2.1. 蛋白质表达和纯化

如前所述，全长hPrp28过度表达、纯化和磷酸化（Mathew等。2008年). 编码hPrp28的cDNA片段ΔN（残基338–820）被克隆到载体pGEX-6P3中。GST融合重组蛋白在大肠杆菌18°C下的BL21星形（DE3）电池。使用流化器（微流体）在50米处破坏细胞M（M）Tris–HCl pH值7.5，2M（M）氯化锂，5%(v（v）/v（v）)甘油，2米M（M） β-巯基乙醇。蛋白质在4°C的谷胱甘肽Sepharose柱上纯化[在50 m内M（M）Tris–HCl pH值7.5500 mM（M）氯化钠，5%(v（v）/v（v）)甘油，2米M（M） β-巯基乙醇]，然后用PreScission蛋白酶裂解GST标签。使用Superdex 75凝胶过滤柱进行进一步纯化，然后使用谷胱甘肽Sepharose柱去除残留的GST。将蛋白质浓缩至15 mg ml⁻¹10米M（M）Tris–HCl pH值7.5，150 mM（M）氯化钠，2米M（M） β-巯基乙醇。

2.2. 核苷酸结合常数的测定

ADP和ATP的平衡离解常数用mant-labeled荧光滴定法测定核苷酸。每个反应由4µ组成M（M）hPrp28ΔN蛋白、mant-ADP或mant-ATP在1到400µ之间M（M），10米M（M）HEPES–NaOH pH 7.5，150 mM（M）氯化钠，10米M（M）氯化镁₂和1米M（M）DTT公司。在测量之前，将样品在25°C下培养45分钟，以达到平衡状态。使用荧光-3分光荧光计（Horiba Jobin Yvon）测量荧光，其激发波长为295 nm，并以每秒计数（cps）的形式记录330 nm处色氨酸的发射，积分时间为0.5 s。对每个样品分别进行三次测量。测量值已针对内滤波效应（鸟巢等。, 1983)和K（K）_d日通过对Michaelis–Menten方程的非线性回归计算，使用Sigma图.

2.3. ATP水解速率的测定

为了分析纯化的hPrp28的ATP酶活性，应用了基于HPLC的活性测定。浓度为1 mg ml的纯化hPrp28⁻¹在由20 m组成的缓冲器中M（M）Tris–HCl pH 7.5，300米M（M）氯化钠，5米M（M）氯化镁₂，1米M（M）DTT与0.5 m孵育M（M）存在或不存在5µgµl的ATP⁻¹酵母RNA III型在37°C下保持9小时。制备不含hPrp28的反应混合物作为对照。在不同的时间点采集样品，并通过在85°C下培养2分钟来停止反应。通过离心（14000克，5 min，4°C），并将上清液加载到反相HPLC柱（Prontosil C18-AQ，Bischoff色谱法，德国），在100 m的缓冲区内平衡M（M）K（K）₂高性能操作₄/千赫₂人事军官₄pH 6.5。ATP和ADP的洗脱在254nm处通过紫外吸收进行监测，商用ATP和ADP作为色谱柱校准的参考。整合ATP和ADP峰面积，并减去不含蛋白质的样品值，以校正ATP的背景水解。水解ATP的量通过以下方程式确定：水解ATP百分比=100%×面积_ADP公司/（面积_{列车自动防护系统}+面积_ADP公司).

2.4. ATP-hPrp28紫外线交联

在剪接条件下培养总体积为50µl的纯化His-tagged hPrp28（30 pmol）（60%核提取物，20 mM（M）磷酸肌酸，3米M（M）氯化镁₂，10牛顿M（M）具有30µCi的MINX前mRNAα³²P ATP；比放射性3000 Ci毫摩尔⁻¹)在30°C下保持15分钟。孵育后，将样品转移到冰上，并使用Sylvania G8T5杀菌紫外线灯在2 cm距离处交联5 min。然后用抗-His抗体（Qiagen）免疫沉淀交联蛋白。对于免疫沉淀，将4µg抗-His抗体与20µl蛋白A Sepharose偶联。交联样品和200µl IPP₅₀₀缓冲器（20 mM（M）Tris–HCl pH值8.0，500 mM（M）将氯化钠（0.1%Triton X-100）添加到洗涤珠中，并在4°C下从反应中沉淀hPrp28 2 h。随后用1ml IPP清洗珠子三次₅₀₀沉淀蛋白在蛋白负载缓冲液中煮沸提取。提取后，用10%SDS-PAGE分离蛋白质。凝胶呈银染，通过放射自显影术检测到交联蛋白。在没有核提取物的情况下，将30 pmol纯化蛋白（总反应体积50µl）培养在75 mM（M）KCl，50米M（M）Tris–HCl pH值8.0，1.5 mM（M）氯化镁₂，1.25米M（M）存在或不存在0.6µgµl的DTT⁻¹聚美。

2.5. 结晶和衍生化

在由2.2组成的条件下，通过坐滴蒸汽扩散在20°C下生长晶体M（M）20%硫酸铵(v（v）/v（v）)甘油，0.1M（M）通过将1µl蛋白质溶液与1µl储液罐溶液混合，使CAPS pH值达到9.0。对于晶体浸泡，5 mM（M）将苯甲酰乙酸汞溶解在相同的缓冲液中，并将晶体在20°C下培养7 d。

2.6. 数据收集和处理

在HZB/BESSY II（米勒）的光束线14.1上，在100 K的温度下获得了异常的X射线衍射数据等。, 2012)配备MAR Mosaic 225毫米CCD。单汞衍生物晶体的衍射数据收集于两个波长：汞边缘的峰值（1.00858μl）和低能远程（1.01212μl）。振荡照片使用MOSFLM公司（巴蒂等。, 2011)用于低能耗远程数据和扩展数据集（卡布施，2010年一)用于峰值数据。衍射数据与SCALA公司来自中央对手方清算所4套房（优胜者等。, 2011)和XSCALE公司（卡布施，2010年b条)分别是。

2.7. 结构解决和细化

SAD分阶段使用夏普/自动SHARP（冯海因等。, 2007)雇佣SHELXD公司（Schneider&Sheldrick，2002年)对于重原子下部结构位置和所罗门群岛（亚伯拉罕和莱斯利，1996年)对于密度修改，生成了具有清晰蛋白质-溶剂边界的可解释图。残基Cys543处的单个重原子位置显示出位置紊乱，精细占有率为0.47和0.33（补充图S1¹). 通过拟合DEAD-box蛋白Vasa（PDB条目）已知结构的片段进行模型构建2分贝3; 倦石等。, 2006)然后使用库特（埃姆斯利等。, 2010). 初始模型根据2.0º分辨率的低能远程数据进行了改进中枢神经系统（布伦格，2007年)采用慢冷却SA动力学。为了模拟域的各向异性位移精炼步骤在中执行菲尼克斯（亚当斯等。, 2010)含有四个TLS基团，并导致结晶R（右）和R（右）_自由的值分别为0.193和0.218。最终的hPrp28ΔN模型由残基352–806、五个硫酸根离子、两个甘油分子、3-环己基-1-丙基磺酸、一个无序汞原子和220个溶剂分子组成。缺失残基，即N末端残基338–351、环695–702和724–727以及C末端残基807–820，是由不可解释的电子密度造成的，很可能是无序的。根据以下判断，改进后的模型具有良好的几何结构RAMPAGE公司（98.7%的残留在有利区域，1.4%在允许区域）。使用DALI公司（霍尔姆等。, 2008). hPrp28ΔN结构的原子坐标已保存在蛋白质数据库（PDB条目4nho公司).

3.1. hPrp28的ADP/ATP结合特性ΔN个

全长hPrp28和N端截断的hPrp28-变体（hPrp18ΔN） 对包含整个解旋酶结构域的基因进行了克隆、过表达和纯化。包含磷酸化RS-domain和hPrp28的全长hPrp18ΔN没有表现出显著的ATP酶活性，周转量为8.3×10⁻⁵ 秒⁻¹在hPrp28的情况下ΔN、 这就提出了一个问题，即ATP是否不能与hPrp28结合，或者ATP是否结合但不能被hPrp18水解。因此，我们分析了ADP和ATP与hPrp28的结合Δ分别使用mant ADP和mant ATP的荧光光谱法测定N（图1一和1b条). ADP与hPrp28结合Δ具有离解常数的N(K（K）_d日)22.4±2.4µM（M），与其他DEAD-box蛋白相当。对于浓度高达400µ的ATP，未观察到与ATP的相互作用M（M），表示K（K）_d日对于？400µ的ATPM（M）。该值与K（K）_d日其他DEAD-box蛋白质的ATP值，通常在70µ之间M（M）和>6 mM（M）（Lorsch&Herschlag，1998年; 曹等。, 2011; 海恩等。, 2008; 卡洛等。, 2007; 希尔伯特等。, 2011). 由于荧光核苷结合分析的局限性内部过滤效应，ATP浓度高于400µM（M）不可行。

图1 hPrp28的腺苷核苷酸结合测定(一,b条)使用mant-ADP或mant-ATP进行荧光滴定(c（c）)紫外线诱导交联α-32P标记ATP。(一,b条)校正荧光信号的差异与ADP/ATP浓度相对应，并符合Michaelis–Menten方程。对于mant-ADPK（K）d日22.4±2.4µM（M）计算，而在mant-ATP曲线拟合不可能的情况下。(c（c）)紫外线诱导交联α-32P ATP至纯化的hPrp28。30 pmol纯化的hPrp28在无核提取物（Nxt；1–2道）、无（1道）或（2道）多聚-U（0.6µgµl）的情况下培养−1)或者在剪接条件下，在没有MINX前mRNA（第3车道）或存在MINX后mRNA的情况下，存在核提取物（第3-6车道）（参见§2） 并受到紫外线照射。交联后，用抗-His抗体免疫沉淀hPrp28。将沉淀物加载到10%SDS–PAGE上，并通过放射自显影术检测放射性hPrp28（交联到ATP）。在没有紫外线照射的情况下，还检测了ATP与hPrp28的交叉链接（第5道）。作为免疫沉淀的对照，在没有纯化hPrp28的情况下进行反应（第6道）。

3.2. hPrp28结合剪接体中的ATP

由于先前对yPrp28保守序列基序的突变研究表明，Prp28的ATP酶活性对剪接反应是必要的（Chang等。, 1997; Staley&Guthrie，1999年)，我们分析了ATP与全长hPRp28的结合在体外通过紫外线诱导交联的拼接条件α³²P标记ATP。在含有所有剪接体蛋白和snRNP的核提取物存在的情况下，分离的hPrp28和hPrp28都不能与ATP交联。然而，在核提取物和前mRNA存在的情况下，即在剪接体形成的条件下，ATP与hPrp28交联（图1c（c）). 这表明Prp28只有当它是组装在内含子前mRNA上的剪接体复合体的一部分时才能与ATP结合α³²在本实验中使用了P标记的ATP，还可以检测到源自ATP水解的交联ADP。然而，在缺乏前mRNA的情况下，没有核苷酸与hPrp28交联，这表明存在前mRNA时的信号确实来自结合ATP。

3.3.结构确定hPrp28的ΔN个

为了理解hPrp28自由形式缺乏ATP-结合活性的结构基础，我们着手确定晶体结构hPrp28。所有结晶全长hPrp28的尝试都失败了，这可能是由于N末端RS-like结构域，该结构域被预测为内在无序（Korneta等。, 2012). hPrp28的阱衍射晶体Δ可以获得N，并且晶体结构使用重原子衍生物通过SAD求解。该结构以2.0º的分辨率精制，含有352–806残基。表1总结了X射线数据收集和晶体结构细化统计数据和2两个环区（残基695–702和724–727）以及N末端残基338–351和C末端残基807–820在电子密度图中没有定义，很可能是无序的。

表1 数据收集和处理 括号中的值用于外壳。 数据集 低能量遥控 峰值 波长（Ω） 1.01212 1.00858 温度（K） 100 100 “空间”组 C类2221 C类2221 单位-细胞参数  一(Å) 125.43 125.36  b条(Å) 136.77 136.65  c（c）(Å) 73.22 73.15  α=β=γ(°) 90 90 分辨率范围（Ω） 39.97–2.00 (2.11–2.00) 36.00–2.00 (2.10–2.00) 独特反射次数 42906 (6219) 81386 (11104) 完整性（%） 100.0 (100.0) 99.2 (96.2) 多重性 4.9 (4.9) 2.6（2.5） 〈我/σ(我)〉 12.1 (2.3) 15.42 (1.88) R（右）合并(%) 6.4 (58.4) 3.8 (49.8) 立方厘米1/2†(%) 99.9 (95.2) 99.9 (99.2) 异常相关性‡(%)   29（11） 平均异常差（SigAno）‡   1.12 (0.79) †计算公式XSCALE公司或SCALA公司; 立方厘米1/2是相关系数Karplus&Diederichs（2012）描述的两个随机选择的半数据集). 计算公式XSCALE公司.

3.4. 总体结构

hPrp28的三维结构ΔN可以分为四个部分：N末端延伸（NTE；残基352-378）、N末端类RecA-结构域（RecA-1；残基379-629）、连接子区域（残基630-639）和C末端类Rec A-结构区（RecA2；残基640-806）（图2，补充图S2）。NTE属于一个连接解旋酶结构域和N-末端RS样结构域（残基1-220）的区域（残基221-378），该结构域仅存在于高等真核生物的Prp28中。NTE的残留物367–377形成α-根据RecA-1（补充图S3）进行包装的螺旋线。有趣的是，这种螺旋也在DEAD-box蛋白DDX5（PDB条目）中的相同位置发现4a4天和三氧化二铁; 杜塔等。, 2012; 舒茨等。, 2010). 进一步的N末端残基353–366形成一个不规则环，包括两个短螺旋匝；然而，它的位置和构象似乎是由与晶格中相邻蛋白质分子的相互作用所诱导的。

图2 两个垂直视图(一,b条)hPrp28的ΔN结构。N端延伸段为黄色，RecA-1域为棕色，RecA2-域为绿色。此外，RecA-1中的插入部分以红色突出显示，连接RecA-1~RecA-2的连接器为淡蓝色。

两个RecA-like结构域的折叠与其他超家族II（SF2）ATP酶的已知结构非常相似。N末端类RecA-结构域（RecA-1；残基379-629）包含一个八标记的β-由七条平行线和一条反平行线组成的薄板，即第一条平行线。总共十个α-螺旋线在两侧紧靠着这张纸。hPrp28 RecA-1结构域的折叠与DDX5的折叠最相似（PDB条目三氧化二铁)，231个普通C的r.m.s.d.为1.7º^α原子。hPrp28的一个独特特征是插入24个氨基酸（残基576–599），这些氨基酸在RecA-1结构域上形成突起（补充图S3）。此插入由α-螺旋位于延伸环内，相对于DEAD-box蛋白家族的保守序列基序位于相反的一侧（图2). 插入物也存在于后生动物Prp28同源序列中，但在后生动物的Prp28中缺失酿酒酵母C末端定位的RecA-2结构域（残基636–802）小于RecA-1结构域。它包含一个六股并联β-被五个人包围的床单α-螺旋线。hPrp28-RecA-2结构域的折叠与DDX3（Högbom）的折叠最为相似等。, 2007; PDB条目2jgn号)作为153个普通C的r.m.s.d^α原子量为1.6º。

3.5. 螺旋岩芯构造

其他几种DEAD-box蛋白的晶体结构显示，当一个短而灵活的连接体连接它们时，它们的两个RecA-like结构域的相对取向具有高度的可变性（希尔伯特等。, 2009). 因此，在晶体中发现的不同构象可能主要通过晶体填充接触来稳定，而在溶液中解旋酶域是灵活的。在活性状态下，DEAD-box解旋酶必须采用闭合的构象，正如带有结合RNA和非水解ATP类似物（仙谷等。, 2006). 在这种构象中，DEAD-box蛋白家族的保守序列基序彼此非常接近，并在两个RecA-like结构域之间的缝隙中形成完整的活性位点。在晶体结构hPrp28的ΔN、 与其他DEAD-box蛋白的晶体结构相比，这两个RecA-like结构域的取向是独特的（图3). 这种排列比其他DEAD-box蛋白更开放，但eIF4AIII的自由形式除外，它是最开放的形式。有趣的是，hPrp28的定义排列ΔN RecA结构域似乎是一个有利的结构域，因为这两个RecA区域之间有许多分子内接触，例如Lys382和Glu640之间的盐桥和五个氢键（Ile379–Gly759、Thr381–Gly7.59、Thr 381–Ser761、Lys382-Val788和Glu614–Ser790）。此外，由于Ser631与Tyr628和Glu637之间的紧密氢键，两个RecA结构域之间的连接物似乎在其构象中被阻止（图4).

图3 hPrp28的解旋酶核心ΔN具有开放的整体构象，因为两个RecA结构域相对于Vasa（紫色）表示的活性构象发生了位移。hPrp28的叠加ΔN带(一)活性闭合构象的Vasa和其他表现出开放构象的DEAD盒蛋白：(b条)Prp5(c（c）)UAP56(d日)小时1p(电子)eIF4A和(（f）)eIF4AIII。(克)的叠加(一)–(（f）).

图4 RecA-2域背面（绿色带状模型）与RecA-1域、两个RecA域之间的链接器（蓝色）和N端扩展（黄色）的交互。(一)RecA-1的表面为金色，表面暴露的N和O原子分别为蓝色和红色。(b条)RecA-2的表面为绿色，暴露在表面的N和O原子分别为蓝色和红色。

3.6. hPrp28的P回路ΔN采用独特的“半开放”构象

RecA-1结构域中的ATP结合囊主要由属于序列基序Q、I和II的氨基酸组成。没有核苷酸与hPrp28结合ΔN、 但其活性部位含有硫酸根离子（图5一). 其结合位点与DEAD-box蛋白eIF4A（PDB入口）中发现的硫酸根和磷酸根离子几乎相同1季度)和Hera（PDB条目2克许)分别为（奔驰等。, 1999; 鲁道夫等。, 2006). 基于与晶体结构Vasa（PDB条目第二数据库3; 倦石等。, 2006)，ATP分子被模拟到hPrp28的结合囊中ΔN（图4b条). 腺苷部分很适合放在口袋里α-和β-磷酸盐也可以被调节。然而γ-磷酸盐与P-loop的Thr437发生冲突，对应于保守基序I（图5b条). P-环的总体构象与对具有结合的硫酸盐、磷酸盐或AMP的其他DEAD盒蛋白观察到的构象相似，并且先前被表示为半开放构象（补充图S4）。然而，Thr437在hPrp28的P环中的位置Δ相对于常见的半开构象，N向活性位点移动约2º（图5c（c）). hPrp28独特的P环构象ΔN通过Thr437、Glu550和Lys441之间的氢键稳定。这些相互作用紧密连接了母题I和II。此外，P-loop的构象受位于拟结合位点之间的结合硫酸盐离子的影响α-和β-ATP的磷酸盐。它通过氢键与残基Gly438–Thr442的酰胺N原子和Thr441的羟基进行配位。在酵母eIF4A（Benz等。, 1999). 然而，自由形式的eIF4A能够绑定ATP，这需要通过向外移动P环打开绑定位置，从而允许γ-磷酸盐结合。eIF4A和hPrp28的叠加ΔN表明，它们的半开P-环的构象显著不同，这影响了Thr437、Glu550和Lys441之间氢键的长度。而hPrp28中Thr的羟基和Glu的羧酸基之间的距离为2.5ºΔN结构表示强氢键，eIF4A中相应的氢键更长，即eIF4A-硫酸盐络合物结构（PDB入口1季度)Hera–磷酸盐复合物结构（PDB条目2克许). 此外，在hPrp28中ΔN Lys441在Thr437的氢键距离（3.1°）内，而在eIF4A中它太远（PDB条目中为4.0°1季度PDB条目中的和6.1Ω2克许). 因此，eIF4A和Hera中的基序I和II之间的相互作用较弱，显然有助于ATP结合时P环的打开。

图5 P回路的构造。(一)P环的构象由多个氢键（红色虚线）稳定。ATP结合囊被硫酸盐离子占据。(b条)基于Vasa–ATP复合物结构的结合ATP模型。由于Thr437、Glu550和Lys441之间的氢键，ATP结合受到P-loop的阻碍。(c（c）)hPrp28的P环构象ΔN是独特的，因为在eIF4A与结合的硫酸盐的结构中，或在DEAD盒解旋酶Hera与结合的磷酸盐的结构中，DEAD基序的Glu与P-环的Thr或Ser之间的氢键被破坏。

hPrp28的P回路ΔN不参与可能影响其构象的晶体接触；因此，其固定构象的结构决定因素尚不清楚。在DEAD盒蛋白中，P-环及其周围的残基是高度保守的。Prp28的P环中唯一明显的差异ΔN位于典型序列T/S-G-T/S-G-K-T之前的残基中，在大多数DEAD-box蛋白质中是Gln或Lys，但在hPrp28中是Glu（Glu434）。然而，Glu434的侧链与其他残基没有任何接触，因此不会直接影响Thr437的位置。

3.7. 激活Prp28

由于Prp28的ATP酶活性对其在剪接体中的功能至关重要，因此Prp28必须发生构象变化才能易于ATP结合和水解。Prp28的激活不仅涉及P环的打开，还涉及两个RecA域的重排。在其他DEAD-box蛋白质的晶体结构中发现的RecA结构域的不同相对位置被认为是晶体堆积的结果，因为在没有核苷酸或RNA配体（Hilbert等。, 2009). 连接RecA域的链接器被认为是灵活的；然而，其氨基酸序列会影响解旋酶的柔韧性，从而影响其活性。eIF4A连接子中的残基与相应的Vasa残基逐步交换证明了这一点，这显著增加了eIF4A的ATP酶活性（低等。, 2007). 有趣的是，Prp28的连接体似乎在其构象中被一个紧密的氢键网络所阻止，从而使RecA域保持在一个广泛开放的状态。此外，由于RecA领域的广泛开放，在其背面形成了许多相互联系，从而进一步稳定了广泛开放状态。由于RecA-2结构域和蛋白质分子的其他部分（包括NTE、RecA-1和连接子）之间的相互作用，其掩埋表面约为3496º²（计算单位：国际学生成绩评估; Krissinel&Henrick，2007年)它含有疏水核以及极性和离子相互作用。这些发现表明，Prp28在结晶状态下的宽开放状态在溶液中也可能是稳定的，因此可能解释即使在RNA存在的情况下也缺少ATP酶活性的原因等。, 2014)，推测其宽开放构象中的Prp28是否参与了剪接体组装的早期步骤是很有趣的。这一点得到了剪接体DEAD-box解旋酶Prp5的类比的有力支持，晶体中观察到的开放构象似乎是稳定的，并且对剪接体组装至关重要（Zhang等。, 2013). 然而，Prp5和Prp28的整体开放构象差异很大（图3b条).

Prp28在剪接体B形成过程中的ATP依赖性功能^行为剪接体的其他成分必须在Prp28中诱导复杂的构象变化。对于其他一些DEAD盒蛋白，通过相互作用蛋白刺激ATP酶和解旋酶活性的结构基础，如eIF4A的eIF4G（Hilbert等。, 2011)或Gle1代表Dbp5（蒙佩蒂等。, 2011)众所周知。相比之下，与Prp28形成稳定复合物并刺激其活性的蛋白质相互作用伴侣尚不清楚，但在酿酒酵母确定了与U1、U2、U5和U6 snRNP的几种蛋白质的相互作用（Cordin&Beggs，2013). 由于先前的ATP交联研究表明，U5 snRNP或U4/U6·U5 tri-snRNP中的hPrp28不结合ATP（拉格鲍尔等。, 1996)hPrp28与U5 snRNP或三snRNP蛋白和snRNAs的相互作用不足以激活。这与我们的发现一致，即即使在核提取物中存在所有snRNP也不会诱导hPrp28的ATP结合，并且hPrp18的激活仅在三snRNP加入剪接体a复合体后发生。因此，只有在剪接体的框架中，hPRp28的RecA结构域才能通过与剪接体蛋白和/或snRNAs和前mRNA的未知相互作用而形成催化活性构象。