1.简介

高通量蛋白质晶体学可能是一项耗时且资源密集的工作。尽管近年来在该领域取得了许多进展，但使用常见的市售平台筛选合适的结晶条件仍然需要大量的蛋白质和试剂。此外，衍射质量测试和数据收集通常涉及晶体样品的物理提取和低温冷冻，这可能会对晶体的完整性产生重大影响（Garman，1999). 为了获得高质量的衍射数据，必须进一步优化结晶条件和低温保护剂。这些步骤可能很耗时，通常仅限于有经验的用户（Alcorn&Juers，2010). 为了应对这些担忧，过去十年来，以晶体学为目标的微技术，特别是晶化芯片的使用出现了大幅发展。迄今为止，该领域一直以一系列微流体设备为主（Li&Ismagilov，2010）)他们之间最显著的区别之一是他们采用的结晶技术类型。已经开发了几种利用自由界面扩散（FID；Hansen等。, 2002). 其他芯片使用纳米通道来产生反扩散结晶（Hasegawa等。, 2007; Ng公司等。, 2008; 杜伊布等。, 2009)或模拟分批结晶的纳米液滴（郑等。, 2003). 所有这些设备都有两个明显的平行含义。他们都在努力提高hit-identification过程的效率，并提供以下可能性就地X射线分析，在有利的情况下，衍射数据采集结构测定（郑）等。, 2004; 汉森等。, 2006; Ng公司等。, 2008; 五月等。, 2008; 杜伊布等。, 2009)

X-CHIP¹（Chirgadze）等。, 2009)使用另一种方法解决了高通量晶体学的相同挑战，并具有许多独特的附加优势。与微流控芯片不同，结晶过程发生在芯片表面，在一层油下，水性蛋白质和结晶试剂混合物的液滴阵列中。通过使用独特的涂层改变芯片表面，创建具有不同疏水性的特定区域，这些微匹配阵列成为可能。本文介绍了用于设置结晶试验和安装数据采集芯片的设备和配套工具的设计，以及该平台固有的重要优点、局限性和影响。它还描述了将该技术用于晶体生长、目视检查、X射线衍射数据采集和结构测定两个天然的和一个硒代蛋氨酸标记的蛋白质靶点。所给出的结果表明，可以生长出大的衍射良好的晶体，并且高质量的数据集足以满足结构测定可以在家里以及同步加速器X射线源上收集。

2.X-CHIP设计与应用

X-CHIP背后的主要思想是创建一个平台，通过将结晶条件筛选、晶体检查和数据采集放在一个设备上，简化整个过程，消除晶体处理和艰巨的低温技术，从而为传统晶体管道提供一种替代方案（图1). 芯片由一种材料制成，该材料具有视觉光透明度和相对较低的X射线吸收率。厚度为0.375 mm的X-CHIP吸收了约30%的X射线强度初级同步加速器光束的衰减1800–2000次，以避免在数据采集过程中对晶体造成过度辐射损伤。该设备设计为与大多数标准测角仪兼容，可插入芯片座（具有机加工槽）以提供支撑和简单安装。塑料容器可容纳安装在底座上的多个芯片，为结晶液滴的设置、储存和目视检查提供刚性，还可以用特殊的盖子盖住以防止灰尘污染。芯片和支撑工具如图2所示.

图1 X-CHIP的设计和开发是为了替代现有结晶到数据采集过程的传统阶段。

图2 X-CHIP的示意图和图像。(一)24滴格式芯片的俯视示意图；亲水和疏水区域分别以浅灰色和深灰色显示（其他格式包括6滴和48滴；未显示）。(b条)交叉截面芯片的。(c（c）)底座上的X-CHIP和四芯片插座设备。(d日)带有24个结晶液滴的X-CHIP安装在测角仪上。

所述系统应用了微滴结晶法的原理，其高效性和独特优势已在别处描述（D’Arcy等。, 1996, 2003; Chayen，1998年). 在芯片表面，圆形亲水区域以有序阵列的形式刻在疏水环中（图2一和2b条). 将纳升体积的蛋白质水溶液和沉淀剂溶液通过顺序添加混合到亲水环上，然后覆盖一层油，油分布在液滴顶部，并稳定在周围的疏水环上。水相之间的相互作用，油层和涂层表面产生可预测体积和厚度的高度限定的液滴，并防止液滴在结晶设置和数据采集过程中相互融合。芯片的设计目前使用1×6、4×6或4×12格式，其尺寸允许在一张图像中对整个芯片进行目视检查（图3一).

图3 实验结果。(一)初始设置后两周，对天然PA0269的两个结晶条件进行二维优化的4×6 X-CHIP切片。(b条)EphA3晶体隔夜生长，晶体长度约为150µm。(c（c）)使用R-AXIS HTC探测器在Rigaku FR-E旋转阳极发生器上采集的EphA3晶体的芯片上衍射图像。(d日)使用SAD PA0269SM数据集生成的实验电子密度图的一部分，该数据集直接从与蛋白质C重叠的X-CHIP上生长的晶体中收集α轨迹（显示为实线）。

3.材料和方法

先前研究的靶点，人肾上腺素受体酪氨酸激酶A3（EphA3；Davis等。, 2008)和铜绿假单胞菌烷基氢过氧化物酶D蛋白（PA0269；PDB条目2个4天; 克拉克等。, 2011)，被选为模型蛋白，以证明晶体生长和就地使用X-CHIP进行数据采集。经过几轮片上优化，这两个项目都是在与引用文献类似的条件下结晶出来的。15 mg ml时的EphA3⁻¹和天然PA0269，浓度为10 mg ml⁻¹以1:1的比例和0.2的比例结晶M（M）硫酸铵，0.1M（M）HEPES pH值7.5，25%聚乙二醇3350和0.8M（M）硫酸铵，0.1M（M）柠檬酸钠pH值分别为4.0。对于结晶滴设置，将200–250 nl的蛋白质样品体积与等体积的沉淀溶液混合，然后覆盖0.75–1.25µl的油体积；使用Gilson P2吸管分配所有溶液。在安装之前，将芯片插入支架，然后用盖子盖住支架以防止污染。芯片在没有明显蒸发的情况下储存了1-4周，然后通过公路运输到同步加速器光束线。储存的芯片和在同步加速器上设置的芯片的晶体用于收集衍射数据集。

在配备Rigaku R-AXIS HTC成像板作为探测器的RigakuFR-E超亮旋转阳极X射线源上收集了室内数据集（美国德克萨斯州Woodlands的Rigagu）。同步加速器数据集是在先进光子源（APS）设施的IMCA-CAT ID-17光束线上收集的，使用Pilatus 6M探测器进行适当的光束衰减（瑞士巴登Dectris有限公司）。X-CHIP手动安装在角度计上，如图2所示(d日). 单个样品最初在光学上居中，然后使用衍射法居中以细化晶体位置。在这两种情况下，冷冻流都被阻断，数据采集是在室温下进行的。

4.结果

在整个研究过程中，对所描述的系统的两个重要方面进行了研究；芯片生产高质量晶体的能力和收购的可行性(就地)足够质量的衍射数据从头开始 结构确定。为了评估第一项任务，测试了通过坐滴蒸汽扩散技术获得的先前点击的再现性。对于EphA3和PA0269项目，蒸汽扩散结晶条件在X-CHIP上产生了高质量的晶体（图3一和3b条). 对于PA0269，片上优化进一步提高了晶体尺寸和质量，并减少了每滴晶体的数量（图3一). 这些结果表明，X-CHIP可以成功地用于获得和优化结晶点，并生长足够大的单晶，以便进行简单的数据采集。

在旋转阳极源和同步加速器束线上进行了芯片上数据采集的验证实验。使用内部X射线源进行的初始数据收集试验获得了完整的EphA3数据集。虽然实验是在室温下进行的，但即使对于如此低对称性的晶体，仍然可以获得足够完整的衍射数据空间组作为P（P）2₁（表1). 在同步辐射束线上，收集了EphA3、PA0269和PA0269硒代蛋氨酸衍生物（SAD）的数据集。Pilatus 6M探测器的高灵敏度和超快读出时间允许在室温下快速收集完整的数据集，而不会显著降解样品，并具有出色的处理统计数据。由于光束聚焦精细（50×50µm），可以从同一液滴内生长的多个小晶体中收集数据，而不会对相邻晶体的衍射质量产生任何明显影响。通过比较X-CHIP和基准数据之间的镶嵌分布，可以观察到一个特别有趣的结果(即表1中的CryoLoop）很明显，对于使用芯片收集的数据集，马赛克扩散始终较低，而对于PA0269，则低至0.046°。此外，仅基于分辨率范围，EphA3晶体仅在长达10分钟的连续X射线照射后才开始出现辐射损伤，这是获得完整数据集所需时间的两倍多（未显示数据）。

对于EphA3和PA0269的结晶，在分配蛋白质和沉淀剂溶液后，使用石蜡油涂覆结晶液滴。还探索了其他油，如Al’s Oil（Hampton Research；石蜡油和硅油的50/50混合物）、硅油以及石蜡油与石蜡油50/50的混合物。较高粘度的油（石蜡和Paratone/石蜡）在X-CHIP上表现得更好，因为其高度局限于疏水环边界。发现较薄的硅油流出这些边界外，导致水滴合并。与粘度较高的油相比，Al’s oil需要更仔细的涂抹，但事实证明它仍在疏水边界内。在X-CHIP上测试了含有乙醇、2-甲基-2,4-戊二醇（MPD）和洗涤剂的结晶条件。使用石蜡油作为覆盖物，以5–30%的梯度测试乙醇耐受性。这个相分离在整个梯度范围内，结晶液滴保持完整。含有MPD和不同油的结晶液滴在开始溢出到疏水区域之前可耐受高达8%的MPD。虽然这可能会排除一些基于MPD的条件在X-CHIP上使用，但对整体多功能性的影响较小，因为对于汉普顿研究院和翡翠生物系统公司提供的大多数初始屏幕而言(例如。向导I和II、索引和水晶屏幕）只有约5%的总条件包含MPD。使用n个-十二烷基-N个,N个-二甲胺-N个-氧化物（DDAO）和n个-辛基-β-D类-糖苷与石蜡油覆盖物结合。相间分离保持完好，0.05%n个-辛基-β-D类-即使在非常低的浓度下，也不能耐受葡萄糖苷，但DDAO。

5.讨论

上述X-CHIP结晶平台上的一系列初始实验证明了芯片对高通量蛋白质结晶的适用性，并提供了对该系统优点和局限性的见解。使用芯片上的微滴法结晶被证明适合晶体生长，也提供了额外的好处。油滴蒸发非常缓慢（几天到几周），简化了手动和自动设置。此外，用不同的油混合物改变顶部油层的组成，可以在很大范围内改变水的蒸发速率，为结晶筛选增加了另一个有利维度（D’Arcy等。, 2004). 本质上，该系统是经济的，因为结晶-位测定和优化试验需要的蛋白质样品体积比标准蒸汽扩散法少5倍，试剂溶液少500倍。理论上，使用机器人液体处理系统可以进一步减少体积，但目前受到手动分配精度的限制。此外，设备的简单性导致制造成本低，平台设计消除了与低温技术相关的时间和费用。芯片的小尺寸提供了更方便和更快的目视检查，因为所有结晶液滴都可以在显微镜下同时看到。此外，系统设计提供了一种非侵入性的衍射测试和筛选方法，因为所开发的设备可以安装在大多数内部和同步电子束数据采集系统上，而无需对芯片进行任何修改或对系统进行任何调整。X-CHIP的这些功能使其成为高通量计划的潜在有用平台，例如通过共结晶进行基于片段的筛选。

X-CHIP系统有可能完全消除晶体生长和X射线衍射数据采集之间的“用户因素”，从而消除晶体操作。可行性就地数据收集具有重要意义。首先，室温下的数据采集消除了对冷冻条件优化的繁琐且通常具有局限性的步骤的需要，并产生了在与生理状态更相关的温度下确定的晶体结构。此外，实验获得的SAD数据显示了出色的处理统计数据，这些数据的质量明显足以从头开始 结构确定。有趣的是，在至少一个被调查的案例中，未受干扰的晶体显示出明显低于低温冷冻样品的镶嵌分布，这表明该系统可能应用于高灵敏度或高灵敏度样品单位电池（表1). 一旦安装在测角仪上，沿着芯片导航和对准滴中的任何晶体都是非常简单的，可以在高吞吐量模式下进行数据采集。这种方法消除了传统机器人系统中安装单个回路所需的停机时间，并可节省数小时宝贵的同步加速器束流时间。最后，消除手动晶体处理，为结晶到数据采集管线的全自动化提供了机会，以简化整个过程。

该项目目前的发展旨在缩小X-CHIP系统的下降量。事实证明，使用手动设置来实现这一目标具有挑战性，但液控机器人系统的应用可能会解决这一问题。蚊子结晶机器人系统（英国萨福克Molecular Dimensions Ltd）已用于成功建立总滴体积低至200 nl的结晶实验。X-CHIP也被应用于其他蛋白质靶的结晶实验中。有趣的是，使用高灵敏度和/或小晶体样品的实验可以从该系统的使用中受益匪浅，因为非侵入性数据收集方法可能会解决晶体处理中出现的许多问题。我们还在探索芯片在项目中的应用，在这些项目中，低马赛克扩散对成功结果至关重要。

6.结论

从对该器件的初步研究中可以明显看出，X-CHIP不仅有潜力提高效率并在芯片上提供就地数据收集从头开始 结构测定，而且还有一系列其他好处，包括实现全自动化的机会。尽管最近微芯片结晶技术的发展带来了一些有用设备的发展，但X-CHIP平台提供了前所未有的简单性，具有可比甚至更好的性能。其直观的设计、简约的支持平台以及与大多数光束线的兼容性，使该设备成为蛋白质结晶和X射线衍射数据采集的一个极具吸引力的工具。