2.1、。蛋白质制备和结晶

CMY-10的基因是化学合成的，随后如前所述进行亚克隆和纯化（Lee等。, 2004). CMY-10晶体是在含有18%聚乙二醇8000，0.1的沉淀溶液中生长的M（M）二甲氨基甲酸钠pH 6.5，0.2M（M）乙酸锌采用微滴结晶法脱水。

这个托尼_0340的基因onnurineus嗜热球菌NA1被克隆到pET22b-CPD 10H中，pET22b（Novagen）的一种内部修饰形式，以表达与His融合的蛋白₁₀-C末端标记的CPD（半胱氨酸蛋白酶域）（Shen等。, 2009). 融合蛋白表达于大肠杆菌BL21（DE3）RIPL菌株（Novagen），310 K。细菌裂解物在缓冲液中通过超声处理制备A类由20 m组成M（M）Tris–HCl pH值7.5100 mM（M）氯化钠，5米M（M） β-巯基乙醇。通过离心分离出的澄清的裂解产物被装入装有HisPur钴树脂（Thermo）的色谱柱中，并用缓冲液清洗A类含10mM（M）咪唑。他的On-gel自动清洗₁₀-标记的CPD是通过将树脂与缓冲液一起孵育来进行的A类含100mM（M）在室温下植酸2小时，激活CPD的蛋白酶活性。用缓冲液洗脱TON_0340A类并用HiTrap Q HP柱进一步纯化（GE Healthcare）。结晶时，将最终样品浓缩至9 mg ml⁻¹在20 m的缓冲溶液中M（M）Tris–HCl pH值7.5100 mM（M）氯化钠，1米M（M）二硫苏糖醇。使用5%的沉淀剂溶液，通过悬挂滴蒸气扩散法获得晶体(v（v）/v（v）)异丙醇，100 mM（M）乙酸钠pH值5.0，350 mM（M）295 K下的乙酸锌。

蛋清溶菌酶购自BIO Basic Inc.，使用时无需进一步纯化。溶菌酶晶体是在295 K下用微滴结晶法生长的。由1µl蛋白质溶液（20–50 mg ml）组成的小滴⁻¹)等量的沉淀溶液由1组成M（M）氯化钠，0.1M（M）在72 well HLA板（Nunc）中，在硅油和石蜡油的1:1混合物层下用吸管吸取pH 4.0的柠檬酸。

2.2. 数据收集

使用日本光子工厂微焦点光束线PF-17A上的ADSC Quantum 270 CCD，在1.2825 Au（峰值）、1.2828 Au（拐点）和1.1700 Au（高能远程）波长下收集CMY-10的2.1 Au分辨率MAD数据集。对于每个数据集，收集了180张振荡宽度为1°的衍射图像，晶体到探测器的距离设置为180 mm（表1).

表1 数据收集，精炼和分阶段统计 括号中的值表示外壳。   厘米-10 托尼_0340 溶菌酶 蛋白质 峰 弯曲 远程 SAD公司 SAD公司 数据收集  “空间”组 P（P）21 P（P）21 P（P）21 P（P）4三212 P（P）4三212  波长（Ω） 1.2825 1.2828 1.1700 1.2822 1.2829  单位-细胞参数（Ω，°） 一= 49.59,b条= 50.15,c（c）= 62.53,β= 103.66 一=b条=107.44，c（c）= 355.03 一=b条= 79.10,c（c）= 36.82  分辨率（Ω） 50–2.10 (2.18–2.10) 50–2.10 (2.18–2.10) 50–2.10 (2.18–2.10) 50–2.30 (2.34–2.30) 50–1.80 (1.85–1.80)  完整性（%） 97.4 (90.9) 99.8 (99.2) 99.7 (99.1) 99.6 (99.2) 99.9 (100)  R（右）合并†（%） 9.5 (29.5) 11.6 (60.7) 10.9 (55.3) 12.3 (48.7) 7.2 (21.8)  〈我/σ(我)〉 21.9 (3.8) 14.5 (1.8) 14.0（1.8） 21.3 (3.5) 73.7 (16.4)  多重性 4.7 (3.2) 3.4 (3.0) 3.4 (3.2) 12.7 (8.2) 13.4 (12.9)  〈d日每个壳体的〃/sigõ‡ 4.53, 4.28, 3.55, 2.78, 2.63, 2.06, 1.84, 1.62, 1.41, 1.27, 1.24 2.45, 1.88, 1.60, 1.48, 1.38, 1.11, 1.01, 0.97, 0.95, 0.92, 0.99 3.04, 2.33, 1.98, 1.65, 1.42, 1.15, 1.01, 0.93, 0.88, 0.90, 0.97 9.60, 5.71, 4.02, 3.06, 2.21, 1.77, 1.40, 1.17, 0.97, 0.85, 0.74 7.54, 7.98, 6.31, 3.85, 3.41, 3.55, 3.24, 2.80, 2.45, 1.90, 1.37 阶段性统计  最终建模的锌站点数量 12 53 三  现场占用率§ 0.99, 0.86, 0.81, 0.79, 0.64, 0.62, 0.59, 0.53, 0.45, 0.44, 0.40, 0.33 0.35–1.00 0.66, 0.49, 0.48  FOM公司§   DM之前 0.45 0.33 0.42   DM之后 0.62 0.55 0.62  模型–映射CC§ 0.81 0.84 0.89 精炼统计  分辨率范围（Ω） 50–2.10 50–2.30 50–1.80  反射次数 37619 87763 20533  原子数   蛋白质 2652 12042 995   氯离子     8   乙二醇     1   锌离子 12 53 三   醋酸盐 24       水域 220 1443 112  R（右）工作/R（右）自由的¶（%） 19.5/22.8 第22页第3页/第28.1页 18.3/20.8  R.m.s.偏差††   粘结长度（Ω） 0.005 0.012 0.005   结合角（°） 1.3 1.5 1.3 †R（右）合并=，其中我我(香港特别行政区)是观察到的反射强度香港特别行政区和〈我(香港特别行政区)\9002；是对称等效反射的平均强度。 数据来源SHELXC公司（谢尔德里克，2010年). §分阶段计划的数据。 ¶R（右）工作=.R（右）自由的使用5%的反射进行计算。 ††键长和角度的R.m.s.偏差是与理想值的偏差。

使用韩国浦项光源光束线4A上的ADSC Quantum 315 CCD在锌吸收峰处收集了TON_0340的2.3º分辨率SAD数据集（表1). 为了避免因长c（c）的轴单位电池，我们使用了一个90°弯曲的金属销来对齐c（c）沿着主轴轴线，收集了200张1°振动图像，晶体到探测器的距离设置为300 mm（覆盖200°振动），这些图像不受金属销的干扰（表1).

在日本光子工厂微焦点光束线PF-17A上，使用ADSC Quantum 270 CCD在1.2829º的波长下收集了1.8º分辨率的蛋清溶菌酶SAD数据集。共收集了180帧1°振荡，晶体到探测器的距离设置为176 mm（表1).

2.3. 数据处理和阶段划分

衍射数据使用DENZO公司和电子秤组件来自香港（HKL）-2000程序套件（Otwinowski&Minor，1997). CMY-10和溶菌酶的实验阶段用自动扫描程序（Terwilliger等。, 2009)在中菲尼克斯套房（亚当斯等。, 2010)，这是一个结合了海斯(混合子结构搜索; Grosse-Kunstleve&Adams，2003年)寻找重原子站点，相位器（麦考伊等。2007年)或解决方案（特威利格，2002年)用于计算实验阶段和RESOLVE（解决）（特威利格，2002年)用于密度修改和模型构建。TON_0340的实验定相使用自动SHARP（冯海因等。2007年)，一个包含重原子的自动结构求解系统精炼和分阶段计划夏普（de La Fortelle&Bricogne，1997）)、密度修改程序所罗门群岛（亚伯拉罕和莱斯利，1996年)和果皮/弯曲包装（Perrakis等。, 1999)用于自动建模和精细化。阶段化计划中的自动构建模型使用库特（埃姆斯利和考坦，2004年)和精炼使用最大似然算法实现于中枢神经系统（布伦格等。, 1998).

3.1. 锌与蛋白质表面结合的观察

我们遇到了一篇描述锌与蛋白质结合的论文，该蛋白质没有固有的锌结合位点，其晶体生长在含有乙酸锌的沉淀溶液中（Axelrod等。, 2010). 根据晶体结构这是根据硒测定的反常散射（PDB条目3时50分)，四个锌离子与表面暴露的天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸残基结合。蛋白质表面锌离子的存在让人联想到晶体结构CMY-10（PDB条目1千焦)事先确定（Kim等。，2006年). 这种蛋白质的晶体也在醋酸锌的存在下生长（Lee等。, 2004)及其晶体结构蛋白质表面含有与组氨酸咪唑环、天冬氨酸/谷氨酸的羧基或天冬酰胺/谷氨酰胺的酰胺基紧密结合的锌离子。在这两种晶体结构中，大多数锌离子与组氨酸残基结合，表明组氨酸是蛋白质表面锌配位的首选残基。锌离子以四面体几何形状配位，但与天冬酰胺以八面体几何形状结合的锌离子除外。有趣的是，一个氨基酸残基这足以结合锌离子，因为水或醋酸盐分子也参与了配位。

3.2.结构确定使用锌反常散射的CMY-10

我们测试了来自结合到CMY-10表面的锌离子的异常信号是否足以进行相位测定。A 2.1º分辨率MAD数据集（表1)从一个晶体中以三个波长收集，该晶体在短暂浸泡在含有15%葡萄糖、18%葡萄糖的低温保护剂溶液中后在100K的低温流中冷却(w个/v（v）)聚乙二醇8000，0.1M（M）二甲氨基甲酸钠pH 6.5，0.2M（M）乙酸锌脱水。CMY-10晶体，每个非对称单元，属于单斜空间组 P（P）2₁，带有单位-细胞参数一= 49.6,b条 = 59.2,c（c）= 63.5 Å,β= 103.7°. 异常信号，使用〈进行评估d日〃/sig \9002；是异常信号强度的良好指示器，在所有三个数据集中的分辨率均为2.1º，如预期的那样，峰值数据集的分辨率最强（图1). 这个自动扫描该计划确定了13个锌站点，占用率在0.19–0.99之间，并生成了一个优值（FOM）为0.45的相位集。通过密度调整，相位得到进一步改善，最终FOM为0.62。实验电子密度图非常清晰（图2)和一个模型R（右）_工作/R（右）_自由的自动生成了0.2501/0.2784。这些结果表明，表面结合的锌离子可以成功地用于MAD法的相测定。

图1 〈d日〃/sigõ图来自SHELXC公司作为分辨率的函数。

图2 实验电子密度图代表部分的立体图，等高线为1σ用于CMY-10(一)，桶_0340(b条)和溶菌酶(c（c）).

3.3.结构确定使用锌反常散射的TON_0340

最近，我们在含有乙酸锌的沉淀溶液中获得了TON_0340晶体。基于我们对锌衍生化和相测定的信心，我们收集了2.3Å分辨率的SAD数据集（表1)将晶体浸泡在含有20%甘油、5%甘油的低温保护剂溶液中，然后在100K的低温流中冷却(v（v）/v（v）)2-丙醇，100 mM（M）乙酸钠pH值5.0，350 mM（M）乙酸锌。TON_0340晶体，每个晶体包含六个分子不对称单元，属于正方的空间组 P（P）4_三2₁2，带单位-细胞参数一 = b条 = 107.44,c（c）= 355.03 Å. 根据〈图d日英寸/符号对分辨率，存在锌异常信号，尽管在高分辨率下显著降低（图1). 在非对称单元由此产生的相位集，以0.33的FOM为特征，产生了一个清晰可解释的电子密度图（图2)导致自动构建模型R（右）_工作/R（右）_自由的0.27/0.31。与上述其他情况一样，锌离子与蛋白质表面的天冬氨酸、谷氨酸盐和组氨酸相关。此外，与六个酸性残基簇结合的三个锌离子位于一个假定的活性位点间隙中。

3.4.结构确定利用锌反常散射研究溶菌酶

在上述两种情况下，结晶溶液中存在锌离子。我们通过将蛋白质晶体浸泡在含有锌离子的溶液中，测试了蛋白质表面是否能被锌离子充电。首先在由1M（M）氯化钠，0.1M（M）柠檬酸盐pH 4.0。然后将溶菌酶晶体转移到由50 mM（M）乙酸锌，1M（M）氯化钠，0.1M（M）MES pH 6.5，25%乙二醇。我们将pH值从4.0更改为6.5，以脱质子组氨酸，这似乎是最适合与锌离子结合的残基。浸泡10分钟后，安装溶菌酶晶体，并使用低温流冷却器在100 K下对晶体进行闪蒸冷却。进行荧光扫描以定位锌K（K）边缘和1.8°分辨率的SAD数据集在1.2829°的波长下收集（表1). 溶菌酶晶体非对称单元，属于正方的空间组 P（P）4_三2₁2，带单位-细胞参数一 = b条= 79.19,c（c） = 36.82 Å. 异常信号在整个分辨率范围内都很高（图1).

SAD阶段化产生的实验阶段信息质量较高；密度修正前后的FOM分别为0.42和0.64。根据实验相计算的电子密度图很容易解释（图2)和一个几乎完整的模型R（右）_工作/R（右）_自由的自动生成0.1856/0.2323。锌结合溶菌酶和无锌溶菌酶（PDB条目）之间所有原子的平方根偏差2里兹; 戴蒙德，1974年)只有0.85μl，表明锌结合对结构没有影响。尽管阶段化计划确定了21个锌离子，但最终对三个锌离子（Zn1、Zn2和Zn3）进行了建模（表1). Zn1由Asp52和三个水分子以四面体几何形状配位，而Zn2由His15和五个水分子在八面体几何形状中配位（图3). 在Zn3的情况下，锌离子以四面体几何形状与四个水分子相互作用，其中两个配位水分子与主链N原子形成弱氢键（图3). Zn3的弱结合反映在其B类系数（56.86º²)高于Zn1（31.92º²)和Zn2（38.63º²). 成功的锌SAD定相表明，通过晶体浸泡对蛋白质表面进行锌衍生是从头开始 结构测定在没有锌离子的情况下晶体生长的蛋白质。

图3 5处的异常傅里叶映射σ水平(一)，密度修正后的实验电子密度图(b条)和最终2F类哦负极F类c（c）地图(c（c）)在1σ在最终溶菌酶模型中锌结合位点上叠加的水平。锌离子和水分子分别用蓝色和红色球体表示。

3.5. 蛋白质数据库调查

我们观察到来自结晶溶液的锌离子与表面暴露的残留物结合。为了确定这一观察的普遍性，我们在蛋白质数据库中搜索了在含有乙酸锌的溶液中生长晶体的蛋白质。在收集了43个案例后，搜索停止了（见补充材料¹)因为所有的病例都与我们的观察结果一致。毫无例外，锌离子与表面残基有关，如组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺。在收集的案例中，我们发现三种结构被锌解决MAD阶段[PDB条目第1页，共9页（图尼克利夫里博尔迪等。, 2001),2频道9（舒特尔科夫等。，2006年)和3cjj公司（科赫等。, 2010)]. 这三种蛋白不是锌结合蛋白，但尝试了阶段化方法，因为锌离子对结晶至关重要。其中有两个、四个和五个锌离子第1页，共9页,3cjj公司和2频道9建筑物，其占用范围为0.2至1。而其他蛋白质结构由分子置换或基于硒的MAD/SAD相位，我们的实验证明表明，它们的结构可以通过利用锌异常信号来确定。对43例患者结晶条件的调查表明，乙酸锌的浓度范围为3至300 mM（M），表明可以在不同的锌浓度下制备锌结合的晶体。本调查揭示的缓冲液pH值范围为4.5–8.3，这可能表明锌结合条件的极限，因为锌结合残留物在低pH下质子化，溶液中的锌在高pH下沉淀。

总之，我们证明了在锌离子存在下生长的蛋白质晶体或浸泡在含锌溶液中的蛋白质晶体很容易被蛋白质表面的多个锌离子充电，并且它们适合于锌SAD/MAD阶段化。实验和模拟显示了每个完全占据的锌原子570个氨基酸的相位效应MAD阶段表明一个锌位点能够为多达1100个氨基酸提供足够的实验相信息（Meyer等。，2006年). 考虑到高定相有效性和多个锌结合位点，我们认为蛋白质表面的锌衍生化是一种基本上未被注意但有前途的蛋白质晶体相测定方法。