1.简介

在过去15年中，大分子晶体学最重要的发展之一是开发了越来越自动化的计算工具，这些工具更加严格和自主，从而减少了结构求解中的人工工作量。除了结构确定管道单个组件能力的一般改进外，尤其是在自动化建筑领域（Perrakis等。, 1999; Cowtan，2006年; 迪迈奥等。, 2006; 特威利格等。, 2008)，描述了许多包含多个步骤的复杂管道（布里科涅等。, 2003; Holton&Alber，2004年; 海角等。, 2004; 潘基卡尔等。, 2005; 基根和温恩，2007年; 特威利格等。, 2009). 这些项目特别侧重于加速过程的早期阶段（从原始衍射图像或简化数据开始），目的是在用户干预最少的情况下获得明确的部分模型。完成结构由晶体学家完成，仍然主要是手动程序。

在这些软件项目的配合下，同步加速器束线的生产力在更明亮辐射源（卡瓦丁等。, 2003)，改进的探测器硬件（Broennimann等。, 2006)、自动化样品安装和数据收集（Karain等。2002年; 西普里亚尼等。, 2006; 上野等。, 2006; 格罗胡尔斯基等。, 2012). 这些发展对于基于结构的药物发现特别有用，这促使制药公司建立专门用于此目的的光束线。尽管这些结构包含相对较少的被认为具有治疗效用的靶蛋白，但工业项目的产量估计每年超过10000个结构（Wasserman等。, 2012). 在wwPDB（伯曼）中沉积了近600个X射线晶体结构等。, 2003)晶体研究对众多FDA批准的HIV-1蛋白酶抑制剂的发现和表征的影响是不可否认的（Wlodawer，2002). 其他疾病的类似结果[例如丙型肝炎病毒（神田等。, 2013)和慢性粒细胞白血病（Milojkovic&Apperley，2008)]正在实现。

在基于结构的药物发现中，一项重要任务是将功能相关的配体放置到剩余电子密度中。近年来，许多软件包都对此提供了帮助，包括X配体（奥尔德菲尔德，2001年),ARP协议/弯曲（兹瓦特等。, 2004),配体配合（特威利格等。, 2006),阿菲特（瓦洛德克等。, 2006),RhoFit（节奏匹配）（Global Phasing Ltd）和PrimeX公司（曹贝尔等。, 2012). 大多数配体植入程序都包含本地真实空间精炼初始放置后的步骤。在不同程度上，大多数还与配体参数化、建模和精炼软件。然而，高通量共晶体学非常重复的工作流程通常仍然是一系列离散的步骤。尽管制药公司经常开发专有的内部管道（Kroemer等。, 2004; 莫伊等。, 2006; Davies&Tickle，2012年; 瓦瑟曼等。, 2012)，几个独立的小组已经自动化了该过程的一部分(例如济等。, 2013; 沙夫等。, 2012)，这些系统中的大多数要么与束线自动化集成，要么对广泛的晶体学界来说不容易使用。

虽然许多负责解决大量晶体结构的人员已经开发了一些方法来解决n个结构比以前更快、更容易n个−1结构完全出于必要性，开发真正通用且坚固的管道的任务比最初想象的要困难得多。为一类结构物优化管道可能相对简单；然而，要使其具有足够的健壮性来处理非常不同的结构类别和不同质量的晶体学数据是非常重要的。符合帕累托原则（Juran&Gryna，1988）)或者说80-20规则，大部分开发工作仍然致力于使少数案例发挥作用。这种努力和成功率之间的差异可以通过以下观察来解释：结构确定，晶体学家必须做出许多决定。其中许多决策依赖于他或她的经验，很难编纂，尤其是当程序仅限于当前的坐标和衍射数据时。即使是通常被认为理所当然的结晶步骤(例如空间群测定和分子替换）由于许多参数，很难实现普遍自动化(例如溶剂含量）只是指导原则，因为先前的知识被自然和无意识地利用到了普遍的程度。

在这里，我们描述了蛋白质-配体的集成管道结构测定作为的一部分凤凰套房（亚当斯等。, 2010)这是专门针对这些历史上困难的步骤编写的。该管道是基于几个先前描述的程序构建的，这些程序是围绕一个通用框架设计的，并考虑到未来的自动化（Terwilliger等。, 2006; 麦考伊等。, 2007; 莫里亚蒂等。, 2009; 阿富汗等。, 2012). 在经验丰富的晶体学家根据相关指南权衡中间结果时，他们做出了大量努力来编纂决策步骤。从处理过的数据、密切相关的分子置换搜索模型和有关目标配体的基本化学信息开始，该程序能够在许多情况下以最少的用户干预生成高质量和几乎完整的结构。集成验证工具（Chen等。, 2010)协助用户进行质量控制并完成最终结构。该管道根据基于结构的药物发现蛋白-配体复合物的多个集合和精选蛋白-配子结构铱数据库的代表性样本进行了基准测试（沃伦等。, 2012). 为了确保事后不会有任何好处，为管道提供了与发布的相同的搜索模型和结构因素结构确定。该管道能够解决许多配体结合结构，在某些情况下，可以产生与原始沉积相媲美（如果不超过）的结果。

2.方法

2.1. 基本设计

软件(phenix.ligand管道)是用Python实现的，并且设计为在凤凰没有外部依赖项的套件。所采取步骤的概述如图1所示各个步骤被封装在模块化代码中，因此可以在不同的工作流中迭代使用。未来可以扩展该方法，以采用更通用的自动化框架，其中可以删除或添加组件（Tsai等。, 2013).

图1 管道工作流的示意图。可选模块用虚线边框高亮显示，多处理器软件模块用灰色阴影表示。这个库特步骤仅在交互模式下调用。

在大多数情况下，程序以最小配置运行。唯一的强制性输入是经过处理的数据（任何常用格式的缩放强度或振幅），这是分子置换（或者，如果同晶，分子替换）和配体几何信息的来源，如SMILES字符串或文件（Weininger，1988)、MOL2或约束成本加保险费、运费文件，或指示肘部（莫里亚蒂等。, 2009)使用化学成分词典中的条目（Henrick等。, 2008). 如果给定目录路径作为输入，程序会尝试通过扫描目录内容来自动确定适当的输入文件。虽然原始衍射图像的处理目前不在凤凰，该程序可以扩展到与现有的自动化数据处理管道一起运行（Winter，2010; 冯海因等。, 2011).

2.1.1. 数据设置和分析

初始步骤根据需要将衍射数据转换为MTZ格式的振幅。R（右）_自由的如果不存在，则导入或生成标志。在此转换之后，使用phenix.x分类（兹瓦特等。, 2005)确定可能的孪生并根据需要确定合适的分辨率截止值。如果未定义MR搜索副本的数量，则根据马修斯系数进行估计。

2.1.2. 分子替换

尽管有许多配体共晶结构与本机结构和/或彼此有效同构，过程运行相位器（麦考伊等。, 2007)默认情况下，确保蛋白质的正确放置。搜索模型由修改雕塑家（Bunkóczi&Read，2011年)尽可能地匹配输入序列，而不补齐缺失的侧链；如果与序列一致，则将磷酸酪氨酸等常见的修饰氨基酸留在原处。使用MR_AUTO模式的默认设置，但搜索模型中存在的非水杂原子保留在完全占用状态。如果需要，可以使用将MR解决方案映射到与同构结构相同的参考框架phenix.find_alt_orig_sym_日期（欧夫纳等。, 2012).

2.1.3. 配体生成

如果输入配体信息不包含完整的几何约束，则通过以下公式计算分子几何肘部并作为约束输出成本加保险费、运费格式、PDB格式的坐标和Python pickle文件。目前，对于手性配体，必须明确要求所需的立体异构体；虽然肘部能够列举手性中心，对映体之间的区分将需要额外的计算决策作为拟合程序的一部分。虽然默认优化通常足以进行配体放置，但半经验AM1量子力学方法也可用，并且可能会产生改进的几何结构和参数。

2.1.4. 首字母精炼和重建

模型放置正确后，菲尼克斯定义（阿富宁等。, 2012)使用单个坐标（在实空间和互易空间中）和原子位移参数（ADP）运行精炼策略。如果相位器之前没有运行过，刚体精炼将每个蛋白质链作为单独的组进行。取决于分辨率的参数化用于确定ADP类型和几个其他选项，包括自动转子安装和溶剂更新。模拟退火是一个选项。用户还可以在要传递给的参数文件中指定自定义设置菲尼克斯定义在这一阶段通常不使用权重优化，因为快速收敛被认为比获得理想几何体和最小化过拟合更重要。

在首字母之后精炼该模型被进一步处理，以去除可能干扰配体结合的原子，包括水和密度不匹配的侧链。如果R（右）_自由的大于指定的截止时间精细化，指示在收敛半径以外的严重错配区域精细化，这个自动编译巫师（特威利格等。, 2008)用于应用更积极的策略来改进模型（使用默认的重建-就地模式，这将保留输入原子）。我们从经验上发现R（右）_自由的在大多数情况下，0.32的截止值是合适的，但这可以由用户进行调整。

2.1.5. 配体安装

这个配体配合巫师（特威利格等。, 2006)目前用于在百万英尺_o个−DF公司_c（c）使用指定的几何图形，在去除水的情况下计算地图肘部，以有效的方式产生约束和坐标。可以选择使用自动最大熵程序来改进差异图（Gull&Daniel，1978）)，具有将其扩展到更高分辨率的效果；然而，默认情况下，映射被截断为1.5º，因为发现超出此范围的额外细节对配体拟合没有好处（有时是有害的），因为即使在布局正确的情况下，相关系数也较低。假设要搜索的配体拷贝数与搜索模型的拷贝数相同，尽管这也可以由用户指定。与默认设置相比，该管道使用了一组略为严格但较慢的选项配体配合确保对构象进行全面采样的程序。对于相关系数配体到图的位置需要被接受；如果多拷贝结果不一致，则只保留最高核配体。配体配合如果可能，将使用NCS关系来放置配体，但仍由相关系数密度拟合。随后的后处理步骤是对模型进行更积极的处理，如果NCS操作符生成的配体拷贝符合2，则删除冲突的蛋白质原子百万英尺_o个−DF公司_c（c）地图。该管道设计为易于适应配体放置的替代方法(例如导向配体置换；克莱等。, 2014).

2.1.6. 最终细化

如果至少可以成功放置一个配体副本，则第二轮精炼使用以下更保守的优化策略运行。如果分辨率低于1.75º，则使用网格搜索来确定X射线和立体化学的最佳权重/B类-因子项（Afonine等。, 2011). 在此之前，由于剪枝或由雕塑家可以选择作为附加步骤自动重新构建和优化。元素离子的放置（Echols等。，准备中）也是精炼步骤。杂原子按照最近的链进行分类和分组（类似于PDB中沉积的结构）。

虽然达到这一阶段的模型通常具有高质量和接近收敛的特性，但用户干预变得不可避免。结构的不适配区域通常超出简单最小化的收敛半径，并且需要手动重建，并且在许多情况下，可能需要添加来自缓冲液或结晶条件的额外配体或缺失的蛋白质残基。与其他地方一样凤凰（回声等。, 2012)，整个过程与验证和可视化工具集成，以简化并鼓励仔细检查结构。特别是，尽管总体上相关系数通常是配体是否处于正确位置的可靠指标，单个分子仍需要检查，如有必要，还需要校正，以验证与电子密度和先前化学知识的良好一致性，因为可能存在较小的局部误差。以下精细化，使用摩尔概率套房（陈等。, 2010)在中实施凤凰和用于查看结果的脚本库特（埃姆斯利等。, 2010)生成。输出目录中的一个简单摘要文件列出了每个放置的配体及其与电子密度的匹配，这是由几个指标（包括总CC和差异图峰值）判断的，如果配体放置不完全成功或密度指标表明（部分）不匹配，则会发出警告。

3.结果

3.1. 典型案例

作为管道高通量应用的示例，我们详细检查了几组相关结构。大多数情况下，只有一个配体和一个小蛋白模型的单一副本。在最近的AMD或Intel系统上，在单处理器内核上，这些示例的默认设置运行时间平均为1到2小时。

3.1.1. 因子Xa

蛋白酶因子Xa是一个受欢迎的药物发现靶点，在PDB中有120多个结构（通常与抗凝药物先导物复合）。我们选择了一组五种相关的苯三唑啉酮结合结构（Quan等。, 2010)，均以中等分辨率（2.2–2.75º）溶解。因为其中之一，PDB条目3英尺，没有在PDB标题中定义搜索模型，我们使用了搜索模型（PDB条目1英尺)用于输入第2页，共16页由同一存款作者（平托等。, 2007). 其他四个结构均使用PDB条目进行分阶段3英尺作为搜索模型。所有这些结构都已成功完成（表1). 适应配体所需的唯一构象重排是Asp189侧链的旋转，这很容易通过结合梯度最小化和旋转异构体来实现菲尼克斯定义自动生成的结构与沉积模型非常相似，但PDB入口中的翻转苯基三唑啉酮部分除外3千立方英尺.

表1 选定因子Xa（Quan）的管道运行统计等。, 2010)、凝血酶（比埃拉等。, 2012)和HIV-1蛋白酶（Klei等。, 2007)数据集 除非“C”指定自定义，否则使用默认参数。对于自定义运行，只尝试了一次调整参数(例如降低接受配体放置的CC截止值）并成功完成优化。代表部分的“P”表示放置的配体中至少有一个副本大部分是正确的，但并非完全正确(例如它被放置在正确的位置，但一个或多个扭转角没有正确设置）。 蛋白质 PDB代码 d日最小值(Å) 重新定义R（右）工作/R（右）自由的 管道R（右）工作/R（右）自由的 配体r.m.s.d.（Å） 因子Xa 3英尺 1.54 0.156/0.186 0.159/0.197 0.25 3千立方英尺 2.25 0.170/0.193 0.175/0.202年 1.21 3千立方厘米 2.20 0.165/0.197 0.172/0.209 0.93 3千夸脱 2.75 0.189/0.238 0.202/0.239 0.52 3kqe 2.35 0.173/0.213 0.182/0.227 0.77 凝血酶 第3页17 1.43 0.126/0.157 0.140/0.161 0.93 3夸脱 1.52 0.144/0.158 0.156/0.172 0.06 3夸脱 1.63 0.144/0.164 0.153/0.174 0.07 第三季度 1.74 0.145/0.168 0.152/0.177磅 3.69 0.151/0.173摄氏度 0.08 3季度x5 1.35 0.123/0.146 0.136/0.153 0.06 3公顷 1.52 0.145/0.169 0.157/0.178 0.08 3小时 1.90 0.157/0.179 0.162/0.164 0.20 3si3公司 1.55 0.142/0.164 0.151/0.175 0.17 3si4公司 1.27 0.134/0.155 0.144/0.163 0.07 3秒2 1.30 0.136/0.163 0.150/0.172 0.09 HIV-1蛋白酶 2fxd型 1.60 0.181/0.205 0.216/0.247 0.13 2fxe型 1.80 0.165/0.199 0.179/0.199 0.33† †仅单构象。

3.1.2. 凝血酶

来自一个学术团体的一组稍大的结构是一系列以人类凝血酶为模型系统的化合物，用于研究溶剂在配体结合中的作用（Biela等。, 2012). 管道成功完成了结构（表1)使用PDB条目1小时8天作为起始模型（Skordalakes等。, 2001). 除了一个结构外，所有结构的最终模型都具有与已发表的模型几乎相同的配体构象。异常，PDB条目第三季度，的不同之处仅在于末端部分的旋转，并且在映射计算中使用最大熵过程重新运行作业会导致正确的拟合。管道生成的结构中有许多细节目前尚未建模：例如共价连接的N个-乙酰氨基葡萄糖（NAG）、磷酸和甘油等其他小分子、错配侧链和交替构象。然而，公开模型中的一对钠离子是由菲尼克斯定义使用新的识别程序（Echols等。，准备中）。

3.1.3. HIV-1蛋白酶

人类免疫缺陷病毒（HIV）蛋白酶是基于结构的药物发现最早和最成功的靶点之一（Wlodawer，2002）). 由于其临床重要性和病毒基因组的快速突变（通常导致耐药性），PDB中沉积了500多个不同形式的蛋白质结构。抑制剂通常以两种对称姿势结合在二聚体形成的缝隙中。由于这种行为和影响绑定的突变频率，它为自动化带来了更具挑战性的测试用例。我们在一对与抑制剂阿他扎那韦（Klei）结合的突变型上测试了该管道等。, 2007). 其中一个被指定为抗抑制剂突变体（PDB条目2fxe型)，类似于野生型结构，对称结合atazanavir；该结构使用PDB条目分阶段进行1小时/小时（何苏尔等。, 1994). 随后使用改进的结构来确定抗劈裂突变体（PDB进入2fxd型)它以单一方向结合抑制剂，与野生型相比表现出更多的局部构象差异。

因为PDB中atazanavir的SMILES字符串（剩余代码DR7）没有指定手性其中一个N原子，我们手动生成分子结构肘部。尽管配体配合能够在PDB条目中找到配体的两种构象2fxe型(配体配合通常发现配体的五个候选位置），只有具有最高CC的一个被选择（图2一). 蛋白酶单体或组装的二聚体均可用于输入模型，结果基本相同。当使用单体运行时，管道试图找到配体的两个副本，但由于不允许重叠放置，因此它继续使用单个副本，并在运行结束时生成警告。除了在PDB条目中缺少第二个整合物之外2fxe型，两种结构的自动配体放置与沉积模型几乎相同（图2一和2b条). PDB进入的改进模型2fxe型与已发表的模型非常一致，除了点突变导致的一些缺失的侧链原子外，几乎是最终的。完成PDB条目需要额外的手动工作2fxd型模型（图2c（c）); 除了一些不完整的侧链外，还需要检查几个有序性差的环，并可能删除，特别是链中的残基80–83B类可选的侧链完成步骤能够恢复许多缺失的原子，但一些残基的主链构象差异很大，超出了默认的收敛半径精炼协议。这两种结构还具有来自结晶缓冲液的几个额外未建模配体（醋酸盐、硫酸盐和甘油）。

图2 比较已发表的（紫色）和管道（黄色）阿扎那韦结合HIV-1蛋白酶结构（Klei）的精细模型和配体结合结果等。, 2007). 配体放置前的电子密度显示为2的灰色网格百万英尺o个−DF公司c（c）地图（轮廓为1.0σ)以及绿色和红色网格百万英尺o个−DF公司c（c）地图（等高线为±3.0σ). 为了清晰起见，只显示配体半径1.5°范围内的密度。(一)PDB条目2fxe型; 抑制剂抗性突变体的活性位点显示抑制剂的对称结合（第二构象为蓝色）。(b条)PDB条目2fxd型; 抗劈裂突变体的活性位点。(c（c）)抗劈裂突变体的整体结构精炼（使用链条A类属于2fxe型作为起始模型），说明构象和缺失原子的剩余差异。红色箭头表示链中含有80–83残基的环B类.

3.2. 针对不同测试集进行基准测试

作为一种更彻底的性能度量，我们在一组用于测试配体锁软件（铱-HT测试集；https://www.eyopen.com/铱)经过过滤，只含有化学特性明确、与电子密度很好匹配且没有几何问题的配体（沃伦等。, 2012). 我们选择了代表31种独特蛋白质的36个结构（补充表S1¹)可以从PDB头中明确标识单个搜索模型。在每种情况下，都会结合一个感兴趣的配体物种，尽管一些结构还包含初始模型中存在的其他生理相关配体（例如PDB条目中的血红素1g9伏或PDB输入中的ATP模拟1小时2). 配体在大小和结构上差异很大，从泛酸（C₆H（H）₁₁O（运行）₄)大的药物样分子。管道结果（表2)在使用默认设置运行时，可以总结如下。

（i） 21（58%）个结构（PDB条目1比尔6,1b9伏,1例,1个fcx,1平方英尺,1小时2,1小时,1千3单位,1毫升,1n2焦耳,第1页，共1页,第1页，共6页,下午1点,1 q1克,第1季度41,1年9月,1吨1,1周1磅,1个2克,1年v3和2br1号机组)使用默认设置明确工作，无需干预；人工检查证实配体的放置基本上是正确的，与已发表的模型（如果有的话）只有轻微的分歧。用于PDB条目第1页，共6页，我们使用了TYR(L（左）-酪氨酸）作为目标残基，基于对沉积模型的目视检查，该模型被错误标记为含有DTY(D类-酪氨酸）。 （ii）PDB条目1g9伏已成功运行，但配体的拷贝数是手动指定的，因为配体的估计拷贝数不正确（因为使用了完整的血红蛋白四聚体作为搜索模型与两个配体结合）。 （iii）PDB条目1l2秒也成功运行，但两个单体之间结合的配体的第三个副本没有构建。两个活性位点配体的位置与已发表的结构相同，但由于搜索模型中重新定向的Gln侧链的干扰，对第三个活性位点的搜索失败。 （iv）管道最初未能解决PDB进入问题2个袋子由于蛋白质拷贝数估计错误，导致R（右）自由的高于继续的截止点；在没有进一步干预的情况下，以明确指定的方式重新运行是成功的。 （v） 管道在PDB条目上也失败第1季度5由于配体密度的CC较差，尽管位置近乎完美（图3一). 以更宽松的CC截止值0.6重新运行成功。 （vi）PDB条目1平方米6运行至完成，但由于差异密度不明确，配体的一部分错配（图3b条). 第二次使用最大熵图处理提高了密度，足以成功放置（图3c（c）). （vii）两个结构，PDB条目1英尺和1个unl，在管道的初始运行中均未成功，但可以使用最大熵图计算进行恢复（除了在1个unl). （viii）两个结构，PDB条目1兆赫和1u4天，在预期位置放置了一个或多个配体，完成时没有出现错误，但要么未能放置所需的所有副本，要么目测配体构象、几何形状或方向有重大错误。其中一些问题很容易通过对库特. （ix）PDB条目1小时失败的原因是配体（苦马豆素，残基代码SWA）由一个灵活的双环系统组成，该系统需要是非平面的，才能正确地适应密度，而这种自由度目前还没有被配体配合. （x） 四种结构（PDB条目1cx2个,1个qhi,第1季度和4倍)配体放置成功之前，需要对放置的搜索模型进行更广泛的重建，并提前终止。

总之，这些测试表明，在很大程度上（超过50%），使用默认参数的管道可能会成功，而在另外30%的情况下，可能需要调整一个或多个参数才能获得最佳成功。由于配体结构的病理问题或搜索模型与最终模型之间的巨大结构差异导致的失败率出奇地低，只有15%。

表2 总结phenix.ligand管道铱测试集的结果（按PDB代码的字母顺序列出） 重新定义的R（右）工作/R（右）自由的沉积模型的值是使用与管道最后阶段相同的协议生成的。放置/存在列给出了在不对称单元中的拷贝数之外放置的配体的拷贝数。在36个测试用例中的21个测试用例的第一次尝试中，成功放置了目标配体的所有副本；另外五个在进行了一些小的参数调整后获得了成功。获得了六个问题案例的部分解决方案（用斜体表示）。 PDB代码 重新定义R（右）工作/R（右）自由的 管道R（右）工作/R（右）自由的 放置/存在 配体r.m.s.d.（希腊） 1b9伏 0.175/0.202年 0.200/0.224 第1页，共1页 0.65 1比尔6 0.180/0.224 0.192/0.225 第1页，共1页 0.20 1cx2个 0.245/0.308 0.250/0.362 0/4 — 1例 0.169/0.192 0.182个/0.213个 第1页，共1页 0.06 1个fcx 0.135/0.67 0.152/0.181 第1页，共1页 0.13 1平方英尺 0.141/0.175 0.157/0.182 第1页，共1页 0.08 1英尺 0.158/0.204 0.231/0.255 0/1 — 0.178/0.208 1/1摄氏度 0.59 1g9伏 0.141/0.166 0.135/0.171 1/2 0.17 0.136/0.171 2/2摄氏度 0.16, 0.17 1小时 0.163/0.216 0.173/0.227 2/2磅 0.31, 2.04 1小时2 0.121/0.160 0.134/0.166 第1页，共1页 0.10 1小时 0.165/0.189 0.177/0.198 4/4 0.32–0.44 1小时 0.136/0.167 0.222/0.248 0/1 — 1千3单位 0.135/0.162 0.137/0.165 第1页，共1页 0.05 1l2秒 0.147/0.168 2005年6月16日 2/3 0.15, 0.16 1毫升 0.159/0.208 0.173/0.208 6/6 0.25–0.86 1平方米6 0.171/0.221 0.184/0.227 1/1磅 1.36 0.179/0.230 1/1摄氏度 0.68 1兆赫 0.146/0.168 0.152/0.168 1/1磅 2.51 1n2焦耳 0.168/0.193 0.185/0.210 2/2 0.10, 0.25 第1页，共1页 0.156/0.179 0.175/0.197年 2/2 0.11, 0.13 第1页，共6页 0.173/0.191 2008年10月23日 8/8 0.11–1.82 第1季度5 0.120/0.164 0.231/0.264 0/1 — 2018年1月14日 1/1摄氏度 0.86 下午1点 0.190/0.224年 0.218/0.249 第1页，共1页 0.53 1 q1克 0.156/0.185 0.195/0.214 6/6 0.18–0.63 第1季度41 0.182/0.195 0.207/0.222 2/2 0.19, 0.30 1个qhi 0.214/0.253 0.348/0.403 0/1 — 1年9月 0.162/0.193 0.240/0.284 第1页，共1页 0.39 1吨1 0.147/0.171 0.158/0.182 2/2 0.17, 0.19 1u4天 0.187/0.206 0.200/0.219 2/2磅 0.64, 0.67 1个unl 0.190/0.214 0.264/0.291 0/1 — 0.246/0.276 1/1摄氏度 0.98 1周1磅 0.196/0.230 0.225/0.257 2/2 0.22, 0.30 1个2克 0.177/0.198 0.204/0.221年 2/2 0.26, 0.56 第1季度 0.201/0.246 0.351/0.411 0/1 — 1年v3 0.151/0.184 0.169/0.193 第1页，共1页 0.19 2个袋子 0.159/0.185 0.446/0.507 — — 0.165/0.193 1/1摄氏度 0.42 2br1号机组 0.162/0.195 0.170/0.212 第1页，共1页 0.33 4倍 0.205/0.30 0.256/0.361 0/4 —

图3 铱测试集中有问题的结构示例。第一轮精炼后（配体装配前）的电子密度显示为2的灰色网格百万英尺o个−DF公司c（c）地图（轮廓为1.0σ)以及绿色和红色网格百万英尺o个−DF公司c（c）地图（等高线为±3.0σ). 发布的模型显示为紫色条。黄色条表示管道执行结束时的优化模型；橙色条表示配体放置不正确或被拒绝。(一)PDB条目第1季度5配体位置正确，但被拒绝，因为CC到百万英尺o个−DF公司c（c）地图低于默认截止值0.7。(b条)PDB条目1平方米6。由于不明确，配体在使用默认设置（橙色棒）运行时部分错配百万英尺o个−DF公司c（c）密度。使用最大熵过程过滤地图可获得正确的位置(c（c）). (d日)在中放置配体1小时显示出与已发布结构的偏差。(e（电子）)配体安装错误1小时从起始模型中去除钙离子（紫色球体）。

由于该管道的目的是解决、拟合和精炼蛋白质-配体复合物，因此输出模型并不现成，需要不同程度的干预来替换缺失或突变的侧链、重建环或放置额外的配体。在PDB条目中1年9月例如，搜索模型（PDB条目1n6b号机组)只有76%的序列一致性，尽管配体放置成功，但蛋白质表面有很大的区域发生了显著的构象变化，需要重建或删除。然而，在十种情况下R（右）_自由的对于成功运行，在重新定义的沉积结构的1%以内，并且几何质量始终很高摩尔概率clashscore（陈）等。, 2010)以个位数表示所有成功完成的运行。对于许多示例，现在可能有一种替代搜索模型可用，它与结晶构象更为相似，并将显著改进收敛性；然而，我们将测试限制为使用作者指定的原始搜索模型。

在大多数配体放置成功的结构中，大部分运行时间由精细化，尤其是在运行重量优化时（补充表S2）。正在运行相位器对整个运行时的影响相对较小，因为大多数MR解决方案都是明确的（并且在大多数测试用例中只需放置一个组件）。配体配合通常是下一个最耗时的步骤，此时间与配体的拷贝数有关。因为两者都是菲尼克斯定义和配体配合如果可以在Linux和Macintosh系统上使用多处理器内核，那么在多核系统上运行时间可以大大缩短。然而，对于类似结构的大型集（如前一节中所讨论的结构），使用每个作业的单个处理器并行处理多个数据集可能会大大提高计算资源的使用效率。如果需要，可以通过禁用权重优化或运行配体配合在“快速”模式下，以可能较差的输出模型质量和可能的配体放置失败为代价。

4.讨论

这里描述的程序已经在PDB中的数百个结构上进行了测试（未显示数据），目的是确保无论最终结果如何，都能保持稳健的行为。由于评估配体配合结果，当与默认参数一起使用时，假阳性的数量（配体被放置在错误的位置）被证明是非常低的。在有利的情况下，结晶蛋白相对于起始模型的变化最小，最终结构非常接近完整，可以通过单轮手动检查/校正和精细化。在几次测试中R（右）_自由的低于已公布的结构。虽然这一减少可能部分归因于精炼协议和/或原始模型的改进不足（Joosten等。, 2009; 阿富汗等。, 2012)它确实证明了自动化管道生产相对高质量结构的能力。然而，我们也遇到了对自动化和手动分析都具有挑战性的情况。

即使模型非常准确和完整，地图质量的限制也会妨碍正确绑定位置的自动识别。在一些示例中（例如PDB条目第1季度5铱测试集），配体配合配体放置正确，但由于差异图的CC较差，管道拒绝这些模型。或者，可以优先拟合其他未建模的不同密度的斑点，尽管根据CC通常也会拒绝此类假阳性。这些灵敏度限制可能会使管道不太适合基于片段的药物发现，其中配体通常较小，结合亲和力较低（和部分占据）。这些结构的配体配置步骤可能需要更大的灵活性，例如安装到2百万英尺_o个−DF公司_c（c）映射并使用比CC更敏感的度量。然而，我们发现使用最大熵映射对一些测试用例非常有用，因为它有效地提高了傅里叶映射的分辨率并消除了大量噪声（Collins，1982). 虽然可以通过降低CC截止值和/或搜索更多目标配体的副本，以更宽松的模式运行管道，但这并不保证正确放置定义较弱的配体，因为存在额外的未建模密度（对于蛋白质或其他缓冲组分）可能会阻碍拟合过程。

更一般地说，使用相对简单的几何约束而不是物理上真实的力场可能会限制配体放置的准确性，而自动化程序不容易检测到配体放置。特别是，尽管精炼如果是用显式氢原子进行，缺乏吸引力或溶剂化效应可能会遗漏精细的化学细节，如氢键和疏水相互作用。分子力学力场在晶体学中的应用精炼已经证明在某些情况下可以改善蛋白质的几何形状（科帕德等。, 2011; 施尼德斯等。, 2011; 贝尔，何等。, 2012)它可能有助于克服低分辨率数据集固有的局限性。精炼对抗量子力学势也可以产生更精确的几何结构（Li等。, 2009).

在我们的测试中，配体放置失败的最常见原因是存在与真实结构的巨大构象差异，即使在精细化。在许多结构中，如蛋白激酶，在小环的尺度上有显著的构象变化(例如P-loop、DFG loop、activation loop）到整个域(例如N末端叶）伴随配体结合。这些动作通常超出高级动作的范围精炼协议，如模拟退火和可变形弹性网络方法（Schröder等。, 2007; 布鲁格等。, 2012)相反，需要大规模重建。尽管可以从模型中去除错配残基，但过度剪枝通常会导致配体放置，试图利用去除的蛋白质原子的不同密度，而不是只关注真正的结合位点。因为当前的自动化模型构建方法凤凰（特威利格等。, 2008)针对其中之一从头开始在构建实验图或对现有模型进行微小更改时，我们没有在管道环境中广泛使用它们。然而，有针对性地应用循环填充方法和相关结构的推断可以在不大幅增加运行时的情况下克服重建问题。通过在中自动测试多个搜索模型，也可能可以更有效地解决许多结构分子置换（Keegan&Winn，2007年; 长等。, 2008; 班科奇等。, 2013). 大量与大多数流行药物靶点密切相关的PDB条目提供了结构多样性的额外来源，可用于重建。

在具有挑战性的情况下，使用交互模式可以有效地帮助解决问题。在第一轮管道自动化使用后，很容易发现此类情况。此外，对于一系列相关化合物，一旦第一个蛋白质-配体复合物的结构得到解决，它就可以自动用作其余化合物的起始模型。Xa因子结构就是这样（Quan等。, 2010)之前介绍过。不管怎样，手动检查管道的结果（通过生成库特细化后的脚本），以确定结构完成的后续步骤。最后一轮仔细验证，修复突出的模型缺陷和精炼在出版或沉积之前是必不可少的。一般来说，结构完工的进一步改进(例如局部模型重建、交替构象的建模、小离子和额外配体的放置），以使研究人员能够以完全自动化的方式生成准备沉积的结构。采用和勤勉使用强大的验证工具（陈等。, 2010; 阅读等。, 2011; 波扎尔斯基等。, 2013)在结构确定过程中和之后，随着这些方法变得更加复杂和广泛，它们将继续至关重要。

5.可用性

程序phenix.ligand管道随中的源代码一起分发凤凰软件套件(https://www.phenix-online.org)1.8.3或更高版本。学术用户可以免费使用整套套件。