2.3.1. 增强EDNA公司晶体表征工作流程

MX波束线ODA最著名的自动化可能是样本特征化。两者都有DNA（莱斯利等。, 2002)，以及最近EDNA公司（印加等。, 2009)，最初的目标是自动化获取参考图像的序列，描述这些图像的特征，并计算优化的数据收集策略，同时考虑到用户需求和辐射损伤。在ESRF中，自2005年起，用户就可以实现此类特征的自动化（Beteva等。, 2006). 当前实现的缺点是，如果参考图像没有得到最佳收集（例如，使用不正确的曝光时间、振荡宽度和/或检测器分辨率），那么即使不是不可能，也很难计算最佳数据收集策略。EDNA公司/最好的可以给出最佳探测器分辨率的建议（波波夫和布伦科夫，2003); 然而，用户必须手动遵循建议的值并重新启动收集和特征化管道。这种工作流程的复杂性超过了实验控制软件的能力，在这种工作流程中，ODA结果被反馈给仪器控制并导致新的硬件操作。使用DAWB公司，我们通过简单地添加自动重新收集具有不同曝光时间或振荡值和检测器分辨率的参考图像的可选步骤（图3). 如果工作流以交互模式运行，用户可以在特定阶段轻松干预和中断工作流，并通过中显示的提示更改建议的新数据收集参数MXCuBE公司，如果需要。使用工作流工具，设计新的实验协议或现有协议的扩展，例如增强特征化，变得简单，因为ODA和波束线操作所需的所有工具都可用并且可以组合。这种对表征管道的自然增强早就有需求，但尚未实现。使用DAWB公司，它的创建和部署只花了一天时间。

图3 增强特性的工作流。通过将后续步骤和相关步骤耦合到复合参与者中，例如那些蓝色的参与者，实验协议的更高级别逻辑序列得以保留，并清晰地呈现给非编程人员。

2.3.2. 晶体辐射灵敏度测量工作流程

MX中数据采集期间发生的辐射损伤限制了从单晶中获得的信息（例如，参见Garman，2010; Krojer&Delft，2011年). 因此，考虑辐射损伤效应对于优化数据收集规划至关重要。大多数辐射损伤现象与吸收剂量成正比，如果实验条件已知，则可以准确预测。X射线束大小、轮廓和通量，与样品化学成分的知识一起，对于使用放射性核素（Paithanar和Garman，2010年). 当样品灵敏度或光束通量校准不确定时，需要一个可靠的实验协议来经验校准线性损伤模型。这个过程需要牺牲整个晶体或部分晶体。它包括通过反复将晶体暴露在X射线下来测量样品或部分样品的损坏程度（Leal等。, 2011). 这种确定晶体辐射灵敏度的协议已经在DAWB公司在初始参考数据收集之后，EDNA公司提供了一个晶体燃烧策略计划，包括11次连续收集相同的3°楔形数据（收集周期），交错使用较长的X射线照射来燃烧晶体（燃烧周期）。然后，工作流会立即对每个步骤后收集的图像进行分析（图4一). 工作流的易用性减轻了对束线仪器设备和并行处理晶体学软件调用的连续请求的计算实现负担。然后，从该协议中提取的辐射敏感性信息可直接用于数据收集策略的优化规划，该策略考虑到预测的辐射损伤诱导的衍射强度衰减。将此工作流收集到复合参与者中，可以在中重用该过程DAWB公司通过在不同位置的数据收集策略计算期间牺牲部分晶体以应用正确的晶体衰变模型来进一步增强晶体特性。使用具有已知辐射灵敏度的测试晶体，该程序也可用于光束线，以验证和校准通量和光束尺寸（Leal等。, 2011).

图4 (一)辐射敏感性工作流程和(b条)其输出图如下所示DAWB公司对于立方胰岛素晶体。标记显示测量值，而拟合曲线用实线表示。总体B类因子用蓝色表示，相对刻度用红色表示，相对平均积分强度用绿色表示。线性拟合曲线应用于两个整体B类因子和相对尺度，而相对平均积分强度则用指数曲线拟合。水平轴显示计算的剂量(放射性核素). 辐射损伤敏感性系数(β= 0.8 Å2 MGy公司−1)和相对比例尺拟合线的斜率(Δ=-0.027 MGy−1)显示在图的底部。

要通过测试程序DAWB公司在实际条件下，一种立方胰岛素晶体属于空间组 我2₁3，带单位-细胞参数一 = b条=c（c）=77.93 Au，根据Nanao的描述获得等。(2005)已使用。在ESRF光束线ID14-4（McCarthy）上进行测量等。, 2009)，其中安装了ADSC Q315探测器。光束大小由两个狭缝定义，并在样品位置垂直设置为100µm，水平设置为100μm。入射的能量为13.2keV的单色光束具有通量2.7×10¹² 光子⁻¹在没有指定样品的确切化学成分的情况下应用剂量计算程序，即假设EDNA公司平均蛋白质晶体的默认成分（47%溶剂，0.05 S原子/氨基酸残基和300米M（M）缓冲溶液中的硫酸盐）。获得的系数(β= 0.8 Ų MGy公司⁻¹)可用于通量和光束尺寸校准（图4b条). 据Kmetko介绍等。(2006)，所有蛋白质晶体在100 K时都可能具有相对的辐射敏感性，对吸收剂量的敏感系数（在两倍以内）约为β≃ 1 Ų MGy公司⁻¹因此，获得的值与Kmetko的观察结果一致等。(2006)并支持使用此程序验证波束线校准。作为一个复合参与者，该协议可以很容易地在其他工作流中重用，例如束线校准后的验证步骤，或作为自动束线测试程序中的常规项目。

2.3.3. Kappa重新定位工作流

在MX（Brockhauser）的不同情况下，使用卡帕测角仪进行晶体重新定向是有利的等。, 2011). 其中包括Bijvoet反射对（反射和弗里德尔对对称等价物，例如hkl和)，可以在同一衍射图像上通过沿主轴适当对齐偶数倍对称轴来测量。因此，可以同时测量异常差异和辐射损伤诱导的非同构（布莱克等。, 1962; 亨德里克森，1991年)在这些Bijvoet对内，可以最小化，从而对异常差异进行更准确的测量。对齐特定对称轴可以在较小的旋转范围内收集完整的数据集（Dauter，1999)从而使总剂量更低，导致更少的严重辐射损伤。图5显示了对齐对称轴的优点。使用该程序进行了比较仿真（基于ESRF波束线ID23-1的实验数据）最好的（布伦科夫和波波夫，2010年)用于胰蛋白酶(P（P）三₁21）和索姆丁(P（P）4₁2₁2） 以显示如何减少异常信号中的噪声。另一个有利的晶体重新定向的例子是倒易空间，通常对应于最长的单位-细胞轴。通过将此轴与主轴平行对齐，可以最大限度地减少斑点的重叠（Dauter，1999).

图5 晶体取向对Bijvoet配对间可实现最小噪声影响的模拟，表示为R（右）弗里德尔= 〈|〈E类2+〉 − 〈E类2−〉| \9002；，其中〈E类2+\9002；和\9001E类2−〉是绘制为分辨率函数的Bijvoet配对的归一化平均强度。计算由程序执行最好的在以下情况下辐射损伤效应的解释(一)胰蛋白酶，空间组 P（P）三121，和(b条)索默丁，空间组 P（P）41212

精密卡伯角度计和正确校准的反向卡伯角度仪（Brockhauser等。, 2011)例如EMBL/ESRF MiniKappa，支持样品重新定向，同时保持晶体的中心位置，这允许将其用作纯旋转角度计（Paciorek等。, 1999). 确定样品的初始方向（涉及衍射图像的测量和索引）后，可以计算出一组首选方向和测角仪设置所需的变化。使用STAC公司（麦卡锡等。, 2009)带有MOSFLM公司或XDS公司在ESRF MX波束线上，可以手动执行此程序(http://go.esrf.eu/MiniK网站). 数据处理工具，例如EDNA公司或RAPD标记（库里诺夫等。, 2011)，允许重新定向的自动计算，但该过程涉及使用几个不同的软件包和波束线GUI。国际卡帕工作组(http://www.epn-campus.eu/kappa/)定义了kappa测角仪自动使用的协议。这是一个三步迭代协议，包括样品的初始表征、一组优选取向的计算、衍射质量测试和预测不同取向的数据收集统计，直到获得满意的结果。尽管EDNA公司用于重新定向计算的插件是在2009年准备的，由于控制系统的实现非常复杂，即使是很小的更改也可能导致无法预见的问题，因此无法在波束线上构建和提供集成管道。在这样的环境中，即使是很小的修改也需要大量的测试。使用中的工作流工具在一周内（从该周开始，光束线上分配了一天）DAWB公司中实现的所需数据分析工具EDNA公司与用于光束线准备和测角仪设置的实验控制元件相结合，GUI用于启动数据采集、收集参考图像和完整数据集，并激活样品观察摄像机以在重新定向期间监测样品。图6显示了此工作流的实现快照使用此工作流程，可自动表征样品，优化光束线和探测器设置以及测角仪设置，并收集建议的完整数据集。实现的工作流提供了一个菜单，允许选择中定义的重新定向目标EDNA公司用户可以根据样品的需要选择最合适的策略`“最小总振荡”允许晶体重新定向，因此收集单扫描完整数据集需要最小总振荡。“单元”选项沿主轴对齐相互的单元-单元轴。此选项对于验证晶体对称性以及调查斑点重叠非常有用。选项“异常”沿主轴对齐偶数倍对称轴，以测量同一图像上Bijvoet对之间的异常信号。最后，“Smart Spot Separation”（智能点分隔）选项通过在数据采集期间避免盲区，最大限度地实现点分隔，同时保持尽可能高的完整性。这是通过在接近最佳取向时，晶体最长的单元-细胞边缘轻微错位来实现的。

图6 kappa重新定向工作流程，包含从相同FAE晶体在不同方向捕获的衍射图像示例。左侧的蓝色图像是在初始随机方向的步骤1中拍摄的。右侧的蓝色图像是第2步中对齐方向的参考图像，以优化此方向完整数据采集的策略。红色背景图像在步骤3中作为最终数据集的第一张图像。

用户界面在工作流的不同步骤中定义，用于验证样品位置和测角仪设置，以及审查建议的光束线设置和数据采集参数（参见补充材料¹面向用户界面参与者；以绿色突出显示）。在“自动模式”的情况下，工作流引擎跳过这些预定义的用户交互步骤，自动运行整个协议。在以下示例中，阿魏酸酯酶（FAE；Davies）的长杆状（150×150×400µm）晶体等。, 2001;空间组 P（P）2₁2₁2₁; 单元-单元参数一 = 65.72,b条= 108.94,c（c）= 113.59 Å,α= 90,β= 90,γ= 90°; 镶嵌度为0.4°）。初始参考图像采集后（见图6，步骤1）角度计角度为零时，重新定向(ω= 224.9°,κ = 75.2°,φ=200.3°），建议对齐一*沿着主轴和b条*根据“Cell”请求沿着梁。图6（步骤2）显示了在此方向上收集的衍射图案，其中c（c）*沿着横梁。成功重新描述后，建议的数据收集策略在该对齐方向由一个83.3°的楔形物组成，从ω=139°，允许以1.7°的分辨率收集96%的完整数据集。在审查了建议的策略后，最终数据收集在180°外进行，从ω=319°（图6，背景图像），以避免在MiniKappa进入衍射锥时以高分辨率出现的自阴影。只需在180°外开始数据采集，卡伯臂就不会在样品和检测器之间移动。测角仪设置的物理模型允许自动检测此类碰撞或阴影问题，并且可以添加到kappa工作流的全自动使用中，即使在高分辨率实验的情况下也是如此。

晶体重新定向的部署MXCuBE公司标准光束线控制GUI、通过下拉菜单选项的可用性以及指导性的交互步骤将这些实验从仅在危急情况下使用转变为标准数据收集协议。该工作流于2011年9月部署在波束线ID14-4上。图7显示了10月和11月，当工作流可用时，在ID14-4上使用MiniKappa的次数增加了一倍通过 MXCuBE公司。它在ID23-1和ID14-1上的使用率仍然很低，因为没有提供kappa工作流。重新定向的优点有很好的文档记录，其常规使用将允许所有用户受益，而无需专家帮助。

图7 使用MiniKappa的数据采集比率显示为2011年ESRF公共MX波束线上预定波束时间的时间函数。请注意，ID23-2没有常规安装MiniKappa，波束线操作数据库中没有ID29上的MiniKampa用法。

2.3.4. 网格扫描工作流

现在结构生物学中经常研究的大型多组分复合物和膜蛋白往往会产生非常小的晶体或衍射性质极不均匀的晶体。微聚焦X射线束的可用性不断提高，再加上针对MX优化的实验环境，使得先进的样品评估（Aishima等。, 2010; 保龄球等。, 2010; 希尔加特等。, 2011; 歌曲等。, 2007)和数据收集（Flot等。, 2010; 希尔加特等。, 2011)协议。为了定位非常小的晶体或比X射线束大的晶体的最佳区域，开发了网格扫描，以在网格内指定的多个点收集图像。重复使用为上述其他工作流准备的光束线角色，并集成ODA应用程序，在中开发、测试和部署了必要的工作流MXCuBE公司这比使用传统工具要快得多。简单二维网格扫描的工作流程包括用于光束线准备和测角仪设置的执行器、用于指定网格扫描参数的GUI、从网格点收集图像、分析每个点的数据以及数据的实时图形表示（图8). 使用此工作流程，可以根据衍射质量来表征晶体的整个投影，并以直观的方式自动向用户显示结果。

图8 在预先定心的胰蛋白酶晶体上执行网格扫描工作流程。(一)晶体的同轴显微镜视图。(b条)使用50µm方形光束以57µm步长水平和垂直扫描±225µm感兴趣区域的结果如所示DAWB公司. (c（c）)将扫描结果与用于执行实验的工作流叠加在显微镜视图上。

在380µm长和40µm宽的杆状胰蛋白酶晶体上进行57µm步长的均匀二维网格扫描，每个点使用1°的振荡进行1s曝光。图像立即由标签结果绘制在二维坐标系中，坐标系与样品视轴显微镜对齐，原点位于实际中心点。这个EDNA公司数据模型用于定义完整的数据收集计划，在该计划中，对于要收集的每个楔块，使用一个称为“样本位置”的单独三维向量来描述样本的位置。二维屏幕坐标是轴上查看系统上的位置，根据样本方向和显微镜设置（例如缩放级别）计算每个样本位置的二维屏幕坐标。使用distl.thin_客户端（亚当斯等。, 2010)和distl.mp_spotfinder服务器读取文件使用总积分信号度量来组装作为屏幕坐标的函数的衍射质量的二维图GnuPlot（Gnu绘图）4.4和颗粒物三D类.此图像（图8b条)缩放并叠加在屏幕截图上（图8一)来自MXCuBE公司（图8c（c）). 使用此工作流，水晶很快被找到。该工作流程还可以帮助确定给定投影中最佳衍射晶体体积的位置。其作为不同方向的子工作流的重复应用也可用于自动执行基于衍射的定心或层析成像。