0.13 (1.26) 0.13 (1.96) 0.13 (1.84) 0.12 (1.35) 0.20 (1.53) 0.14 (0.67)  科科斯群岛1/2（高分辨率外壳） 0.63       0.49 0.72 模型和细化统计  分辨率范围（Ω） 44.81–2.60 44.61–3.00 39.69–1.99  反射次数（总计） 14374 9697 6879  反射次数（工作） 13652 9230 6551  完整性（%） 94.70 99.92 99.96  对工作 0.209 0.216 0.184  对自由的† 0.254 0.268 0.222  Ramachandran图（%）   受欢迎的 97.3 96.6 100   允许 100 100 100  立体化学参数   R.m.s.d.，粘结长度（Ω） 0.004 0.002 0.007   R.m.s.d.，粘结角（°） 0.802 0.811 1.029  威尔逊B类值（Å2) 60.73 67.61 22.14  ESU基于对自由的价值‡ 0.40 0.68 0.17  PDB代码 第4n1j页 4n1千 4n1升 †对自由的定义为对工作但按随机选择的总反射的5.0%计算，并从中删除精细化。 ESU是估计的总体协调误差（协作计算项目，第4期，1994年; 挠痒痒等。, 1998)

2.4. 蛋白质数据库登录代码

坐标和结构因子保存在蛋白质数据库（PDB）中。NLRP14 PYD与登录代码一起存放4个n1j，NLRP14 PYD D86V，带登录代码4n1千和NLRP14 PYD L84R，带登录代码4n1升。

2.5. 生物信息学分析

NLRP14 PYD与NLRP1–NLRP13 PYD的序列比对是用MultAlin公司（Corpet，1988年).PDB总和用于创建二级结构元素（拉斯科夫斯基，2009). 通过以下方法分析了NLRP14 PYD的二聚体界面和螺旋6的接触面积国际学生成绩评估（Krissinel&Henrick，2007）). 结构可视化和分析在PyMOL公司（薛定谔）。静电表面电位使用APBS公司插件PyMOL公司（贝克等。, 2001).

2.6. 蛋白质特性使用尺寸排除色谱法（美国证券交易委员会）和圆二色性（CD）

这个齐聚SEC在Superdex 75 10/300凝胶过滤柱（GE Healthcare）上研究了野生型NLRP14 PYD及其突变体的状态。根据制造商的协议，使用凝胶过滤缓冲液中的凝胶过滤校准试剂盒（GE Healthcare）校准SEC色谱柱。每种蛋白质700µl，浓度为1 mg ml⁻¹注入预平衡柱。超过5mM（M）凝胶过滤缓冲液中的TCEP用于消除NLRP14 PYD中唯一半胱氨酸（Cys88）之间的二硫键形成的高阶低聚物。

二级结构元件和热变性用CD光谱法测定NLRP14 PYD及其突变体。在20°C和0.1 mg ml蛋白质浓度下记录光谱⁻¹20米M（M）磷酸钠缓冲液pH 8.0，100 mM（M）氯化钠。CD光谱是使用JASCO J-815分光偏振仪（日本东京JASCO）内的0.1 cm路径长度试管收集的。热能变性在222 nm下以1°C的温度梯度（min）监测蛋白质的⁻¹温度为20至95°C。熔化温度(T型_米)从产生的乙状曲线的拐点计算。所有基线校正光谱均表示为平均剩余摩尔椭圆度[Θ]_{物料回收仓库}在给定波长或温度下。

2.7. 酵母双杂交分析

如前所述，使用Matchmaker GAL4 two hybrid System 3（Clontech）进行酵母双杂交试验。简言之，将NLRP14 PYD（残基Met1–Gln100）或NLRP14 BYD+Linker（残基Met1–Thr190）插入pGADT7，将ASC PYD插入pGBKT7融合载体，分别编码报告基因GAL-4 DNA结合域（BD）和激活域（AD）。这个酿酒酵母报告菌株Y2HGold（Clontech）与pGBKT7-ASC PYD（猎物蛋白). 在对照实验中，监测反向转化（pGADT7-ASC PYD和pGBKT7-NLRP14 PYD或pGBKT_7-NLRP14-PYD+Linker；补充图S4¹). 将转化的酵母细胞重新悬浮在无菌水中，并在SD/−Leu/−Trp脱落培养基上进行斑点，以评估转化效率。如图5所示，对采集的克隆进行稀释(c（c）)并点在SD/−Leu/−Trp和SD/−Ade/−His/−Leu/−Trp选择培养基上，以测试潜在的相互作用。将平板在30°C下培养4–5天。pGBKT7-ASC PYD和pGADT7-Aim2 PYD（残基Met1–Thr96）的共同转化作为阳性相互作用对照（Wagner等。, 2009). 为了排除假阳性相互作用，测试了所有融合构建体激活GAL-4报告基因转录的能力。

3.1. NLRP14 PYD采用开放的死亡域折叠，实现对称二聚

为了研究人类NLRP14 PYD的功能作用，我们开始结晶野生型蛋白。我们在几种不同的条件下成功地获得了衍射晶体。令人惊讶的是，衍射数据可初步分析的所有三种不同结晶条件均显示NLRP14 PYD的二聚体排列（图1一). 这个非对称单元由二聚体二聚化形成四聚体排列（补充图S1）。四种晶体学独立的NLRP14 PYD单体结构中的每一种都采用具有N端螺旋的典型吡啶结构域折叠α1–α5.吡啶结构域的特征，螺旋α3外露，仅包含两个螺旋匝（图1一). 相比之下，典型的C端α6螺旋线不是作为单独的二级结构元素出现的。相反，两个C端螺旋α5和α6结合形成一个延伸的干螺旋，我们称之为干螺旋α5/6. 在四个晶体学独立的NLRP14 PYD中的每一个中都发现了这种重新排序。是这样延伸的α调节NLRP14 PYD中二聚体界面的5/6干螺旋晶体结构。二聚体包含890Ω的广泛界面面积²。

图1 由一个扩展的介导的NLRP14 PYD的对称二聚化α5/6螺旋。(一)晶体结构野生型NRLP14的PYD沿着分子双轴（链A类粉红色；链B类浅灰色）；重要的疏水侧链Trp72、Leu76和Leu87以棒状表示，突出了它们对对称性的贡献α5/6A类–α5/6B类结合。(b条)晶体结构生理相关的D86V突变体（链A类品红；链B类深灰色）叠加在野生型NLRP14 PYD（链A类粉红色；链B类浅灰色）。此外，叠加了标准六螺旋束构象模型（青色），确定了Trp72、Leu76和Leu87的构象适应性作用，它们可以参与对称二聚化（扩展α5/6茎-螺旋构象）或稳定疏水核（典型闭合构象）。(c（c）)二聚体界面的放大图显示，各种疏水、极性和带电相互作用稳定了二聚体的界面。二聚体接触不限于α5/6A类–α5/6B类相互作用，如Arg90的单齿和双齿相互作用(α5/6B类)使用Glu21(α1A类)和Glu26(α2A类)分别是。

这个α-螺旋结构与已知的吡啶域组织非常一致。具体而言，螺旋α1含有Phe10–Glu21，α2 Lys24–Glu39，α3亮氨酸44–赖氨酸52和α4 Arg55–Tyr65。这个α5/6茎螺旋从Lys70延伸至Asn96。与其他吡啶结构域的比较表明，NLRP14-PYD和NLRP3-PYD具有最长的螺旋构象α三。

值得注意的是，吡啶结构域二聚体由对称排列形成，与之前描述的所有类型的同型死亡结构域二聚化基序形成对比，后者分为三大类（Park，2011). 这个α5/6介导的二聚体相互作用通过疏水基序与两种分子的Trp72、Leu76和Leu87结合而稳定（图1一和1c（c）). 重要的是，这三个残基参与了吡啶结构域典型疏水核的形成。这个高度保守的疏水核心用于稳定经典的六螺旋束，此外还涉及Leu15、Leu19、Leu22、Leu27、Phe30、Leu34、Leu58、Met62、Ala71、Phe79和Met82。因此，Trp72、Leu76和Leu87作为疏水性核心开关元件，可以参与二聚体稳定，如图所示晶体结构，或者，类比经典的吡啶结构域，形成六螺旋束（图1b条).

3.2. 生理性NLRP14 PYD D86V突变体采用类似于野生型蛋白的开放构象

这些发现促使我们研究D86V突变的潜在结构影响，该突变存在于生精功能衰竭的男性中（Westerveld等。, 2006). 为此，我们使D86V突变株结晶。这个晶体结构D86V突变株的基因类似地显示了二聚体排列（链A类洋红和链子B类深灰色），与野生型蛋白质（链）几乎无法分辨A类粉色和链子B类浅灰色）（图1b条). 因此，与野生型蛋白相比，NLRP14 PYD的临床D86V突变显然不影响其三维结构。

3.3. NLR PYD由作为构象调节元件的电荷桥进行分类

接下来，我们对不同的NLR吡啶结构域进行了序列和结构比较，以描绘开放性的结构基础对闭合构象。比较表明，由Glu26–Arg84–Asp86形成的电荷桥稳定了闭合的吡啶结构域构象（图2一和2b条). NLRP14 PYD在中心位置84处包含Leu，从而破坏电荷桥。为了测试所提出的电荷桥与吡啶结构域构象的相关性，我们引入了一个L84R突变体来重建稳定电荷桥。这个晶体结构这个L84R突变体确实揭示了封闭的吡啶结构域构象，与我们的预测非常一致（图2c（c）). Arg84引入的正电荷桥接了相反Glu26和Asp86的负电荷。这种结构进一步证实了疏水残基Trp72、Leu76和Leu87的适应性作用，它们有助于疏水核心，从而稳定螺旋α6。

图2 Glu–Arg–Asp电荷继电器作为NLRP构象调节元件。(一)所有14个NLR PYD的序列比对。二级结构元素α1–α图中显示了6个。保守的疏水核心残基以灰色突出显示。此外，溶剂暴露的疏水残基Trp72、Leu76和Leu87为洋红色。括号表示NLRP13特异性插入残基Leu41–Gln49。(b条)Glu26、Asp86和替代构象调控元件（CRE）M共识的特写82荷兰84或M82尼泊尔卢比84。Glu26和Asp86都是MNR基序电荷桥所必需的。(c（c）)晶体结构NLRP14 PYD L84R（青色）叠加在野生型NLRP14 BYD（粉色）上。L84R突变体采用闭合构象；突出显示了完好的充电桥。

用这个晶体结构我们已经确定了一种构象调控元件（CRE），它允许我们预测吡啶结构域采用闭合构象或开放构象的趋势。后者应与NLRP的吡啶介导二聚化倾向相关。NLRP2、NLRP3、NLRP4、NLRP9、NLRP11和NLRP12具有完整的电荷桥，从而稳定了闭合的六螺旋束结构（图2b条).

3.4. NLRP14 PYD主要存在于溶液中的单体和二聚体的平衡中

在下一步中，我们研究了NLRP14 PYD在溶液中的二聚行为。作为附带说明，我们应该指出Cys88不参与晶体结构。此外，所有实验都是在存在还原剂（5 m）的情况下进行的M（M）TCEP），防止半胱氨酸自发氧化。

凝胶过滤实验表明双峰分布对于野生型吡啶结构域，具有主要单体（保留体积为13.46 ml）和较小的二聚体部分（12.04 ml）（图3，粉色线）。我们之前关于电荷桥/CRE重要性的结构推导结论表明，L84R突变体应采用稳定的六螺旋束构象。我们一致发现L84R突变体作为单体独家迁移（保留体积为13.63 ml；图3，青色线）。最后，我们还测试了生理性D86V突变体。电荷桥系统与野生型蛋白质中的电荷桥系统类似被破坏，这表明该突变体可能经历二聚化所必需的构象转换。事实上，D86V突变体显示出与野生型蛋白非常相似的二聚化趋势（图3，灰色线）。然而，值得注意的是，D86V突变体显示出更高的聚集倾向，如明显的空洞峰所示。

图3 通过凝胶过滤色谱法探测NLRP14 PYD变体的单体-二聚体分布。野生型NLRP14 PYD（品红色）在12.04和13.46 ml洗脱，分别对应于二聚体（17%）和单体（83%）蛋白质。NLRP14 PYD D86V（灰色）洗脱液具有质量相似的轮廓（12.13 ml，24%；13.48毫升，76%）。相比之下，NLRP14 PYD L84R（青色）仅作为单体存在于溶液（13.63 ml）中。

我们从这些实验中得出结论，野生型NLRP14 PYD主要以单体的形式存在于溶液中，单体与二聚体的比率约为83:17%，根据色谱图峰面积（图3). 然而，重要的是，二聚体部分的寿命足够长，可以作为同质二聚体组分在凝胶过滤柱上迁移，保留体积非常精确地对应于二聚体（运行持续时间为～40分钟）。如果二聚体寿命较短，二聚体-单体交换时间在几秒或几分钟内，则与一个分子的时间平均大小相对应的保留体积变化要小得多，而不是观察到的双峰洗脱分布。在野生型NLRP14 PYD中观察到的二聚体-单体分布的时间依赖性表明，构象变化伴随单体-二聚体转变，与闭合（六螺旋束）和开放（延伸）一致α5/6螺旋）构象。

我们进一步询问，观察到的二聚体与单体组分的峰值比是否可以用质量作用定律来解释。因此，我们以五倍增加的蛋白质浓度（5 mg ml）重复凝胶过滤操作⁻¹)，随着蛋白质浓度的增加，遇到复合物的概率增加（数据未显示）。然而，重要的是，与在蛋白浓度为1 mg ml时进行的凝胶过滤相比，二聚体和单体部分的分布保持不变⁻¹显然，许多NLRP14 PYD遭遇复合体都没有生产力。我们的观察表明，NLRP14 PYD二聚体形成的限制因素是延伸的构象重排α5/6茎-螺旋。后者是产生遭遇复合物的先决条件，几乎不受蛋白质浓度的影响。

3.5. NLRP14 L84R突变体重建了电荷桥，极大地提高了其热稳定性

凝胶过滤实验表明，野生型NLRP14-PYD的单体形式可能存在于不同的构象状态。因此，我们着手比较研究善意的单体NLRP14 PYD L84R，具有单体形式的野生型蛋白质。为此，我们使用圆二色性（CD）光谱来测试溶液中两种变体的折叠状态。CD光谱学特别适合于测定α-蛋白质的螺旋含量。我们假设L84R突变体将完全采用六螺旋束构象，而野生型可能经历全开放和全封闭状态的极端过渡。重要的是α-螺旋含量在单体和二聚体状态下应几乎相同。根据晶体结构，这两种蛋白质的二级结构含量仅在螺旋之间的半螺旋转角处不同α5和α6（图1b条). 事实上，L84R变异体和野生型蛋白质的CD光谱几乎完全相同，表明这两种蛋白质的二级结构含量几乎相同（图4一).

图4 NLRP14 PYD变体的二级结构含量和热稳定性。(一)野生型NLRP14 PYD（粉红色）和NLRP14 BYD L84R（青色）显示出几乎相同的CD光谱，与几乎相同的α-开、闭构象中的螺旋含量。(b条)与野生型PYD相比，L84R突变体（青色）的热熔解曲线显著转移到更高的温度。这17°位移对应于L84R突变型和野生型NLRP14 PYD的熔化温度分别为82.6±1.3和65.6±0.5°C。(c（c）)灰色表面积约为490欧2疏水性接触区，从封闭的六螺旋束状态（对应于L84R突变）转变为（部分）延伸的α5/6螺旋构象（野生型蛋白质）。

给定结构分析（图1b条和2c（c）)我们进一步假设，单体蛋白质的热稳定性会随着从开放构象到闭合构象的转变而变化。因此，我们利用CD光谱进行了热熔炼实验。与野生型蛋白质（65.6℃）相比，六螺旋束结构（L84R）的热稳定性（82.6℃）显著提高（图4b条). 当考虑到两种蛋白质中三级螺旋的不同堆积时，这种+17°C的熔化温度差异才是合理的。因此，熔融温度的剧烈变化交叉验证了开放构象，如在晶体结构野生型PYD14（图1). L84R变体采用典型的死亡域折叠，所有六个螺旋都有助于稳定疏水核。相比之下，在野生型蛋白质中α6螺旋必须表现出一定的灵活性，并将采用部分或完全延伸的α5/6茎-螺旋构象。这个α因此，6螺旋界面将大部分裸露，导致疏水核心界面部分暴露（见图4c（c）). 在定量方面，标准六螺旋束形式（L84R）的疏水核为2435²而野生型蛋白质中相应的接触面积将减少约490μ²至1945年²,即稳定相互作用界面减少约20%。这可以通过部分暴露于野生型蛋白质和生理性D86V突变株中溶剂的灰色疏水区域来观察到(T型_米=57.7°C；图4c（c）). 我们得出结论，在单体野生型NLRP14 PYD中α6螺旋只与螺旋松散地相互作用α1和α疏水核心的5。这一观察结果与我们的晶体结构取样的二元构象空间一致（开放和闭合；图1b条). 然而，这些首选状态之间的转换将对构象中间体（半开）进行采样，尽管其占据程度尚不清楚（图1b条).

3.6. 静电表面电位二聚体NLRP14 PYD使D86V突变的相关性合理化

虽然工程化的L84R突变体表现出显著的特性，例如显著提高了热稳定性，这与严格的单体六-α-螺旋结构，自然发生的D86V突变体表现得非常像野生型蛋白质，尽管其具有严重的生理意义。这表明D86V突变的生理作用的机制基础应该与它与其他相关成分的相互作用有关，而不是与吡啶结构域内的内在变化有关。野生型和D86V吡啶结构域的结构比较表明，突变的影响将在蛋白质的二聚体状态下最大化，因为D86V突变非常靠近二聚体的双折叠对称轴，从而使电荷去除效应加倍（图5一). 静电势的计算证实了这一分析，静电势揭示了野生型二聚体蛋白的持续和广泛的酸性表面斑块。相比之下，D86V突变体的这个潜在界面中的负电荷显著减少。虽然NLRP14 PYD没有实验证实，但ASC被提议作为NLR PYD的衔接蛋白（利平什等。, 2003). 提议的ASC衔接蛋白确实在其吡啶模块上显示出一个明显的碱性表面补丁，该补丁与二聚体生成的酸性接触区相匹配（图5一和5b条). 手动对接显示静电转向ASC–（PYD）₂配合物形成空间互补配合物（图5b条). 具体而言，该理论对接模型将预测ASC的Arg41被源自NLRP14 PYD二聚体的两个Asp86残基螯合。尽管如此，我们强调，所提出的对接模型仅用于说明一种可能的机制，即D86V突变如何严重影响NLRP14 PYD与其他结合伙伴分子的相互作用，即使ASC最终不是NLRP14 CYD的生理结合伙伴。

图5 NLRP14 PYD和生理性D86V突变体的静电表面电位存在显著差异。(一)在NLRP14 PYD D86V中，野生型NLRP14 BYD中突出的广泛负电荷表面被疏水性斑块破坏。有趣的是，可能的相互作用伙伴ASC在Arg41周围呈现出适合相互作用的互补带电表面。(b条)NLRP14 PYD的2:1复杂模型（链A类和B类粉色和灰色）和ASC PYD（PDB条目1个ucp，蓝色）。介导相互作用的残基被标记为棒状物。这个假设模型说明了D86V突变如何影响NLRP14 PYD二聚体状态下的结合特性。(c（c）)NLRP14 PYD在1:1复合体中不与ASC PYD相互作用。NLRP14 PYD和较长结构的NLRP14 BYD+连接子与ASC共转化。SD/−Leu/−Trp板证实，转化对所有组合都有效。然而，SD/−Ade/−His/−Leu/−Trp板显示NLRP14 PYD和NLRP14 BYD+Linker均未与ASC PYD相互作用。相反，Aim2-PYD与ASC以1:1的复合体相互作用，从而证明实验装置有效。车道1、2、3和4表示1:1、1:10、1:100和1:1000的连续稀释。

该模型不仅通过D86V突变与ASC失去静电互补性来合理化其重要性（图5b条)及其聚集趋势（图3)但它也预测了二聚体NLRP14-PYD对ASC结合的必要性。我们进行了酵母双杂交筛选，以研究单体PYD是否能结合ASC（图5c（c），补充图S4）。阳性对照组明确显示ASC–AIM2相互作用，而NLRP14 PYD没有与ASC相互作用。当假设酵母表达的NLRP14 PYD是单体时，后一结果将与ASC–（PYD）的拟议化学计量比一致₂复杂。