1.简介
革兰氏阳性产孢厌氧菌艰难梭菌1935年Hall和O'Toole在新生儿粪便中发现,最初命名为艰难芽孢杆菌由于培养它的困难在体外(霍尔和奥图尔,1935年). 多种菌株艰难梭菌要么是休眠孢子形成型,要么是营养毒物产生型(Bartlett,2009一). 两种形式都会导致疾病;然而,孢子形成型对抗生素具有耐药性,而营养型对某些抗生素更敏感(Bartlett,2009b条).艰难梭菌1978年被确定为引起伪膜性结肠炎的病原体,其中包括630株强毒株,导致患者接触氟喹诺酮类或质子泵抑制剂后的发病率和死亡率(Carroll&Bartlett,2011).艰难梭菌是一种令人不安的医院细菌,已知它会污染医院空气、表面和人员,从而对免疫功能低下的患者构成巨大风险(Carroll&Bartlett,2011; 最佳等。, 2010). 抗药性艰难梭菌感染通常会导致爆发性腹泻,加剧细菌在医院和社区的传播(Burnham&Carroll,2013; 最佳等。, 2010; Bartlett,2009年一). 毒力和死亡率艰难梭菌感染呈上升趋势;因此,迫切需要新的疗法来对抗这种病原体(Burnham&Carroll,2013).
丙氨酸消旋酶(Alr;EC 5.1.1.1)是依赖5′-磷酸吡哆醇(PLP)进行催化的折叠型III超家族的典型成员(Jansonius,1998)). Alr催化可逆外消旋化属于L(左)-丙氨酸和D类-丙氨酸;后者是合成肽聚糖细菌细胞壁中的一层(Walsh,1989). 由于Alr在基本细菌过程中的作用以及在人类中缺乏同源功能,因此Alr已被广泛研究为抗菌药物开发的靶点(Silverman,1988). 遗传学研究已经证实细菌携带一个或两个丙氨酸消旋酶基因(阿尔和/或数据X). 这个阿尔基因编码组成性表达的生物合成酶,提供D类-丙氨酸对肽聚糖合成(Wasserman等。, 1983). 分解代谢数据X该基因主要存在于革兰氏阴性菌中,编码第二个丙氨酸外消旋酶同工酶高水平的L(左)-培养基中的丙氨酸(Strych等。, 2000). 这个数据X基因产品转化丰富L(左)-丙氨酸D类-丙氨酸,随后被代谢成丙酮酸并用作替代碳和能源(瓦瑟曼等。, 1983; 狂野等。, 1985). 只有一个阿尔基因已在艰难梭菌和其他只有一个基因组的细菌一样阿尔这个基因可能对艰难梭菌生长(Monot等。, 2011).
来自以下细菌的Alr的结构研究嗜热脂肪地芽孢杆菌(肖等。, 1997),左旋链霉菌(野田佳彦等。, 2004),铜绿假单胞菌(勒马盖雷斯等。, 2003),结核分枝杆菌(勒马盖雷斯等。, 2005),大肠杆菌(吴)等。, 2008),炭疽杆菌(金等。, 2008; 库尼亚戈等。, 2009),肺炎链球菌(进出口等。, 2011)和金黄色葡萄球菌(斯卡莱蒂等。, 2012)表明Alr是由两个单体首尾结合形成的同二聚体酶。每个单体由两个域组成:一个八级结构域α/βN端的桶和β-C端的股。二聚体包含两个活性位点,由一个单体的N端结构域和另一个单体的C端结构域结合而成。在每个活性位点中,PLP辅因子位于α/β桶,形成具有催化赖氨酸的希夫碱。Alr与底物类似物(Fenn)配合物的结构等。, 2003; 莫罗洛等。, 1999; 冲压件等。, 1998; 瓦塔纳贝等。, 2002)和酶的定点突变研究(渡边等。, 2002; 吉村渡边等。, 1999; 渡边黑川等。, 1999; Sun&Tony,1999年)已阐明反应机理并验证了活性位点残基的关键作用。总的来说,Alr利用一种逐步的双碱机制,其中活性位点上的两个高度保守的赖氨酸和酪氨酸残基作为酸/碱催化剂,承担着供体或提取α-基底中的氢。Alr与抑制剂的结构,如丙氨酸膦酸盐和D类-环丝氨酸,表明这些抑制剂共价结合到PLP辅因子(Fenn等。, 2003).
从一系列细菌物种中获得Alrs的结构信息对于设计可作为抗生素的抑制剂至关重要。虽然好氧厌氧菌和兼性厌氧菌中的Alr有很多结构,但到目前为止,对专性厌氧菌的同源酶知之甚少艰难梭菌因此,成功的提纯、结晶、,结构测定和动力学特征艰难梭菌本文介绍了来自高致病性和耐多药菌株630的丙氨酸消旋酶(CdAlr)。
2.材料和方法
2.1. 表达和纯化
氨基酸序列艰难梭菌菌株630 Alr(NCBI参考序列YP_001089983.1)被用作DNA表达结构的化学合成模板,编码385-氨基酸蛋白以及K271T位置处携带赖氨酸-苏氨酸替代物的点突变(GenScript USA Inc.,美国新泽西州皮斯卡塔韦)。这些合成结构经密码优化后在大肠杆菌并克隆到Xba公司我/Bgl公司pET-32a载体的II个位点(美国威斯康星州麦迪逊诺瓦根)。表达质粒转化为大肠杆菌通过热冲击应变Rosetta 2(pLysS)DE3。用T7启动子和T7终止引物(EMD Millipore,Rockland,Massachusetts,USA)通过菌落PCR鉴定阳性菌落。通过在含有50µg ml的10 ml LB培养基中培养单个菌落,对10个阳性克隆进行初始小规模表达筛选−1氨苄西林达到OD6000.7。通过添加最终浓度为0.5 m的IPTG诱导蛋白质表达M(M)在288K下持续16h。选择表达量最高的克隆进行大规模表达。通过离心收集细胞颗粒,悬浮在20 mM(M)使用蛋白酶抑制剂(罗氏)对pH值为7.5的溶液进行Tris,并使用法国压榨机进行溶解。裂解物通过离心澄清,然后通过阴离子交换进行Alr纯化色谱法(Q Sepharose Fast Flow,GE Healthcare)并在裂解缓冲液中用NaCl梯度洗脱。随后通过进一步净化尺寸排除色谱法(HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR),100米M(M)Tris pH值7.5,1 mM(M)PLP,1米M(M)TCEP。纯化的重组CdAlr的典型产量为15 mg,来自1.2 l培养物。考马斯染色SDS凝胶用于评估重组蛋白的纯度,重组蛋白被透析到储存缓冲液(50 m)中M(M)Tris pH值7.5,10 mM(M)PLP,1米M(M)DTT)并在−80°C下储存,直至使用。
2.2. 酶动力学
转换率L(左)-丙氨酸D类-如前所述,丙氨酸是通过HPLC测量两种对映体的量来测定的(Lee等。, 2013). 丙氨酸的动力学外消旋化在两个前锋(L(左)-丙氨酸D类-丙氨酸)和相反(D类-丙氨酸L(左)-确定重组野生型(CdAlr)的丙氨酸方向重量)和K271T突变体(CdAlrK271吨)酶。反应混合物包括L(左)-丙氨酸或D类-丙氨酸浓度范围(0.2、0.39、0.78、1.56、3.12、6.25、12.5、25和50 mM(M))50米M(M)硼酸钠缓冲液pH 8.5。反应是通过添加任一CdAlr而开始的重量(480 ng)或CdAlrK271吨(6纳克)。测定了每种成分的含量和反应时间通过优化研究。随着反应的进行,在总共4分钟内以0.5分钟的间隔去除等分样品,并用四体积的甲醇对反应进行淬火。这个L(左)-丙氨酸和D类-根据非对映体的差异稳定性分离甲醇提取物中的丙氨酸对映体通过使用Nucleosil Chiral-1色谱柱(德国Machery-Nagel)和含有0.5 m流动相的等比例HPLC(安捷伦1100化学站)M(M)流速为0.3 ml min的硫酸铜溶液−1333 KD类-总丙氨酸混合物中的丙氨酸产物根据HPLC图谱中的峰面积计算A类240纳米.生产速度L(左)-丙氨酸或D类-丙氨酸(mM(M) 最小值−1)根据底物浓度绘制,斜率用于Michaelis–Menten分析,以获得V(V)最大值和K(K)米(GraphPad棱镜6,GraphPad Software,美国加利福尼亚州拉霍拉)。这个k个猫是根据V(V)最大值[k个猫=V(V)最大值(米M(M) 最小值−1)/Alr浓度(mM(M))]. 结果显示为三个独立实验的平均值±SD。
2.3. 互补分析
对于互补分析,两个质粒,其中阿尔基因是由紫胶通过插入编码合成基因构建启动子艰难梭菌野生型Alr和K271T AlrXba公司I–囊pUC57载体的I位点。这个阿尔/数据X双重淘汰赛大肠杆菌菌株MB2159(Strych等。, 2001)通过电穿孔(Bio-Rad;25µF,200Ω和1.65kV)。在无外源性的LB培养基上选择转化子D类-丙氨酸。
SEC–MALS实验涉及将10µg的每个蛋白质样品加载到固定相由TSKgel Super SW mAb HTP柱(Tosoh Biosciences,King of Prussia,Pennsylvania,USA)组成,流速为0.25 ml min−1使用安捷伦1260 Infinity系列HPLC。流动相缓冲液为pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水。每项实验一式三份。探测器系统由一个紫外线探测器(安捷伦)和一个miniDAWN三角光散射探测器(怀亚特技术)组成,并串联一个Optilab rEX差动折射计(怀亚德技术)。折射计使用d提供蛋白质浓度的连续指数n个/d日c(c)0.185 ml mg的(折射指数增量)值−1牛血清白蛋白用作各向同性散射体,用于探测器归一化。由于蛋白质散射的光与其重量平均分子质量和浓度成正比,因此使用阿斯特拉6.0软件。
2.5. 结晶
纯化的重组野生型(CdAlr重量)和K271T突变体(CdAlrK271吨)蛋白质样品浓缩至32 mg ml−1在由10 m组成的缓冲器中M(M)PLP和1 mM(M)50 m内的TCEPM(M)设置水晶屏幕前,三重-盐酸pH值为8。使用汉普顿研究公司和齐亚根公司的商业稀疏矩阵筛选对这两种蛋白质的样品进行初始结晶筛选,包括经典I、经典II、Cryos、PEG和AmSO4通过坐滴中的蒸汽扩散,在293和298K下的套房和指数。通过将2µl蛋白质溶液与1.5µl储液罐溶液混合来制备滴剂。在两种温度下,使用高浓度聚乙二醇(PEG)可获得两种酶的大黄色板状晶体。这些晶体的尺寸通常为0.4×0.5×0.1 mm。CdAlr公司重量在0.2中获得晶体M(M)硫酸铵,0.1M(M)双三pH 6.5,25%(w个/v(v))PEG 3350。在不同的pH值和缓冲条件(Tris–HCl pH值8.5,DL公司-苹果酸pH 7.0、HEPES pH 7.5或双三pH 5.5)或使用不同的盐(氯化镁、甲酸钠、硫酸锂、氯化钠或溴化钾)。最大的CdAlr晶体K271吨从0.17获得M(M)硫酸锂,0.085M(M)Tris–HCl pH值8.5,25.5%(w个/v(v))聚乙二醇4000,20%(v(v)/v(v))甘油。CdAlr与环丝氨酸的共晶体环丝氨酸)在100米内获得M(M)环丝氨酸,200 mM(M)20%甲酸钠(w个/v(v))PEG 3350。在数据收集之前,所有晶体都是在结晶溶液中生长的,含量低于15%(v(v)/v(v))甘油在含有15%结晶溶液的低温保护缓冲液中培养约30s(v(v)/v(v))甘油。
2.6. 数据收集和结构确定
X射线衍射数据集是在贝勒医学院核心设施使用Rigaku HTC探测器和RigakuFR-E+SuperBright微焦点旋转阳极发生器(配备VariMax HF光学元件)收集的。使用CrystalClear公司(d*TREK公司)包(Pflugrath,1999). 数据处理使用iMosflm公司(Leslie,2006年; 巴蒂等。, 2011). 对于结构测定,数据收集自三个晶体。第一组数据是野生型酶与PLP辅因子(CdAlr)的复合物PLP公司). 第二个数据集是针对共晶含抑制剂环丝氨酸(CdAlr环丝氨酸)第三种是K271T突变酶与PLP复合物(CdAlrK271吨). CdAlrPLP公司和CdAlrK271吨晶体属于单斜晶系空间组 P(P)21。前者具有单元间参数一= 85.2,b条= 93.3,c(c)= 107 Å,α=γ= 90,β=91°,而后者具有晶胞参数一= 49.97,b条= 154.3,c(c)= 55.8 Å,α=γ= 90,β= 113°. CdAlr公司环丝氨酸晶体属于正交晶空间组 P(P)212121,带有单位-细胞参数一= 57.9,b条= 139.1,c(c)= 144.9 Å,α=β=γ= 90°. 尽管具有2.26º分辨率的可见反射,CdAlr环丝氨酸在高分辨率下,数据的完整性低于60%。由于晶体明显的衍射各向异性,试图收集更完整的数据只是增加了数据的冗余度,而没有增加完整性。根据Wlodawer及其同事的说法,当一个方向上的反射强度延伸到比其他方向更高的分辨率时,就会出现明显的衍射各向异性;自当代以来精炼程序可以有效地处理精炼在这种类型的数据中,在这种情况下最好的补救方法是使用所有弱的高分辨率数据,即最大可能反射次数(Wlodawer等。, 2013). 设置任意截止点以保持整体完整性大于80%,导致3.4º分辨率结构的信息量明显减少。此外,总体对合并由于数据集的多重性和对合并是相互依赖的变量(Wlodawer等。, 2013).
所有结构均由求解分子置换具有相位器(麦考伊等。, 2005; 斯托罗尼等。, 2004). 分子置换搜索模型是来自金黄色葡萄球菌(PDB条目4a3q公司)去除所有水和配体(Scaletti等。, 2012).分子替换随后是模型构建的迭代循环库特(埃姆斯利等。, 2010)和结构精炼具有REFMAC公司5(穆尔舒多夫等。, 2011)在中央对手方清算所4包(Winn等。, 2011). 在最初精炼阶段,非晶体对称性使用了(NCS)约束。此外,改进后的坐标受到PDB-重做(索兹曼·乔斯顿等。, 2009; 沃马克·乔斯顿等。, 2009; 尤斯登等。, 2012)为了优化模型,接下来要进行几个额外的手动构建周期,以修复失准错误以及之后引入的任何其他不适合的区域PDB重做.数据收集和细化统计如表1所示原子坐标和结构因子已作为条目保存在蛋白质数据库中40多个(CdAlrPLP公司),4卢伊(CdAlrK271吨)和40卢特(CdAlr环丝氨酸).
| CdAlr公司PLP公司(40多个) | CdAlr公司环丝氨酸(4卢特) | CdAlr公司K271吨(4卢伊) | 数据收集 | “空间”组 | P(P)21 | P(P)212121 | P(P)21 | 单位-细胞参数(Ω,°) | 一= 85.2,b条= 93.3,c(c)= 107,β= 91 | 一= 57.87,b条= 139.1,c(c)= 144.93 | 一= 49.97,b条= 154.33,c(c)= 55.77,β= 113 | 分辨率极限(Ω) | 54.5–2.10 (2.20–2.10) | 45.6–2.26 (2.33–2.26) | 34.2–2.60 (2.74–2.60) | 〈我/σ(我)〉 | 19.5 (4.9) | 8.7 (1.8) | 8.3 (1.9) | 观察次数 | 648855 | 204307 | 144493 | 独特反射次数 | 88688 (7550) | 35962 (2623) | 21924 (1477) | 多重性 | 7.5 (7.0) | 5.7 (5.5) | 6.2 (5.9) | 对合并†(%) | 6.0 (37.4) | 12.0 (82.7) | 13.6 (54.8) | 完整性(%) | 92.4 (52.9) | 64.8 (55.6) | 97.0 (90.1) | 平均镶嵌度(°) | 0.98 | 1.42 | 0.88 | 精炼 | 对晶体‡(%) | 20.0 (25.8) | 21.0 (30.2) | 18.4 (24.7) | 对自由的§(%) | 26.0 (30.5) | 24.7 (31.4) | 25.1 (35.5) | 相关系数 | | | | F类o个−F类c(c) | 0.953 | 0.939 | 0.948 | F类o个−F类c(c)(免费) | 0.927 | 0.915 | 0.892 | R.m.s.偏差 | 粘结长度(Ω) | 0.017 | 0.008 | 0.012 | 结合角(°) | 1.942 | 1.352 | 1.577 | 模型组成 | 蛋白质原子 | 11792 | 5945 | 6018 | 水原子 | 277 | 196 | 100 | 异质原子 | 111 | 44 | 32 | Ramachandran图(%) | 首选区域 | 96.4 | 95 | 96.5 | 允许的区域 | 2.9 | 4 | 2.6 | 异常值 | 0.7 | 1.1 | 0.92 | | †对合并=,其中我我(香港特别行政区)和〈我(香港特别行政区)〉是我用指数测量反射的平均强度香港特别行政区分别是。 ‡对晶体=,其中F类操作系统被观察到并且F类计算是计算出的结构系数振幅。 §该对自由的set使用5%的随机选择反射。 |
3.结果和讨论
3.1. 重组CdAlr功能活跃
纯化重组CdAlr的分析重量考马斯染色SDS凝胶和后续质谱法揭示了与全长蛋白质相对应的主要物种(分子量43 306)和分子量30 407和12 917的两个次要物种(图1一). 这两个小物种都与全长蛋白质紧密相互作用,不能被额外的蛋白质分开尺寸排除色谱法。随后的肽序列分析表明,小物种对应于氨基酸1–271和272–382,而这两种氨基酸肽类由271号位置处未知性质的断裂引起。为了防止这种分裂,将位置271处的赖氨酸突变为苏氨酸:K271T。选择Thr是因为来自金黄色葡萄球菌,结核分枝杆菌,炭疽杆菌和嗜热脂肪肝容易纯化和结晶的化合物在271位有一个Thr。通过SDS–PAGE评估,K271T单取代能够生产和纯化均质全长CdAlr蛋白(图1一)和质谱法(数据未显示)。
| 图1 重组CdAlr的生物和酶活性。(一)重组CdAlr的考马斯蓝染色还原SDS-PAGE凝胶重量和CdAlrK271吨阴离子交换后尺寸排除色谱法。箭头表示与单体蛋白质相对应的全长分子量43 303条带。箭头表示CdAlr中的解理产物重量和车道M(M)包含分子量标记(标记单位为kDa)。(b条)增长拯救D类-丙氨酸营养缺陷型质粒产生重组CdAlr重量和CdAlrK271吨.增长或缺乏大肠杆菌MB2159(标签a)和大肠杆菌用pUC57载体(标记为b)转化的MB2159,野生型艰难梭菌(标记为c)和艰难梭菌K271T突变体阿尔(标记d)在补充50µg ml的LB培养基上−1 D类-丙氨酸(+D类-丙氨酸)和LB培养基,不添加(−D类-丙氨酸)。(c(c))酶活性纯化重组CdAlr图重量和CdAlrK271吨. |
合成结构的生物活性和功能性通过评估其补充大肠杆菌 D类-丙氨酸营养不良。当转换为大肠杆菌alr/数据X突变体,编码野生型和K271T突变体CdAlr蛋白的质粒能够补充D类-丙氨酸营养不良和恢复其生长D类-丙氨酸缺乏培养基(图1b条),证明这两种重组蛋白都具有生物活性。
在确认其生物活性后,重组野生型(CdAlr)的外消旋酶活性重量)和K271T突变体(CdAlrK271吨)通过测试酶催化L(左)-丙氨酸和D类-丙氨酸。两种重组酶都具有催化活性(图1c(c)). 纯化CdAlr重量催化了L(左)-丙氨酸D类-丙氨酸在体外,带有K(K)米17.6米M(M)对于L(左)-丙氨酸和aV(V)最大值82.1单位mg−1在正向反应和aK(K)米共7米M(M)对于D类-丙氨酸和aV(V)最大值26.7单位mg−1在反向反应中。CdAlr公司K271吨有一个K(K)米13.8米M(M)对于L(左)-丙氨酸和aV(V)最大值4533单位mg−1在正向反应和aK(K)米5.4米M(M)对于D类-丙氨酸和aV(V)最大值1797单位mg−1在相反的反应中。CdAlr公司K271吨显著高于催化活性比CdAlr重量(表2). 赖氨酸-苏氨酸取代相对保守,因为两者都是极性残基和疏水残基,因此观察到较小(分子量114与146)不带电的氨基酸苏氨酸对催化活性对CdAlr的研究有些令人费解。如前所述,重组CdAlr重量和CdAlrK271吨蛋白质样品在前者中存在两个片段(图1一). 由于两个单体的头尾结合是形成Alr二聚活性位点所必需的,其中N端和C端残基对催化活性。此外,这些非活性物种可能与全长单体结合形成非活性或部分活性二聚体,这可以解释为什么不能通过尺寸排除色谱法以及样品的表观单分散性通过SEC–男性。因此,CdAlr重量该制剂可能含有由全长单体和截短单体组成的异质二聚体,这可能说明需要使用更多的CdAlr重量比CdAlrK271吨在酶分析中以及较低的催化活性。
| | L(左)-阿拉→D类-阿拉 | D类-阿拉→L(左)-阿拉 | 酶 | 单体MW | K(K)米(米M(M)) | V(V)最大值(单位:mg−1†) | k个猫(最小值−1) | K(K)米(米M(M)) | V(V)最大值(单位:mg−1) | k个猫(最小值−1) | CdAlr公司 | 43306 | 17.6 | 82.1 | 3558 | 7 | 26.7 | 1155 | CdAlr公司K271吨 | 43279 | 13.8 | 4533 | 196532 | 5.4 | 1797 | 77905 | GsAlr公司‡ | 43339 | 4.3 | 2550 | 尼泊尔卢比 | 2.7 | 1400 | 尼泊尔卢比 | 斯拉阿尔§ | 39888 | 0.4 | 尼泊尔卢比 | 3800 | 0.4 | 尼泊尔卢比 | 3300 | MtbAlr公司¶ | 40721 | 4 | 5.3 | 200 | 尼泊尔卢比 | 尼泊尔卢比 | 尼泊尔卢比 | MsmAlr公司¶ | 41053 | 8.5 | 1000 | 4300 | 尼泊尔卢比 | 尼泊尔卢比 | 尼泊尔卢比 | EcAlr公司†† | 41316 | 1 | 尼泊尔卢比 | 3239 | 0.3 | 尼泊尔卢比 | 347 | | †一个单位定义为每分钟外消旋1µmol底物的酶的量。 稻崎的数据等。(1986). §野田数据等。(2004). ¶来自Lee的数据等。(2013). ††来自Wu的数据等。(2008). |
CdAlr的催化活性重量和CdAlrK271吨与其他人报道的几个Alr同源物进行了比较。如表2所示,氯化镉K271吨似乎比CdAlr更活跃重量和来自嗜热脂肪肝,薰衣草,结核分枝杆菌和M.污点高出50倍至1000倍k个猫(表2). 据报道,具有高序列同源性的Alrs之间的催化活性存在显著差异(Strych等。, 2000). 我们之前报告称M.污点,与来自结核分枝杆菌,是20倍的活跃度(Lee等。, 2013). 这种变化的分子基础虽然仍不明确,但已归因于单体-二聚体平衡(Ju等。, 2011). 由于单体的缔合倾向增加,活性较高的亚型被认为主要以催化活性二聚体的形式存在,而活性较低的亚型,其单体缔合常数较低,主要是单体。因此催化活性CdAlr的K271吨可能是因为形成了几乎不解离的紧密二聚体。CdAlr中Lys271的生物学意义,而不是Alr同源物中通常在该位置发现的Thr,包括来自金黄色葡萄球菌,结核分枝杆菌,炭疽杆菌和嗜热脂肪肝,未知。观察到薰衣草同源物(PDB条目1英尺; 野田佳彦等。, 2004),具有类似的k个猫作为CdAlr,在相应位置有一个His。需要对各种Alr之间的单体缔合常数进行更详细的分析,以阐明催化活性的差异。还不清楚这种天然Alr是否来自细菌艰难梭菌经过与在大肠杆菌; 为了确定是否艰难梭菌利用这种机制调节厌氧生长期间的Alr活性。
3.3. CdAlr的总体结构
本文报道了CdAlr的三种晶体结构。第一个是酶与PLP辅因子(CdAlr)复合物的结构PLP公司). 第二个结构是共晶含抑制剂环丝氨酸(CdAlr环丝氨酸). 第三种结构是K271T突变酶与PLP(CdAlr)复合物的结构K271吨). 独特的是,CdAlrPLP公司 晶体结构是四聚体,而其他两种结构是二聚体。CdAlr公司PLP公司结构提供了最高的分辨率数据,但它也具有最高的无序水平,并且在结合腔和二聚体界面附近缺少几个残基。单体中的关键无序区域A类包括Lys258到Thr279的所有残留物;在单体中B类无序残基为Ser133–Gly139和Glu173–Glu177,而在单体中D类残基Gly197–Ile200是无序的。其中一些残基在其他Alr结构(Au等。, 2008; 库尼亚戈等。, 2009; 伊姆河等。, 2011; 斯卡莱蒂等。, 2012). CdAlr公司PLP公司四聚体是由两个几乎相同的二聚体组成的二聚物,二聚体的主链原子重叠的相对标准偏差为0.274º。每个二聚体在结构上与CdAlr的同型二聚体相似K271吨(一个二聚体的均方根误差为0.288º,另一个为0.361º)和CdAlr环丝氨酸(一个二聚体的相对标准偏差为0.397º,另一个为0.511º)。CdAlr的结构k271吨是最完整的结构,每个单体都有385个氨基酸中383个的主链和副链电子密度图,其中两个无序残基位于N末端。
CdAlr的拓扑结构K271吨被选择来描述整个酶的拓扑结构,因为它是最完整的结构。每个单体的二级结构约为25%股,26%α-螺旋,5%310-螺旋和44%的环和匝。有五个α/β-图案,四个β-发夹,四个β-凸起,四股,11α-螺旋,六个310-螺旋,13个螺旋-螺旋相互作用,25β-转了四圈γ-圈数(图3). 每个单体由两个域组成,一个是N末端的八标记α/β-桶状PLP结合域和C末端域,由短铰链区域连接(图4一). 同二聚体是CdAlr的最小功能单元,因为每个活性位点形成于一个单体的N末端结构域和第二个单体C末端结构域的界面。这两个单体在两个对称轴上形成紧密的界面(图4b条). 单体之间的相互作用界面为33872(66个氨基酸残基)。界面由31个氢键介导,相当于表面积的19%,与其他Alr类似(表3b条).
蛋白质 | 中的原子数αβC端域 | N端结构域中的原子数 | 铰链角度(°) | CdAlr公司 | 1917 | 1106 | 123.50 | EcAlr公司 | 1815 | 927 | 142.20 | GsAlr公司 | 1970 | 1098 | 123.22 | 斯拉阿尔 | 1809 | 1031 | 124.76 | 萨阿尔 | 1875 | 944 | 132.22 | BaAlr公司 | 1904 | 1119 | 123.34 | MtbAlr公司 | 1712 | 1001 | 136.16 | | 蛋白质 | 牛血清白蛋白(Å2) | MSA(奥兰多)2) | %英国标准协会 | NHB公司 | 国家统计局 | 国家气象局 | CdAlr公司K271吨 | 3387 | 17409 | 19 | 31 | 21 | 383 | CdAlr公司PLP公司 | 3210 | 17411 | 19 | 35 | 21 | 382 | 氯化镉铝环丝氨酸 | 2755 | 17435 | 16 | 30 | 17 | 375 | 斯拉阿尔 | 2741 | 16124 | 17 | 34 | 6 | 382 | GsAlr公司 | 3023 | 16499 | 19 | 46 | 18 | 382 | MtbLR公司 | 1934 | 15314 | 13 | 16 | 1 | 366 | 萨阿尔 | 2456 | 16494 | 15 | 28 | 14 | 356 | 巴阿尔 | 3572 | 16496 | 21 | 45 | 10 | 382 | EcAlr公司 | 2818 | 16116 | 18 | 40 | 29 | 381 | | |
| 图3 CdAlr与选定的代表性Alr的比较。代表性Alr的氨基酸序列比对显示了CdAlr和EcAlr的结构元素电子脚本3.0(古埃等。, 2003). 二级结构元件如下:α-螺旋线显示为标记的大线圈α, 310-螺旋线显示为标记的小线圈η,β-绞合线如标有的箭头所示β和β-匝被标记为TT。相同的残基显示在红色背景上,保守的残基显示在红色框中,保守的区域显示在蓝色框中。代表性的Alr是来自嗜热脂肪肝(GsAlr;PDB条目1个qk; 芬恩等。, 2005),炭疽杆菌(BaAlr;PDB条目3公顷1; 库尼亚戈等人。, 2009),薰衣草(SlaAlr;PDB条目1英尺; 野田佳彦等。, 2004),金黄色葡萄球菌(SaAlr;PDB条目4a3q公司; 斯卡莱蒂等。, 2012),结核分枝杆菌(MtbAlr;PDB条目1个fc; 勒马盖雷斯等。, 2005)和大肠杆菌(EcAlr;PDB条目2磅/加仑; 吴等。, 2008). |
| 图4 的结构艰难梭菌丙氨酸消旋酶。(一)的单体艰难梭菌丙氨酸消旋酶。功能区图α-橙色和β-绿色的线;与Lys39结合的PLP辅因子显示为洋红色条。(b条)CdAlr的二聚体K271吨一个单体以蓝色色带显示,另一个以绿色色带和表面表示。PLP加合物Llp39显示为品红棒。(c(c))CdAlr单体的叠加带状结构PLP公司(蓝色),CdAlrK271吨(灰色)和CdAlr环丝氨酸(橙色)。Llp39显示为洋红色条,DCS显示为蓝色条。 |
3.4. CdAlr的活性位点
所有三种CdAlr结构都在活性部位含有配体,在所有情况下配体都有明确的密度(图5一, 5b条和5c(c)). 两种结构(CdAlrK271吨和CdAlrPLP公司)包含辅因子PLP,而一个(CdAlr环丝氨酸)包含抑制剂环丝氨酸和PLP辅因子的共价加合物。CdAlr的每个活性位点K271吨和CdAlrPLP公司,PLP辅因子位于α/β-桶,与Lys39形成共价加合物通过内部醛亚胺连接,形成2-赖氨酸-(3-羟基-2-甲基-5-膦酰基氧基甲基-吡啶-4-基甲烷),Llp(图5一和5b条). 在丙氨酸消旋酶与PLP或底物类似物(Fenn等。, 2003; 莫罗洛等。, 1999; 冲压件等。, 1998; 瓦塔纳贝等。, 2002). 共价加合物Llp39与几个氨基酸残基形成氢键网络,包括Arg223、Ser208、Tyr356、Gly225、Ile226、Tyr43、Arg137和KCX130,后者是氨基甲酰化的Lys130(图5e(电子)).
| 图5 Alr活性位点。α2中辅因子PLP和活性位点残基的立体观察F类o个−F类c(c)1.2等高线的电子密度图σ的(一)CdAlr公司PLP公司(PDB条目40多个)和(b条)CdAlr公司K271吨(PDB条目4卢伊). (c(c))活性位点残基在a2中的拟合F类o个−F类c(c)2等高线的电子密度图σ对于CdAlr环丝氨酸(PDB条目40卢特). (d日)CdAlr活性中心重叠残基的立体观察K271吨(灰色)和CdAlr环丝氨酸(绿色)。DCS是环丝氨酸和PLP的共价加合物,用洋红表示,KCX为N个-6-羧基-L(左)-赖氨酸。(e(电子),(f))活性部位相互作用示意图(e(电子))CdAlr公司K271吨和((f))CdAlr公司环丝氨酸。交互图形是使用生成的Lig图+v.1.4.5(拉斯科夫斯基和斯温德尔出版社,2011年). |
尽管在活性位点附近存在构象差异,但CdAlr活性位点中的这些关键残基在其他Alr(渡边等。, 2002; 吉村渡边等。, 1999; 渡边黑川等。, 1999; Sun&Tony,1999年)表明了类似的反应机制。一般来说,Alrs使用逐步双碱基机制,其中两个高度保守的活性位点残基,赖氨酸(Lys39)和酪氨酸(Tyr268)作为酸/碱催化剂,提供或提取α-基板上的H原子(渡边等。, 2002). 在CdAlr中环丝氨酸环丝氨酸与PLP形成共价加合物,D类-吡哆醇-N个,O(运行)-环糊精-5-单磷酸(DCS)。共价加合物的形成阻止了在CdAlr中观察到的与Lys39的共价相互作用PLP公司结构(图5). CdAlr中保留了几个氢键环丝氨酸和CdAlrK271吨(CdAlrPLP公司)结构,特别是Tyr43、Ile226、Gly225和Tyr356之间的结构。Tyr268和DCS之间形成了CdAlr中不存在的额外氢键PLP公司和CdAlrK271吨结构(图5e(电子)和5(f)).
通向活性位点的是底物入口,它由保守的残基组成,这些残基被认为是药物设计的潜在靶点(LeMagueres等。, 2005; 吴等。, 2008). 与其他Alr的情况一样,衬底入口通道中的残留物来自两个单体,包括穿过二聚体界面的残留品(图6一). 两个单体有助于底物入口通道。一个单体提供关键残基Asp172、Tyr356、Thr353、Ser234、Pro233和Ile354,而另一个穿过二聚体界面的单体将Lys/Thr271、Arg312、Arg293和Tyr287提供给入口通道(图6一). Lys271位于活性位点底物入口通道的一个环上,此前已经证明该区域的突变影响EcAlr(Wu等。, 2008). 有趣的是,EcAlr底物入口通道中的残基与CdAlr的残基重叠得很好,并且保存得很好(图6b条). K271T突变导致更开放、更容易进入(图6一),这可能有助于观察到的活性增加。
| 图6 基板入口通道。(一)CdAlr衬底入口的立体视图K271吨与CdAlr叠加环丝氨酸. (b条)CdAlr基板入口通道的相同立体视图K271吨与EcAlr的重叠。在两幅图中,CdAlr单体的残留物K271吨以粉红色显示,而来自第二单体的残留物以蓝色显示,来自CdAlr的Lys271重量以黄色显示。EcAlr中相应的残留物分别为绿色和海蓝宝石色。所示透明表面和带状图为CdAlrk271吨。 |
3.5. 与其他丙氨酸消旋酶结构的比较
使用中的“结构相似性”选项确定与CdAlr最相似的结构PDF折叠(https://www.ebi.ac.uk/msd-srv/sm网站/). 识别类似结构的标准包括所有主链原子排列的r.m.s.d.、排列长度和间隙数。虽然它与CdAlr只有37%的序列同源性晶体结构的嗜热脂肪肝(GsAlr)Y265F突变丙氨酸消旋酶与环丝氨酸复合物(PDB进入1个qk; 芬恩等。, 2005)与CdAlr结构具有最大的整体三维结构对齐。GsAlr的其他复合物和突变体在结构相似性方面也排名较高。相应的PDB条目为1l6克(渡边等。, 2002),1个epv(芬恩等。, 2003)和每秒2帧(芬恩等。, 2003). 其他具有显著结构相似性的蛋白质包括炭疽杆菌同源(PDB条目3公顷1; 库尼亚戈等。, 2009)以及金黄色葡萄球菌同源(PDB条目4a3q公司; 斯卡莱蒂等。, 2012). 这些Alr与CdAlr具有约37%的序列同源性。尽管观察到CdAlr的螺旋、链和环比许多其他Alr更长,但所有这些结构的单体都叠合良好,并具有用于将所有主链原子从1.45到1.62 Au对准三种CdAlr结构的r.m.s.d.s。
所有报道的Alr结构的N端和C端域都由一个短铰区连接,之前的研究表明Alr的N端与C端之间的铰角不同(LeMagueres等。, 2003; 伊姆河等。, 2011). 为了比较CdAlr和具有代表性的Alr的铰链角,使用Peter Sun的applet计算铰链角铰链(https://exon.niaid.nih.gov/sis/hinge_file.html). CdAlr的计算铰链角为123.50°,与BaAlr(123.34°)和GsAlr(123.22°)的铰链角相当。SlaAlr(124.76°)的铰链角略大于CdAlr,而SaAlr(132.22°)、MtbAlr(136.16°)和EcAlr(142.20°)的铰接角更大(表3一). 铰链角的大小和每个畴中的原子数之间似乎没有任何相关性。此外,铰链角度大小和催化活性(表2和3一).
尽管氨基酸残基的数量相似,但CdAlr的单体表面积比许多其他Alr大(表3b条). 所有Alr中差异最大的区域位于N端和C端环以及靠近二聚体界面和活性位点(Au)的环区域等。, 2008; 库尼亚戈等。, 2009; 卡诺迪亚等。, 2009; 伊姆河等。, 2011; 斯卡莱蒂等。, 2012). 二聚体界面的这些变化导致了不同Alr的埋藏表面积的差异(表3). 二聚体埋藏表面积的大小与Alr酶的活性无关,这是根据相互转化的能力来测量的L(左)-丙氨酸D类-丙氨酸(表2和3b条).