2.1. 蛋白质表达和纯化

通过亚克隆不同的SUFU组装细菌表达结构_32–483变种成载体pLJMBP4c（Monné等。, 2008). MBP-SUFU公司-Δ和MBP-SUFU-SH质粒分别通过七肽序列PSRGEDP和洗牌IDR序列替换氨基酸279-360生成（补充表S1一²). 突变体MBP-SUFU_{R386A、R388A、H391A、R393A}通过GeneCust Europe DNA突变服务获得。MBP-SUFU结构表达于大肠杆菌21°C时的JM109（DE3）（Promega）。在OD的细胞密度下诱导蛋白质表达₅₅₀=0.5–1，0.1 mM（M）IPTG持续16–18小时。将来自1 l培养物的细胞悬浮在10 ml 50 m中M（M）Tris–­HCl pH值7.5，50 mM（M）氯化钠，1米M（M）氯化镁₂，1米M（M）DTT，0.2毫克毫升⁻¹溶菌酶，25 U ml⁻¹苯甲酸酶（Sigma–Aldrich）和cOmplete Mini-EDTA-free蛋白酶抑制剂（Roche），并使用三个冷冻-解冻循环进行破坏。细菌碎片通过18000的离心作用被清除克30分钟。将清除的裂解物装入5 ml HisTrap HP柱中（GE Healthcare）。在50 m深度的大范围冲洗后M（M）Tris–HCl pH值7.5，1M（M）氯化钠，20米M（M）咪唑，1米M（M）DTT，结合蛋白用50 m洗脱M（M）Tris–HCl pH值7.5，50 mM（M）氯化钠，500米M（M）咪唑，1米M（M）DTT公司。这个洗脱液使用Amicon Ultra离心过滤装置（Millipore）浓缩至2–3 ml，并通过尺寸排除色谱法（SEC）在HiPrep 26/60 Sephacryl S-200 HR凝胶过滤柱（GE Healthcare）上，用10 m平衡M（M）Tris–HCl pH 7.4，50 mM（M）氯化钠，1米M（M）DTT公司。如上所述浓缩含有单体MBP-SUFU蛋白的混合馏分，并使用0.2µm Ultrafree-MC离心过滤装置（Millipore）过滤。浓缩蛋白质在液态氮中闪速冷冻₂并储存在−80°C。

N-末端His的昆虫细胞表达₆-标记的SUFU_30–484使用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统（Invitrogen）进行。根据供应商的建议生成重组杆状病毒库存。Sf9细胞（Invitrogen）在27°C的SF-900 II无血清培养基（Invit罗gen）中培养，并在中对数期感染重组杆状病毒（10⁶ 细胞ml⁻¹，存活率≥99%），感染倍数为1。72小时后，通过离心法收集细胞，并在−80°C下保存直至使用。在20 ml 50 m中溶解来自1 l培养物的颗粒细胞M（M）Tris–HCl pH 7.4，150 mM（M）氯化钠，5米M（M）氯化镁₂，0.2%NP-40，1米M（M）DTT，25单位毫升⁻¹使用三个冷冻-解冻循环的苯甲酸酶和cOmplete Mini-EDTA-free蛋白酶抑制剂（罗氏）。20000离心后克在1小时内，将清除的裂解液装入5 ml HisTrap HP柱中（GE Healthcare）。用50 m深度进行大量冲洗后M（M）Tris–HCl pH 7.5，1M（M）氯化钠，20米M（M）咪唑，1米M（M）DTT，结合蛋白用50 m洗脱M（M）Tris–HCl pH值7.5，1M（M）氯化钠，500米M（M）咪唑，1米M（M）DTT公司。这个洗脱液加载到HiPrep 26/60 Sephacryl S-200 HR色谱柱上（GE Healthcare），用10 m平衡M（M）Tris–HCl pH 7.4，1M（M）氯化钠，1米M（M）DTT公司。蛋白质按上述方法进行纯化、浓缩、过滤和储存。

2.2. 结晶

MBP-SUFU-FL蛋白质（12 mg ml⁻¹10米M（M）Tris–HCl pH值7.5，50 mM（M）氯化钠，1米M（M）DTT，1米M（M）麦芽糖）在4°C下通过吊滴蒸汽扩散结晶M（M）酒石酸钾/钠，0.1M（M）双三丙烷pH值8.5，16%(v（v）/v（v）)PEG 3350（蛋白质与母液的比例为2:1）。5天后出现宽度为0.5 mm的X形晶体。将晶体逐步转移到与母液加上额外4%等量的冷冻溶液中(v（v）/v（v）)PEG 3350和10%(v（v）/v（v）)MPD，安装在低温回路中，并在液体N中闪蒸冷却₂.

MBP-SUFU的晶型I-Δ（6.5毫克毫升⁻¹10米M（M）Tris–HCl pH值7.5，50 mM（M）氯化钠，1米M（M）DTT，1米M（M）麦芽糖）在4°C下通过0.08的悬浮滴蒸气扩散获得M（M）二甲氨基甲酸钠，pH 6.6，20%(v（v）/v（v）)甘油，160米M（M）乙酸钙，9%(v（v）/v（v）)聚乙二醇8000。14天后出现200µm长的棒状晶体。样品在与母液等效的溶液中清洗，安装在冷冻回路中，并在N液体中闪蒸冷却₂.

MBP-SUFU的晶型II-Δ（11.6毫克毫升⁻¹10米M（M）Tris–HCl pH 7.5，50 mM（M）氯化钠，1米M（M）DTT）在4°C下通过吊滴蒸汽扩散结晶，其中0.1M（M）Na HEPES pH 7.5，17%(v（v）/v（v）)聚乙二醇3350，0.2M（M）氯化钠。棒状晶体在几天内出现，并逐步转移到与生长条件相当的冷冻溶液中再加上3%(v（v）/v（v）)PEG 3350和10%(v（v）/v（v）)MPD，安装在低温回路中，在液体N中闪蒸冷却₂.

MBP公司_{A216H_K220H型}-SUFU公司-Δ_{W61D_L62S_G63F_P453A型_Δ454–456_K457A}（10毫克毫升⁻¹10米M（M）Tris–HCl pH值7.5，50 mM（M）氯化钠，1米M（M）DTT，1米M（M）麦芽糖）与乙酸锌以1:1摩尔比混合，与GLI1以1:4摩尔比混合_第页或GLI3_第页。配合物在4°C下通过悬挂滴蒸气扩散结晶，滴入1:1或2:1的蛋白质：良好溶液[14-18%(v（v）/v（v）)聚乙二醇3350，0.2M（M）甲酸钠]。从沉淀物中生长出来的不规则形状的晶体被逐步转移到与生长条件加上额外10%相等的低温溶解中(v（v）/v（v）)PEG 3350，安装在低温回路中，并在液体N中闪蒸冷却₂.

2.3。X射线数据采集

衍射数据是在法国格勒诺布尔的欧洲同步辐射设施（ESRF）收集的。使用以下光束线和波长从100 K的单晶中收集数据：MBP-SUFU-FL，ID14-1（Wakatsuki等。, 1998), 0.9334 Å; MBP-SUFU公司-Δ晶型I，ID23-1（Nurizzo等。, 2006)，1.0723Å；MBP-SUFU公司-Δ晶型II，ID23-2（Flot等。, 2010), 0.8726 Å; MBP公司_{2016年2月22日}-SUFU公司-Δ_{W61D_L62S_G63F_P453A型_Δ454–456_K457A}–GLI1_第页和MBP_{A216H_K220H型}-腐乳-Δ_{W61D_L62S_G63F_P453A型_Δ454–456_K457A}–GLI3_第页，ID29（德桑克提斯等。, 2012)，0.9762？（表1).

2.4. X射线结构测定

MBP-SUFU-FL和MBP-SUFU-Δ数据集是用处理的iMosflm公司（巴蒂等。, 2011)并与集成SCALA公司（埃文斯，2006年)和截断（French&Wilson，1978）); MBP_{A216H_K220H型}-SUFU公司-Δ_{W61D_L62S_G63F_P453A_Δ454–456_K457A}–GLI1_第页和MBP_{A216H_K220H型}-腐乳-Δ_{W61D_L62S_G63F_P453A型_Δ454-456_K4–7A}–GLI3_第页使用处理数据集XDS公司（卡布施，2010年)在中夏2管道（2010年冬季).

MBP-SUFU-FL的结构由分子置换（MR）与相位器（麦考伊等。, 2007)使用以4.1°分辨率收集的初始数据集{总体R（右）_下午。= 13.4%; 外壳[4.10–4.32º，〈我/σ(我)〉 = 2.1]R（右）_下午。= 37.9%}; 搜索模型是来自链的MBP分子A类PDB条目的3d4克（Thr3–Ala371残基；莫内等。, 2008)和链上SUFU的N末端结构域A类PDB条目的1毫升（残留物Pro32–Asp262；商户等。, 2004). 如MBP-ZP3（莫内等。, 2008)，解的正确性由以下分子的明显差异电子密度证实D类-（+）-麦芽糖（其坐标不包括在搜索集合中）在非对称单元。SUFU C终端域的结构被手动构建到σ_A类-加权差分傅里叶映射（Read，1986)使用库特（埃姆斯利等。, 2010).精炼针对最大似然（ML）目标是用菲尼克斯定义（亚当斯等。, 2010). 最初使用模拟退火，起始温度为5000 K，平移/校准/螺旋（TLS）精炼属于B类在最后的重建周期中，根据TLSMD公司（Painter&Merritt，2006年)单独细化的原子位移参数分析；非晶体对称性（NCS）约束在精炼步骤基于手动确定的分子之间的局部差异。骑行氢原子添加了菲尼克斯减少并贯穿始终；使用执行验证摩尔概率（陈）等。, 2010). Ramachandran统计数据支持率为98.0%，允许率为2.0%，异常值为0.0%。

MBP-SUFU的结构-Δ使用MBP-SUFU-FL（MBP，Glu5–Ala371；SUFU，Pro32–Leu278，Ile361–Asp449，Glu455–Val478）的精细坐标作为搜索模型，通过MR求解晶体形态I。MBP-SUFU-Δ使用MBP-­SUFU-FL的SUFU部分和MBP的非关联形式（PDB条目1个omp，残基Lys1–Thr366；沙夫等。, 1992)作为搜索模型；然而，需要进行大量的手动重建，以在非对称单元这种晶体（链B类–D类)，高度无序（平均B类系数=272Ω²)与结构的其他部分相比（平均B类系数=122º²). MBP-SUFU的结构-Δ使用相同构造的晶型I的精细坐标作为参考来精细化晶型II。晶体形态I的Ramachandran统计数据为98.0%的赞成值、1.9%的允许值和0.1%的异常值，而晶体形态II的Ramacchandran统计值为97.8%的赞成值，1.9%的容许值和0.3%的异常值。

GLI1_第页和GLI3_第页利用MBP-SUFU的精细坐标，通过MR求解复杂结构-Δ作为搜索模型；与后一种情况一样，基本上按照MBP-SUFU的描述对结构进行了改进和验证。GLI1的Ramachandran统计数据_第页复合物的支持率为97.9%，允许率为2.0%，异常值为0.1%，而GLI3的支持率则为97.9%_第页复杂度为97.9%，允许2.1%，异常值0.0%。图形是使用生成的PyMOL公司（薛定谔）和LigPlot（照明绘图）⁺（拉斯科夫斯基和斯温德尔出版社，2011年）). 补充视频S1是用制作的PyMOL公司基于以下公式计算的插值RigiMOL公司（薛定谔）。

2.5. 有限的蛋白质水解

SUFU公司_32–484在pLJMBP6c中克隆的基因在大肠杆菌并如上所述进行纯化。用胰蛋白酶（Sigma–Aldrich）在100 m内消化纯化的蛋白质M（M）23°C下的碳酸氢铵。通过添加10 m使蛋白酶失活M（M）PMSF和样品装载缓冲液，然后在95°C下加热5分钟。用SDS-PAGE分离蛋白质带，并用考马斯蓝染色观察。通过N末端测序（Alphalyse A/S）以及MALDI–TOF和MALDI-TOF/TOF质谱分析（Ultraflex II和Autoflex III，Bruker Daltonics）鉴定蛋白质水解肽片段。

2.6. 氢-氘交换（HDX）

比较MBP-SUFU-FL和MBP-SUFU之间的酰胺HDX动力学-Δ，每种蛋白质4µl（均为11 mg ml⁻¹50米M（M）Na HEPES pH 7.0，50 mM（M）氯化钠，5米M（M） β-巯基乙醇，1.5 mM（M）麦芽糖）与13µl氘代缓冲液混合，氘代缓冲液具有与蛋白质样品相同的离子组成。对于MBP-SUFU-FL–Gli3_第页相互作用实验，45µl MBP-SUFU-FL（11 mg ml⁻¹)与5µl Gli3混合_第页（6米M（M）; 5.5倍过量）并孵育1小时。在后一种情况下，通过混合4µl MBP-SUFU-FL–Gli3启动交换_第页使用与样品离子组成相同的13µl氘化缓冲液。通过添加9µl淬火溶液（4M（M）尿素，50米M（M）TCEP，1%TFA）和液氮中的闪速冷冻₂MBP-SUFU-FL和MBP-SUFU的氘化反应培养60、300、600和1800秒-ΔMBP-SUFU-FL–Gli3的实验和300、600和1800秒_第页交互作用实验（4°C，一式三份）。使用24小时培养作为全氘化样品进行反向交换校正。

样品在半自动HDX-MS系统（瑞典Biomotic AB）中进行分析，在该系统中，手动注入的样品在1.0°C下自动消化、清洁和分离。使用1分钟的停流方案（美国Applied Biosystems公司的多孔酶固定化胃蛋白酶盒）消化脱脂样品，然后使用1.0×10 mm的C-18预柱（英国ACE HPLC柱）在线脱盐步骤，使用0.05%的TFA在300µl min的条件下进行脱脂⁻¹3分钟，消化肽类然后用C18 Halo 2.1×100 mm（美国先进材料技术公司）或Chromolith FastGradient 50×2 mm（MBP-­SUFU-FL/MBP-SUFU）分隔-Δ和MBP-SUFU-FL–Gli3_第页分别进行实验。消化道肽类在0.3%甲酸中用8.5min 5–40%的乙腈线性梯度分离。Orbitrap XL型质谱仪（美国热电科学公司）以60 k分辨率运行用于分析。

进行了几次LC-MS/MS运行以鉴定MBP-SUFU肽肽。这个吉祥物使用Matrix Science软件搜索MBP-SUFU序列数据库。多肽得分高于20分的患者被选为HDX动力学研究对象。此外，通过手动检查MS/MS光谱进一步验证每个选定的肽。这个HD审查员软件（美国Sierra Analytics）用于处理所有HDX MS数据。

2.7. 小角度X射线散射（SAXS）

使用铜辐射在Rigaku BioSAX-1000上收集SAXS数据(λ=1.5418？），来自Rigaku FR-E+超明亮旋转阳极X射线发生器。BioSAXS-1000由一个光学器件、一个真空室和一个探测器组成。该光学元件是一种专为BioSAXS-1000设计的双反弹Rigaku共焦MaxFlux多层光学元件，它将X射线聚焦到探测器上的某一点。真空室包含一个Kratky块、一个样品架和一个带集成PIN二极管的光束阻挡器。Kratky试块将X射线束准直成一条线的形状，在样品位置约为0.5 mm高；然而，光束被聚焦到探测器的一个点上。使用DECTRIS PILATUS 100K探测器记录SAXS数据，相机长度为0.5米q个所有SAXS数据的范围为0.01至0.68º⁻¹.

将所有样品和缓冲液装入1.0mm石英毛细管中，置于真空下，在20°C下进行测量。葡萄糖异构酶被用作二级标准来评估我（0）数据。用于SAXS的MBP-SUFU蛋白从大肠杆菌如上所述，但SEC在50 m深处进行M（M）Na HEPES pH 7.0，50 mM（M）氯化钠，5米M（M） β-巯基乙醇，1.5 mM（M）将麦芽糖和峰中仅有的两个馏分合并进行分析（补充图S1）。通过SDS-PAGE凝胶的考马斯蓝染色判断，蛋白质纯度为99%。蛋白质纯化前立即通过凝胶过滤柱的SEC缓冲液用作空白。散射数据是从冷冻的MBP-SUFU小份样品中测量的，这些小份样品在冰上解冻，在20000℃离心克在SEC缓冲液中稀释10分钟，并装入直径为1.0 mm的石英毛细管中。用于GLI肽实验，MBP-SUFU-Δ以1:10摩尔比与GLI1混合_第页在同一个缓冲区中。每种蛋白质的三种浓度（1.1至7.3 mg ml⁻¹)进行测量，以确保浓度效应不会影响数据分析。蛋白质浓度是通过测量280nm处的吸光度来确定的，MBP-SUFU-FL的消光系数为1.4073，MBP-SUFU为1.5484-Δ。每个SAXS配置文件都是在图像刷新模式下曝光60分钟的结果。在这种模式下，60分钟暴露是连续6次10分钟暴露的总和，这些暴露是单独检查的，以确保样品中不存在辐射损伤。

初始数据分析，将散射图像还原为一维强度图与动量传递(q个)然后是缓冲区减法，由Rigaku执行SAXS实验室软件包。然后使用ATSAS公司程序集（Petoukhov等。, 2012).回转半径(R（右）_克)这些值是根据年的吉尼亚曲线确定的普里默斯（科纳列夫等。, 2003)以及对距离分布函数，P（P）(第页)，使用计算GNOM公司（斯维尔贡，1992年).五_c（c）,问_R（右）和χ²_自由的根据兰博和泰纳（2013）计算).从头算MBP-SUFU的分子包膜是使用达米夫（Franke&Svergun，2009年). 对于MBP-SUFU-FL和MBP-SUFU-Δ，15个独立达米夫使用达马弗（沃尔科夫和斯维尔根，2003年)并对潜在集群进行了评估DAMCLUST公司（佩图霍夫等。, 2012). 对于MBP-SUFU-FL，明显有两个集群，每个集群由七个模型组成；第1组平均值的平均归一化空间差异为0.728±0.050，第2组平均值为0.729±0.063。对于MBP-SUFU-Δ只有一个聚类，平均值的归一化空间差异为0.722±0.031。CRYSOL公司（斯维尔贡等。1995年)用于计算每个MBP-SUFU的理论SAXS剖面晶体结构模型并将其与实验SAXS配置文件进行比较。C类^α-MBP-SUFU-FL中无序SUFU残基的原子坐标晶体结构通过执行九次独立运行珊瑚（Petoukhov和Svergun，2005年; 意思是χ²/χ²_自由的值10.3±1.6和14.8±2.4），假设MBP-SUFU部分-Δ保持固定并使用数据q个= 0.3 Å⁻¹.晶体结构和珊瑚模型最初与平均SAXS包络线对齐，使用SUPCOMB公司然后通过旋转和平移手动调整。MBP-SUFU模型-Δ通过融合麦芽糖结合MBP和SUFU的晶体模型，组装出最适合SAXS平均包络的-Δ在2.8º分辨率的apo结构中观察到的一个特定相对方向。取代SUFU中IDR的七位环路-Δ然后从其中一个3.5º分辨率结构的分子上嫁接，并使用YASARA结构（克里格等。, 2002)这样它就可以很好地配合间隙。得到的优化模型与MBP-SUFU的散射数据以及原始晶体学模型一致-Δ这样做。

2.8. 微尺度热泳

一种5-FAM标记肽（FAM-GLI1_第页)包含GLI1的残基115–131（补充表S1b条)由Pepceuticals Ltd.合成。在MST缓冲液（50 mM（M）Tris–HCl pH值7.6，150 mM（M）氯化钠，10米M（M）氯化镁₂，0.05%吐温-20），并以1:1的比例与FAM-GLI1混合_第页最终浓度为50 nM（M）FAM-GLI1型_第页MBP-SUFU结构在14.2–29 070和54–110 500 n范围内M（M）反应被吸入玻璃毛细管和FAM-GLI1的热泳运动_第页使用Monolith NT.115仪器（NanoTemper Technologies；Wienken）进行监测等。, 2010)，激光开启30秒，关闭5秒，MBP-SUFU-FL和MBP-SUFU-FL突变体的激光功率/电压为20%，MBP-SUFU突变体为40%-ΔMBP-SUFU-SH为80%。激光加热前测量荧光(如果_冷)激光开启30秒后(如果_热门). 归一化荧光如果_热门/如果_冷反映标记分子的浓度比。如果_热门/如果_冷直接绘制并乘以系数10，得出每千分之一的荧光相对变化。K_d日由三个独立的热泳测量值计算得出，使用纳米回火软件（NanoTemper Technologies）。

2.9. Shh条件培养基的生产

293 EcR Shh细胞（ATCC；Cooper等。, 1998)在DMEM高糖（4.5 g l）中培养⁻¹)L（左）-补充10%胎牛血清（FBS；Saveen Werner）的谷氨酰胺培养基（PAA Laboratories GmbH），0.1 mM（M）MEM非必需氨基酸（Sigma–Aldrich），1 mM（M）丙酮酸钠（Sigma–Aldrich），100单位ml⁻¹青霉素和100µg ml⁻¹链霉素（PAA Laboratories GmbH）。在90–100%的汇合率下，将细胞切换到含有2%FBS的培养基，并用1.5µM（M）ponasterone A（恩佐生命科学公司）。诱导24小时后收集条件培养基，通过0.22µm过滤器过滤，在液体N中闪速冷冻₂并储存在−80°C。

2.10. 热稳定性分析

将重组MBP-SUFU蛋白稀释至2.6µM（M）50米M（M）Na HEPES pH 7.0，50 mM（M）氯化钠，5米M（M） β-巯基乙醇；这个肽类GLI1型_第页和GLI1_第页-SH（补充表S1b条)由W.Mawby博士（布里斯托尔大学）合成，溶解在同一缓冲液中。蛋白质以14000转克在4°C下放置20分钟，然后将SYPRO橙色（分子探针）添加到最终浓度为6×。反应体积为25µl，在带有2.2µ的96 well PCR板中制备M（M）蛋白质/SYPRO橙色溶液，如适用，44µM（M）肽。用胶带密封板，在iCycler中以12 s 0.2°C的步骤从20°C加热至90°C，并使用470 nm的激发波长和570 nm的发射波长检测荧光。

2.11. 荧光实验

将重组MBP-SUFU构建物稀释至2.5µM（M）50米M（M）Na HEPES pH 7.0，50 mM（M）氯化钠，5米M（M） β-巯基乙醇，在14000下纺丝克将SYPRO Orange添加到最终5倍浓度的染料之前，在4°C下保持20分钟。在黑色96-well板（Nunc）中使用激发在λ=470 nm，在λ=570纳米。GLI1型_第页或GLI1_第页-上海肽类在上述相同的缓冲液中制备，按给定比例添加，并在进行第二次读数之前混合。肽添加后的读数除以相应的肽添加前测量值，以获得标准化结果。

2.12. 协同免疫沉淀和免疫印迹分析

在pCMV5中分别用C-末端FLAG-标记的GLI1转染Cos-7细胞（Andersson等。, 1989)以及使用Fugene 6（Roche）在pCMV-Script（Stratagene）中的N末端Myc-tagged SUFU。转染24h后，用50m溶解细胞M（M）Tris–HCl pH 7.4，150 mM（M）氯化钠，1%NP-40，0.25%脱氧胆酸钠，1 mM（M） N个-乙基马来酰亚胺（Fluka），1米M（M）二硫苏糖醇和cOmplete迷你蛋白酶抑制剂（罗氏）。合并归一化裂解物并预孵育6 h。使用琼脂糖结合的抗FLAG M2（Sigma–Aldrich）和抗Myc共免疫沉淀16 h第9页第11页（细胞信号）抗体。用500µl裂解缓冲液洗涤珠子三次，通过在SDS–PAGE样品缓冲液中煮沸珠子洗脱结合蛋白，并通过Western blotting进行分析。样品通过SDS–PAGE分离，转移到聚偏氟乙烯固定化-P膜（Millipore），并使用抗Myc 71D10（细胞信号）或抗Myc 9E10（圣克鲁斯）抗体和抗DYKDDDDK标签抗体（细胞信号学）进行探测。在四个独立的实验中也得到了类似的结果。

2.13. Hh途径活性测量

带有突变IDR区域的SUFU变体，SUFU-Δ、SUFU-SH、SUFY-SH2和SUFU-IDR_飞通过用GenScript USA Inc.合成的相应序列替换pcDNA3.1（Invitrogen）中N-末端Myc-tagged全长SUFU的279–360氨基酸生成的结构体（补充表S1一). 用GLI1-FLAG或Myc-GLI2（Roessler）混合物转染HEK 293细胞等。, 2005; Erich Roessler赠送的礼物）和Myc-SUFU与12GLI-RE-TKO-luc荧光素酶报告子（科德曼等。, 1999)和pRL-SV40（Promega）内部对照，使用Fugene 6或X-tremeGENE 9（Roche）转染试剂。在48小时内进行表达分析，然后使用双荧光素酶活性测定试剂盒（Promega）测量荧光素酶活性。为了验证转染的SUFU和GLI构建物的表达水平，用SDS-PAGE分离细胞裂解物的等分样品，并进行上述免疫印迹分析。使用图像J1.47v图像分析和图像处理软件（施耐德等。, 2012).

苏福^−/−小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）等。, 2006)用p8x3′Gli-BS LucII或p8x3'Gli-mBS LucII报告基因构建物（Sasaki等。, 1997; 来自Hiroshi Sasaki的慷慨礼物）以及使用Lipofectamine LTX的pRL-SV40（Promega）内部控制Plus（加）试剂（Invitrogen）。转染后，苏福^−/−培养MEF细胞，直到培养达到融合（24–48小时），然后将细胞切换到100–200 n的低血清培养基（0.5%FBS）M（M）SAG（由Karolinska Institutet的Jan Bergman善意提供），10µM（M）使用双荧光素酶活性测定试剂盒（Promega）进行细胞裂解和荧光素素酶活性测量。为了对报告基因分析进行统计评估，使用了单尾配对Student t检验。在独立实验中，所有活动测量至少进行了三次。

3.1. 人类SUFU的结构

尽管晶体结构已报告SUFU的N端域（商户等。, 2004)，由于难以生产可溶性全长重组蛋白，因此没有关于其C末端区域以及该区域相对于蛋白质其余部分的排列方式的信息。在这里，我们在大肠杆菌将其与N-末端麦芽糖结合蛋白（MBP）分子融合通过三丙氨酸连接子（Smyth等。, 2003; 莫内等。, 2008). 融合物（MBP-SUFU-FL）含有人类SUFU的32–483残基和C末端六组氨酸标签，通过固定化金属离子纯化亲和层析和尺寸排除色谱法（SEC），在麦芽糖存在下结晶，结构测定为3.0º分辨率(R（右）= 20.0%,R（右）_自由的= 24.6%; 图1一和表2). N端域显示出与先前确定的结构相同的结构（Merchant等。, 2004)尽管存在N端MBP融合伙伴。C末端区域折叠成一个由四股和六股组成的区域β-表，均采用混合拓扑，由两个反并联连接α-螺旋（图1一和1b条). 这是一个新的蛋白质折叠，只有微弱的结构相似性(DALI公司 Z轴-得分2.7-2.8；Holm&Rosenström，2010年)Jab1/MPN结构域蛋白（PDB条目1个oi0和1r5倍; Tran公司等。, 2003; 安布罗乔等。, 2004). SUFU C末端结构域中的第一个螺旋（螺旋6）弯曲并与螺旋5相互作用通过残留物Arg386、Arg388、His391和Arg393（图2一)从而形成一个五螺旋束，由来自N端域的三个螺旋和来自C端域的两个螺旋组成。这些相互作用解释了为什么C末端结构域不能单独表达，并且与上述残基突变导致蛋白质聚集的观察结果一致，可能是由于错误折叠（图2b条).

图1 全长人体SUFU的总体结构和拓扑结构。(一)晶体结构SUFU的N端结构域为米色，C端结构域根据(b条). (b条)拓扑方案，本质无序区域（IDR）由虚线表示。

图2 N端和C端结构域之间的相互作用对于异源SUFU的溶解度至关重要。(一)两个结构域之间形成的五螺旋束中残基之间的相互作用。(b条)尺寸排除色谱法轮廓；开放箭头和填充箭头分别表示聚集蛋白与空泡体积和可溶性单体蛋白洗脱对应的峰值。

3.2. SUFU包含一个内在无序区域

尽管结晶蛋白完好无损（补充图S2一)，斜方晶系中的两个SUFU分子非对称单元C末端结构域残基279–360的表观密度不高，表明该分子区域具有高度的流动性。由于无序经常影响晶体衍射质量，我们生成了一个新的结构（MBP-SUFU-Δ)其中82个残基被更短的七残基环所取代（补充表S1一). 该结构以与MBP-SUFU-FL相同的方式表达和纯化，并在麦芽糖存在（晶型I）和不存在（晶形II）的情况下结晶。相应的结构被确定为2.8º分辨率(R（右）= 20.0%,R（右）_自由的=23.4%）和3.5Å分辨率(R（右）= 25.9%,R（右）_自由的=29.3%）（表2). 两种晶体形式都包含四个分子非对称单元，成对的假设为与MBP-SUFU-FL结构中观察到的相同的头尾排列（补充图S2b条). MBP-SUFU的褶皱-Δ基本上与全长蛋白质相同，表明无序残基对蛋白质折叠或整体稳定性并不重要。

为了确定C-末端结构域中未观察到的区域在溶液中是否也紊乱，我们用胰蛋白酶对MBP-SUFU-FL进行有限的蛋白水解（Receveur-Bréchot等。, 2006). 在299–363残基中发现了几个蛋白酶敏感性位点，这一延伸几乎正好与缺失密度区域重叠晶体结构（图3一和3b条). 同样，氢/氘交换（HDX）分析（Brock，2012）; 布鲁德勒等。, 2006)表明它对氘化高度敏感（补充图S3一和4）。此外，昆虫和细菌细胞中表达的人类SUFU的有限蛋白水解片段模式基本相同（补充图S5）。总的来说，这些数据表明279-360残基构成了一个内在无序区域（IDR），这是本地人类SUFU的固有特征。在这样的情况下，当晶体学只揭示了图片的一部分时，SAXS是一种有用的补充技术，可用于检查溶液中无序区域的构象（普特南等。, 2007). 有趣的是，MBP-SUFU-FL和MBP-SUFU的SAXS比较-Δ表明IDR从覆盖其β-表1（图3c（c）和3d日，补充图S6和补充表S2）。后者由HDX数据证实，该数据显示MBP-SUFU-FL中相同的薄片和暴露在分子相同表面上的N末端结构域环受到保护，但MBP-SUFU中没有-Δ（图3c（c）以及补充图S3和4）。

图3 SUFU包含一个内在无序区域。(一,b条)MBP-SUFU-FL的胰蛋白酶消化分析。开放的绿色矩形表示我们的结晶模型中蛋白质的结构部分。红色矩形FR1–FR5代表蛋白水解片段。(c（c）,d日)MBP-SUFU-FL和MBP-SUFU的配合-Δ平均晶体结构从头算根据SAXS数据计算的包络线。MBP，蓝色；SUFU N-末端结构域，米色；SUFU C-末端结构域，绿色。IDR的残留物，建造方珊瑚，以黑色显示。多肽MBP-SUFU-FL比MBP-SUFU更能防止HDX-Δ以粉红色显示。

为了确定IDR是否影响SUFU的GLI结合特性，我们使用了人GLI1衍生肽（GLI1_第页; 残基115–131；补充表S1b条)包含高度保守的SYGH基序，对与SUFU（Dunaeva）的相互作用很重要等。, 2003)用MBP-SUFU-FL和MBP-SUFU进行热稳定性分析-Δ（图4一). 添加GLI1_第页稳定两种蛋白质：T型_米MBP-SUFU-FL移动了4°C，MBP-SUFU移动了-Δ移动了3.6°C。含有相同残基的对照肽（GLI1）没有提供稳定性_第页-上海；补充表S1b条). 有趣的是，添加GLI1后，MBP-SUFU-FL显示出较高的初始荧光值_第页，但MBP-SUFU均未观察到此类影响-Δ或与MBP-SUFU-FL相同的第三种结构，但IDR的82个残基被洗牌（MBP-SUFU-SH；补充表S1一). 该效应的GLI1剂量依赖性在增加GLI1的单独实验中得到证实_第页浓度（补充图S7一). 此外，MBP-SUFU-FL更稳定(T型_米=50.1°C），高于MBP-SUFU-Δ(T型_米=46.6°C）和MBP-SUFU-SH(T型_米=47.7°C）。综上所述，这些数据表明，尽管IDR明显无序，但它具有不同于随机循环的特性，并随着GLI1的改变而改变_第页肽结合。

图4 SUFU IDR具有独特的结构特性。(一)MBP-SUFU构建物的热稳定性分析一式三份，单独（蓝色）或与GLI1一起进行第页（红色）或GLI1第页-SH（绿色）。所有构造都绑定到GLI1第页; 然而，MBP-SUFU-FL在初始GLI1时具有不同的物理性质第页结合，如荧光显著增加所示。(b条)FAM-GLI1微型热泳实验第页和滴定MBP-SUFU构建物，显示三个单独实验的平均值。所有蛋白质都具有相似的亲和力，但FAM-GLI1的热泳特性第页MBP-SUFU-FL构造和MBP-SUFU构造之间的修改不同-Δ和MBP-SUFU-SH结构，反映了形状上的差异。

三种SUFU结构体对GLI1的亲和力_第页使用FAM标记的GLI1更准确地测定_第页肽（FAM-GLI1_第页; 补充表S1b条)微尺度热泳（Wienken等。, 2010)实验（图4b条). 这个K_d日所有三种结构的推导值是可比较的；然而，肽的热泳性质被不同地修饰：与MBP-SUFU-FL结合增加了热泳梯度的运动速度，与MBP-SUFU结合-Δ或MBP-SUFU-SH降低了它。由于热泳动性受分子电荷、大小和溶剂化壳的影响（Wienken等。, 2010)由于MBP-SUFU-FL和MBP-SUFU-SH具有相同的理论大小和电荷，这些数据进一步表明，天然IDR的行为与GLI1上的随机残基序列不同_第页结合。

哺乳动物细胞或细菌中表达的SUFU的SDS-PAGE分析提供了IDR独特结构特性的额外证据。尽管具有相同的氨基酸组成，全长SUFU（SUFU-FL）显示不同的电泳迁移率两个SUFU结构，其中IDR残基交替洗牌（SUFU-SH和SUFU-S2；补充表S1一和补充图S7b条和7c（c）). 对于翻译后修饰、非典型氨基酸组成和无序片段（Iakoucheva等。, 2001). 质谱分析未发现MBP-SUFU-FL中有任何翻译后修饰肽，包括肽类涉及Ser342和Ser346（数据未显示），这些残基据报道是哺乳动物细胞中磷酰化的靶点（Chen等。, 2011). 总之，这些数据表明，电泳迁移的差异很可能是由于天然IDR的不同结构特性造成的。

3.3、。SUFU与GLI肽复合物的结构

为了确定SUFU如何与GLI转录因子相互作用，我们尝试共结晶MBP-SUFU-FL和MBP-SUFU-Δ带GLI1_第页以及相应的肽类来自人类GLI2（GLI2_第页; 残基267–283）和GLI3（GLI3_第页; 残留物328–344）（补充表S1b条). 尽管进行了广泛的筛查，但这些尝试均未成功。因此，在MBP-SUFU中，SUFU的残基WLG61-63被突变为DSF-Δ破坏SUFU N端结构域内的环和C端结构域中的残基之间的晶体接触（补充图S2b条)之前牵涉到GLI绑定（商户等。, 2004). 此外，SUFU中的另一个柔性环被缩短，MBP部分的残基216和220被突变为组氨酸，以促进金属离子介导的融合蛋白结晶（Laganowsky等。, 2011). 结果构造MBP_{A216H_K220H型}-SUFU公司-Δ_{W61D_L62S_G63F_P453A型_Δ454–456_K457A}，用GLI1生成晶体_第页和GLI3_第页衍射到2.8°分辨率(R（右）= 19.7%,R（右）_自由的=23.4%和R（右）= 20.1%,R（右）_自由的分别为23.4%）。两种晶体肽类属于空间组 P（P）2₁其中含有四个分子非对称单元都表现出旋转，通过柔性连接器，相对于apo晶体结构58°（图5一以及补充视频S1）。每个分子的结构域之间的肽都有明确的密度（图5b条). 模拟到该密度的肽形成β-股夹在两个域之间，形成一个连续的13股β-跨越两个域的板材。SUFU His164和Glu376之间的相互作用确保了闭合构象（图6一). HDX保护分析和SAXS实验证实，这种蛋白质/肽构象发生在溶液中，不是结晶伪影（图7，补充表S2和补充图S6、S8和S9）。在这两种结构中，GLI肽与来自SYGH基序（Dunaeva等。, 2003; GLI1中的His123和GLI3中的His336）突入口袋，在口袋中与Tyr147和Asp159形成氢键相互作用（图6b条和6c（c）以及补充表S3）。MBP-SUFU-FL中Tyr147、Asp159或Glu376的突变消除了与GLI1的可检测结合_第页在微型热泳分析中（数据未显示）。为了确定这些结合差异是否转化为细胞中的功能差异，我们检测了用突变的SUFU构建体瞬时转染的HEK 293细胞中GLI1的转录活性（图6d日). Asp159和Tyr147突变对SUFU抑制GLI的能力有显著影响，而Glu376和His164突变的影响较小。在测量组成性Hh途径活性的实验中观察到类似的模式苏福^−/−MEF（图6e（电子）). 值得注意的是，紧跟在GLI SYGH基序之后的亮氨酸也是完全保守的，它紧密地包裹在SUFU残基Val269、Ala271和Leu380形成的疏水口袋中（图6b条). 以下丝氨酸（除爪蟾和玻璃海鞘)与Glu376氢键结合。与这些观察结果一致，终止于His336（GLI3）的GLI3肽_第页-SHC；残留物328–336；补充表S1b条)无法在HDX实验中保护MBP-SUFU-FL免受氘化（数据未显示）。因此，关键的结合主题超出了先前描述的（Dunaeva等。, 2003).

图5 MBP的晶体结构2016年2月22日-SUFU公司-ΔW61D_L62S_G63F_P453A型_Δ454–456_K457A与GLI3复合第页。(一)apo（黄色，带灰色接头）和肽结合（米色，N-末端结构域；绿色，C-末端结构域；紫色接头）结构的N-末端结构域的叠加显示C-末端结构域旋转58°通过灵活的连接器。(b条)GLI3的位置第页在MBP中-216H_220H（小时）_-SUFU公司-ΔW61D_L62S_G63F_P453A型_Δ454–456_K457A–肽共晶体。平均井涌OMIT图等高线为3.0σ显示GLI3的明确密度第页位于β--SUFU N端域（米色）和C端域（绿色）。

图6 GLI结合机制。(一,b条,c（c）)MBP之间的相互作用A216H_K220H型-SUFU公司-ΔW61D_L62S_G63F_P453A型_Δ454–456_K457A和GLI3第页(一)肽（蓝色）夹在N端（米色）和C端（绿色）结构域之间。(b条)GLI3公司第页（蓝色残留物标签）在通道中结合，His336和Lys337突出到深口袋中。(c（c）)SUFU–GLI3公司第页侧链氢键以黄色突出显示的相互作用，以及GLI1的比较第页和GLI3第页。GLI1、GLI2和GLI3中保守的残基以红色显示。蓝色方框表示具有可见电子密度的残基。(d日,e（电子）)GLI3周围的突变第页结合位点对SUFU-FL抑制GLI1诱导的HEK 293细胞报告基因活性的能力有不同的影响(d日)并抑制苏福−/−单元格(e（电子）).

图7 MBP-SUFU和GLI肽在溶液中以与晶体中相同的方式相互作用。(一)MBP-SUFU-FL与GLI3的HDX分析第页（蓝色）。在存在肽的情况下，更不易被交换的区域以粉红色突出显示。(b条)MBP-SUFU的SAXS信封比较-Δ在GLI1缺席（左）和在场（右）的情况下第页.apo MBP-SUFU的晶体结构-Δ和MBPA216H_K220H型-SUFU公司-ΔW61D_L62S_G63F_P453A型_Δ454–456_K457A与GLI3共结晶第页分别在apo和holo SAXS包络上叠加良好。

3.4. SUFU IDR的监管作用

MBP-SUFU结构体与不带IDR结构体之间观察到的物理差异表明该结构域具有功能性作用。与热泳数据一致，在与SUFU-FL、SUFU-SH和SUFU的联合免疫沉淀（co-IP）实验中观察到的GLI1结合没有显著差异-Δ（图8一). 同样，GLI1和GLI2诱导的转录活性被SUFU-FL、SUFU、-Δ和SUFU-SH在瞬时转染分析实验中（图8b条和补充图S10一和S10b条)IDR的缺失对Hh通路组成活性的抑制没有显著影响苏福^−/−MEF（图8c（c）). 总之，这些结果表明，SUFU中的IDR对于没有上游通路激活的细胞中GLI结合和抑制活性是不必要的。

图8 IDR调节SUFU活性。(一)SUFU-FL（佛罗里达州）、SUFU-Δ(Δ)如co-IP所示，当在Cos-7细胞中共同表达时，SUFU-SH（SH）均与GLI1结合。(b条,c（c）)SUFU-FL和SUFU-Δ抑制GLI1诱导的HEK 293细胞报告基因活性(b条)并抑制苏福−/−单元格(c（c）)具有类似的效率。(d日)SUFU公司-Δ、SUFU-SH和SUFU-IDR飞（印尼盾飞)以表示苏福−/−细胞无法介导由SMO激动剂SAG诱导的Hh途径重新激活。误差条表示三个平行样本中的数据范围。(e（电子）)有完整IDR和无完整IDR的SUFU监管作用示意图模型。绿色和红色分别表示蛋白质的激活和抑制状态。

IDR的多才多艺使其成为形成蛋白质-蛋白质相互作用的理想工具，而内在无序延伸通常作为蛋白质的调节平台（Babu等。, 2011). 因此，我们开始测试SUFU IDR是否在苏福^−/−MEF公司。当使用SMO激动剂（SAG）激活细胞时，SUFU上游的Hh通路激活剂超越了全长蛋白的抑制，但在SUFU存在时，它无法重新激活通路-Δ或SUFU-SH(第页≤ 0.005,n个=10和第页≤ 0.01,n个分别=4；图8d日). 另一种小分子SMO激动剂Purmorphamine和Sonic Hedgehog（Shh）对SUFU-FL和SUFU具有相同的不同作用-Δ抑制功能(第页≤ 0.05,n个=5和第页≤ 0.005,n个对于吗啡胺和Shh，分别为9；补充图S10c（c）和S10d日). 总的来说，这些结果与哺乳动物细胞Hh活化的简单模型一致通过依赖IDR抑制SUFU功能（图8e（电子）).

Sufu在调节Hh信号传导中的作用在脊椎动物和无脊椎动物之间有所不同（Varjosalo等。, 2006). 然而哺乳动物SUFU是一个主要的负调控因子，其基因敲除是致命的（库珀等。, 2005; 斯瓦德等。, 2006),果蝇属Sufu的作用很小，功能丧失突变没有表现型（Préat，1992）). 序列比对显示，IDR是人类和果蝇属与其他蛋白质的42%相比，Sufu只有11%的序列保守性。然而，尽管缺乏序列保守性果蝇属预计苏福也具有相对较少的二级结构（补充图S11）。为了测试SUFU IDR在人类和苍蝇之间的调节作用是否保守，我们创建了一个嵌合SUFU构建体，其中人类SUFU的279-360氨基酸被来自果蝇属Sufu（残留物275–340；Sufu-IDR_飞; 补充表S1一). 与SUFU类似-Δ和SUFU-SH、SUFU-IDR_飞能够抑制GLI活性，但SAG的加入不能减轻这种抑制（图8d日). 因此，SUFU中IDR的进化可能与物种之间SUFU的不同作用密切相关。