1.简介

大分子X射线晶体学在上世纪末的几项创新中受益匪浅，包括低温方法的实施（Hope，1990; 滕，1990; Garman&Schneider，1997年; Garman&Owen，2006年)以及第三代同步辐射源发出的明亮X射线束的可用性。这个时机是偶然的，因为没有前者，后者就不可能得到广泛使用。事实上，早在1962年，人们就认识到X射线辐照对晶体蛋白质的有害影响（Blake&Philips，1962)用现代同步电子X射线束进行室温实验即使不是不可能，也是很困难的。通过将大分子晶体闪速冷却至100K，其在光束中的寿命增加了约100倍（Nave&Garman，2005; 索斯沃思-戴维斯等。, 2007)因为X射线辐射产生的自由基在晶体溶剂的玻璃基质中的扩散受到限制。低温冷却的另一个有益效果来自于减少动力失调。例如，与使用X射线测定的蛋白质结构的室温相比，在低温下检测到的水分子大约是室温下的两倍（Nakasako，1999)或中子晶体学（布莱克利等。, 2004). 如今，90%以上的大分子X射线晶体结构都是根据在100 K下收集的数据确定的（Garman&Owen，2006).

在室温下，生物大分子通常处于结晶状态（Mozzarelli&Rossi，1996）). 约50%的高溶剂含量和大分子在晶体中相互之间的有限接触允许发生大分子运动，这是溶液中生物功能的基础。我们顺便注意到，晶体中的大分子拥挤和溶剂含量与生物细胞中的类似。在低温下，大分子运动减慢或停止，生物活性受损。因此，可以通过在100K（或更低）和室温之间改变晶体的温度来开启和关闭大分子活性，从而捕获可通过晶体学进行结构表征的功能性中间态。相应的温度控制方法是更广泛的动力学晶体学工具箱的一部分，该工具箱旨在拍摄作用中的蛋白质（Bourgeois&Royant，2005）; Bourgeois&Weik，2009年).

在下文中，我们回顾了蛋白质的动力学行为及其水环境作为低温功能的一些方面，特别是晶体蛋白质。然后，我们总结了温度控制的蛋白质X射线晶体学实验，其目的是（i）研究功能性中间态，（ii）表征X射线对晶体蛋白质的损伤，或（iii）利用后者使前者受益。

2.蛋白质和溶剂动力学与低温的关系

在过去的十年中，人们投入了大量的精力来探索蛋白质结构，这是正确的。由于结构和动力学方面的微妙平衡构成了生物分子功能的基础，现在正在加倍努力来揭示“蛋白质的动态特性”（Henzler-Wildman&Kern，2007）). 研究蛋白质在零度以下（°C）温度下的运动是一种有价值的方法，它可以减缓和区分在生理条件下同时发生的多种运动（Parak，2003）). 这种动态复杂性源于蛋白质及其周围溶剂所能达到的构象亚状态所形成的多维能量景观（弗劳恩费尔德等。, 1991). 大分子运动导致亚状态之间的相互转换，从而“将蛋白质带到生命中”。当水合生物大分子冷却到低温时，非谐波大分子运动在所谓的动态转变处停止，动态转变发生在大约180到220 K之间。动态转变发生于蛋白质、RNA和DNA的溶液、粉末和结晶样品中。这是研究人员利用穆斯堡尔谱学首次发现的，以探测肌红蛋白（Parak等。, 1982)并随后通过其他实验技术进行了研究，包括中子散射（剂量仪等。, 1989; 费兰德等。, 1993)和X射线晶体学（参见§（见下文第4节）。除了作为生物大分子低温物理的一个显著特征的重要性外，动力学转变还与生物活性的开始有关（拉斯穆森等。, 1992; 利希滕格尔等。, 1999; 奥斯特曼等。, 2000). 然而，某些酶在动力转换下是活跃的（Daniel等。, 1998)或至少能够进行部分催化循环（Heyes等。2002年; 杜林等。，2009年).

蛋白质周围的水薄膜，即。它们的水合水，对大分子的生物活性至关重要。如果没有水合水，蛋白质就缺乏使其三维结构具有动画效果的构象灵活性，并且动态转变受到抑制。溶剂粘度影响蛋白质发生动力学转变的温度；粘度越高，转变温度越高（Beece等。, 1980; 利希滕格尔等。, 1999). 因此，蛋白质动力学被认为是水合水动力学的“奴隶”（Frauenfeld等。, 2002). 紧密耦合的一个表现是在与蛋白质的动态转变温度相同的水合水中出现玻璃状转变（Wood等。, 2008). 特别是，在分子动力学模拟中，水平移扩散的开始被确定为蛋白质动力学转变背后的驱动力（Tarek&Tobias，2002). 分子动力学模拟还表明，水的运动与蛋白质的运动耦合在动力学转变之上，蛋白质的内在运动在动力学转变之下占主导地位（维特库普等。, 2000). 动力学转变的细节、溶剂动力学对其的调节及其与生物活性的关系仍在激烈争论中（Doster，2008, 2009; 弗劳恩费尔德等。, 2009).

3.蛋白质晶体的温度依赖性行为

低温晶体学实验要求大分子晶体在液氮（63–77 K）或气态氮（通常为100 K）、液态丙烷（83–231 K）或液态乙烷（90–185 K）等制冷剂中闪速冷却。闪蒸冷却所允许的快速降温的目的是避免结晶溶剂的水部分形成结晶冰。与水结晶相关的密度变化扰乱了晶体堆积，导致衍射质量恶化。为了避免结晶冰的形成，在水分子有时间重新定向和扩散以形成结晶排列之前，需要将溶剂玻璃化为无定形状态。溶剂的粘度越高，大分子对溶剂的限制越明显，溶剂的温度越高玻璃化转变通过玻璃化更容易避免结晶冰的形成。在大多数情况下，溶剂粘度必须高于通过添加渗透性冷冻保护剂（如甘油、低分子量聚乙二醇或盐）来生长晶体的母液粘度（Garman&Schneider，1997). 对于一些结晶蛋白质，即使没有添加渗透性冷冻保护剂，在闪冷过程中也不会形成结晶冰。在这些情况下，结晶中的母液粘度已经足够高，可以通过闪蒸冷却进行玻璃化。最近，有报道称，当温度以非常缓慢的速度（0.1 K s）从300 K降至100 K时，在没有渗透防冻剂的情况下，索姆丁晶体中不会形成结晶冰⁻¹; Warkentin&Thorne，2009年). 在§4.在高压（200 MPa；基姆等。, 2005). 一旦溶剂变成非晶态，蛋白质晶体在低温下就处于亚稳态；它已经脱离了热力学平衡。当快速冷却的蛋白质晶体被加热到100K以上时会发生什么，即.收集大多数低温晶体学数据的温度？简要总结闪蒸冷却纯水的行为是理解蛋白质晶体更复杂情况的先决条件。

纯净的散装水通常形成普通的结晶冰（六角形；I_小时)如果冷却到273 K以下。在某些很少发生成核事件的条件下，水可以在273 K下过冷。然而，当温度达到均匀形核接近（大气压力为235 K）（卡诺等。, 1975). 闪蒸冷却液态水可以绕过结晶过程，从而形成无定形冰（综述见Angell，2004）). 描述了不同形式的无定形冰。非晶固体水（ASW）代表宇宙中大部分的水，是由水蒸气在冷的基底上冷凝而成的。超淬火玻璃水（HQGW）是通过闪蒸冷却小液滴形成的（Bruggeller和Mayer，1980)或水的薄膜（Dubochet&McDowall，1981)以快速的速度（10⁵–10⁶ K秒⁻¹). 还有另一种非晶形式的水，即所谓的高密度非晶冰（HDA），是由I的加压作用产生的_小时77K下，达到1GPa。加热到117K以上时，HDA膨胀并转变为所谓的低密度无定形冰（LDA；三岛等。, 1984). HDA（1.17 g cm）的转化⁻³)至LDA（0.94 g cm⁻³)伴随着20%的销量增长（三岛等。, 1985). LDA、HQGW和ASW具有相似的结构和密度（Mishima&Stanley，1998)并经历一次玻璃化转变升温至129 K（LDA）或136 K（ASW，HQGW）时（McMillan&Los，1965; 约哈里等。, 1987; Mayer，1991年). 在玻璃化转变粘度突然下降，有人提出无定形水会转变为超粘性液体（Mishima&Stanley，1998)通过结晶成立方冰（I_c（c）)150 K（Mayer，1991年). 进一步升温后I_c（c）转换为I_小时在186K（麦克米兰和洛杉矶，1965年). 闪蒸冷却水的不同形式如图1所示据报道，水分子在玻璃化转变（费希尔和德夫林，1995年)并在150 K温度下表现出平移扩散（Smith&Kay，1999）). 然而，在136至150 K的温度范围内是否存在超粘性水仍有争议（科尔等。, 2005; Yue&Angell，2004年)并且提出了在150–160 K下从玻璃态到结晶态的直接转变（Velikov等。, 2001). 无论如何，在150至235 K的温度范围内，即所谓的“无人区”，无法对液态散装水进行实验研究（Mishima&Stanley，1998年).

图1 闪蒸冷却纯散装水在环境压力下的低温域示意图（摘自Mishima&Stanley，1998）).

蛋白质晶体中的溶剂与散装水在三个方面有所不同：它含有来自母液的溶质，也可能来自低温保护剂，它与大分子表面接触，并且受到限制。这三个差异改变了晶体溶剂相对于纯水的低温行为，如图1所示.闪蒸冷却期间晶格（单位细胞体积）收缩2-7%，而蛋白质分子仅收缩1-3%（Juers&Matthews，2001）). 如果晶体通道和空腔中溶剂的收缩与晶体和蛋白质的收缩不匹配，闪蒸冷却通过迫使一部分溶剂移出晶体来降低结晶顺序并降低衍射质量（Juers&Matthews，2001, 2004)或分散在晶体中的小区域（克里姆斯基等。, 2002). 除了避免溶剂通道内形成结晶冰外，理想浓度的理想低温保护剂（Mitchell&Garman，1994）)应在闪蒸冷却时收缩到与晶体和蛋白质收缩完全匹配的程度（Juers&Matthews，2001; 克里姆斯基等。, 2002). Juers及其同事测量了26种不同低温溶液的收缩率，在温度从294 K降至72 K时，收缩率从2%到13%不等，从而为合理匹配不同晶体成分的热收缩和膨胀提供了实验依据（Alcorn&Juers，2010).

缓慢升温（0.1–0.001 K s）时闪速冷却蛋白质晶体内溶剂的行为⁻¹)100 K以上的温度取决于其成分、特定的约束几何形状、闪蒸冷却期间的压力、加热速率以及是否存在非穿透性低温保护剂，例如油（威克、克里格等。, 2001; Parkin&Hope，2003年; 莱纳特·威克等。, 2005; 基姆等。, 2008, 2009). 如果溶剂被限制在大通道（60Å及更大）内，随着温度升高到155K以上，作为温度函数的晶胞体积膨胀率急剧增加，并且结晶冰环同时出现在衍射图案中（Weik，Kryger等。, 2001). 已经得出结论，膨胀是由于水在溶剂通道内形成结晶冰。据报道，在165 K温度下，通道直径为30–40 Au的晶体单位细胞体积突然增加，这是由于通道内形成纳米晶冰或玻璃溶剂转变为低密度的无定形形式所致（Parkin&Hope，2003). 当温度升高到190 K以上时，通道约为20°的晶体的单位体积急剧减小，同时出现了结晶冰环（Weik，Schreurs等。, 2005). 水从晶体中流出（Juers&Matthews，2001, 2004)在其表面结晶，留下坍塌的蛋白质晶格后面（维克、施勒尔等。, 2005). 在某些情况下，可以通过非渗透性冷冻保护剂（如作为动力学屏障的油）避免溶剂从晶体中转移（Juers&Matthews，2004）; 施鲁尔·威克等。, 2005). 在更小的通道（10？）的情况下，溶剂不会形成结晶冰，也不会被输送（威克，克里格等。, 2001). 总之，如果通道小于约30°，晶体内显然不会结冰。限制在亲水性二氧化硅材料中的纯水（Dore，2000)也有报道称，如果河道尺寸低于28度，则不会形成结晶冰等。, 2008).

纯水被提议在其上方加热时会形成超粘稠液体玻璃化转变以及上述结晶之前。蛋白质晶体中的溶剂在低温下也能处于超粘性状态吗？有两项证据表明事实确实如此。首先，在190 K下观察到溶剂从具有20个通道的晶体中被输送出来，这是无模型证据，表明当水在蛋白质晶体表面形成结晶冰时，水表现出长程平移扩散（Weik，Schreurs等。, 2005). 对闪冷紫色膜也进行了类似的观察（Weik，Lehnert等。, 2005). 第二个证据是在高压冷冻蛋白质晶体上进行的优雅实验（Kim等。, 2009)在其溶剂通道中含有压力诱导的HDA（Kim等。, 2008). 当从80 K加热到165 K时，HDA转化为LDA，由两个非晶相的特征水扩散衍射环确定。20%的体积膨胀伴随着HDA到LDA的转变，并没有引起溶剂通道的膨胀。得出的结论是，水被输送到晶体表面或晶界，从而为其在转变过程中的液相性质提供了证据（Kim等。，2009年). 在动力学结晶学实验中，可以利用晶体溶剂为液相的窄低温窗口的存在，以使蛋白质具有建立功能性中间态所必需的灵活性；这将在§中进一步讨论6

了解100–300 K温度范围内蛋白质晶体中溶剂的物理化学性质也有助于合理化各种结晶退火程序，这些程序显示出改善闪速冷却大分子晶体衍射质量的潜力（Yeh&Hol，1998; 竖琴等。, 1998; 克里姆斯基等。, 2002; 汉森等。, 2003; Juers&Matthews，2004年; 施鲁尔·威克等。, 2005). 特别是，建议在退火至室温期间进行溶剂传输，以改变低温保护剂的浓度，从而改变晶体的热收缩特性，从而改善衍射质量；这意味着冷冻条件事先没有完全优化（Mitchell&Garman，1994; 克里姆斯基等。, 2002; Juers&Matthews，2004年). 或者，晶体溶剂在室温或更低温度下的瞬时液化可以为晶体大分子提供必要的流动性，使其轻微重排，从而释放闪蒸冷却过程中形成的晶格应力，降低镶嵌性，减少晶格间距的分布，从而提高衍射分辨率（克里姆斯基等。, 2002; 基姆等。, 2009).

4.不同冷冻温度下的蛋白质结构

肌红蛋白的结构在220-300 K之间的不同温度下测定，首次证明可以从蛋白质晶体学中获得动力学信息（弗劳恩费尔德等。, 1979). 随后，在80至300 K的更宽温度范围内，在更多温度点研究了其他几种蛋白质结构（Singh等。, 1980; 哈特曼等。, 1982; 巴拉克等。, 1987; 蒂尔顿等。, 1992; Kurinov&Harrison，1995年; 永田等。, 1996; 蒂特等。, 2001; 乔蒂等。2002年; Edayathuman­galam&Luger，2005年; 施密特等。, 2009; 基姆等。, 2009). 晶体学的B类因子（德拜-沃勒因子）也可以为蛋白质动力学提供一些见解。实际上，原子均方位移〈x个²〉提取自B类因素（〈x个²=B类/8π²)源于动静失调。推断温度依赖性B类系数0 K提供了静态贡献的估计值。在结晶型血红蛋白硝基蛋白4的情况下，静态障碍对B类在室温和100K下，所有非H主链原子的平均因子分别为40%和65%（施密特等。, 2009). 平均温度依赖性B类然而，因素因蛋白质而异。已观察到硝基磷4的线性行为（Schmidt等。, 2009)和肌红蛋白（巴拉克等人。, 1987; Chong（冲）等。, 2001)，而温度依赖性的双相行为B类核糖核酸酶a（Tilton等。, 1992)、crambin（Teeter等。, 2001)和溶菌酶（Joti等。, 2002). 扭折被解释为蛋白质从谐运动到非谐运动的动态转变，在核糖核酸酶a的情况下，表明底物在转变温度（220K；拉斯穆森等。, 1992). 同样，晶体crambin表面的水结构在过渡（200K）以上降低。线性温度依赖性B类硝基蛋白和肌红蛋白中的因子表明这些蛋白质中没有动态转变？Joti和同事解释了B类在不同的蛋白质晶体中的因素，通过争论动态转变可以发生，尽管线性B类温度在200 K左右时的系数（Joti等。, 2002). 如果在所研究的整个温度范围内，晶体蛋白质能量景观中的同一组构象亚状态被占据，则无法通过检查晶体学观察到动力学转变B类因素。相反，当某些亚态在较低温度下耗尽时，可以观察到转变。此外，检查B类单个氨基酸的因子可能会显示非线性，尽管存在线性行为B类因子在整个蛋白质上的平均值，表明在动态转变时，填充的亚状态发生了局部变化。事实上，与室温下测定的结构相比，在低温下测定的蛋白质结构中经常观察到交替侧链构象的数量减少（Parak等。, 1987; 邓洛普等。, 2005).

低温下构象亚态的布居强烈依赖于闪蒸冷却速度。使用氮气闪蒸冷却蛋白质晶体的典型值约为50–500 K s⁻¹如果是气态的，则数值较低；如果使用液氮，则数值较高（Teng&Moffat，1998; 散步的人等。, 1998; 克里姆斯基等。, 2003). 如果除去液氮表面上的冷气体层，冷却速度可以增加到15000 K s⁻¹（沃肯廷等。, 2006). Halle计算出，在这种冷却速度下，晶体蛋白在200K左右失去平衡（Halle，2004). 然后在此温度下淬火侧链和水分子的运动，在100 K下测定的蛋白质结构有效地表示在200 K下。解决闪蒸冷却期间蛋白质结构淬火程度的方法是将其与缓慢冷却后测定的结构进行比较。Warkentin和Thorne最近表明，溶剂通道为25–35º的thaumatin晶体可以在0.1 K s下从室温冷却到100 K⁻¹无结晶冰形成（Warkentin&Thorne，2009). 一个有趣的实验是确定闪速冷却和慢冷却的索姆丁晶体在100到300K之间的不同温度下的结构，并对它们进行比较。如果晶体蛋白在200 K时确实失去平衡B类闪速冷却和慢冷却晶体的交替侧链构象和水网结构等因素和结构特征应在200K以上相似，但在200K以下不同。

5.X射线对晶体蛋白质损伤的温度依赖性

晶体数据采集期间，大分子晶体的X射线辐照会导致衍射质量下降，并对大分子造成特定损伤第二至第五届晶体生物样品X射线损伤国际研讨会会议记录在同步辐射杂志[第卷。9第6部分（2002年）,第卷。12第3部分（2005年）,第卷。14第1部分（2007年）和第卷。16第2部分（2009年）]; 有关评论，请参阅Ravelli&Garman，2006}. 损伤分为两种类型：主要损伤和次要损伤。前者是X射线光子与样品中原子相互作用的结果，光电效应导致高能量电子喷射，这是高分子晶体中光子能量的主要非弹性事件（Murray等。, 2005). 主要辐射损伤与温度有关（Teng&Moffat，2002）). 二次损伤是由初级光电子产生的许多二次自由基引起的。水的辐射分解在次级事件中起着重要作用，并导致各种自由基，包括水合电子（e⁻_空气质量)，羟基自由基()氢原子和质子。

温度依赖性二次辐射正如§1.在室温下，二级自由基是可移动的，可以重组或破坏蛋白质。在100 K时，大自由基，如被困在非晶态溶剂的刚性基体中。相比之下，电子可以移动到更低的温度，甚至在5K时也有报道称其隧道效应（迪克等。, 1998). 虽然将大分子晶体从室温冷却到100 K的好处从大约100倍的使用寿命中明显可见，但通过收集40 K或以下的数据来减少辐射损伤的潜力却不太明显。根据全球辐射损伤指标（Chinte）判断，在15 K下收集的数据中，晶体寿命仅略有增加，约为25%等。, 2007; 会见等。, 2007). 关于100K时的损伤，据报道，50K时二硫键的特定损伤减少了四倍，整体损伤减少了50%（符合等。, 2010). 另一方面光还原一种特定的辐射损伤效应（Yano等。, 2005)，与X射线吸收光谱测定的110 K相比，在40 K时减少了30倍（Corbett等。, 2007). 因此，晶体金属蛋白的氧化还原完整性在数据收集期间将温度降低到100 K以下，将大大受益。

高分子晶体的辐射敏感性是如何随着100K以上温度的变化而变化的？虽然结晶溶剂在100 K以下的温度下保持非晶态，但它不在100–300 K的温度范围内，如§3.高于100K，但仍低于溶剂玻璃转变温度，自由基在溶剂中的寿命(例如水合电子）和蛋白质中(例如二硫自由基）是独立于温度的，这是通过同步加速器束线在线形成的紫外-可见吸收光谱确定的（McGeehan等。, 2009). 溶剂粘度突然下降玻璃化转变（在150 K或更高温度下发生）允许在较低温度下捕获在非晶态溶剂中的自由基的迁移率增加，因此自由基寿命降低。因此，单位细胞体积随着吸收X射线剂量的增加而线性增加（Ravelli&McSweeney，2000）)，非线性增加（Weik，Ravelli等。, 2001)甚至下降（拉维利等。, 2002)高于溶剂玻璃化转变和全球（博雷克等。, 2007)和具体（威克、拉维利等。, 2001)辐射损伤急剧增加。晶体溶剂变成“液相”和自由基扩散增加的低温取决于溶剂组成和限制，如§3.在相同的温度下，人们可以预期激进分子变得流动，就像他们在110和130 K以上的无定形（M.D.塞维利亚，与E.加曼的私人通信）和结晶冰（西蒙斯，1999)分别是。然而，没有一个氧化损伤的例子是由迄今为止，在100K到室温之间测定的蛋白质晶体结构中观察到了自由基。

6.温度控制动态冷冻结晶法表征蛋白质中间状态：利用溶剂和蛋白质的动态转变

如§2.因此，可以利用温度控制的蛋白质晶体学来生成、捕获和结构表征大分子中间态（Ringe&Petsko，2003）)通过将反应触发与适当的温度分布相结合。与接近室温的实时劳厄衍射一起，温控结晶学是动力学结晶学工具箱的一部分，为结构生物学家提供解决大分子功能的方法通过结晶学。温控动力学晶体学遵循触发-冷却或冷却-触发序列。在前者中，反应在室温下开始，然后通过快速降低温度至200 K或以下来捕获生成的中间状态。在后者中，结晶大分子首先闪蒸冷却，然后开始反应。在低温下引发的反应，例如在100K时，只有当温度升高，蛋白质的柔韧性增强时，才能继续进行，通常温度高于溶剂和蛋白质的动态转变温度（Weik，Ravelli等。, 2001; 基姆等。, 2009). 有几种触发反应的方法，包括用紫外可见光照射内源性或外源性光敏大分子，扩散小分子，如底物或产物，以及X射线照射产生自由基和特异性键断裂。动力学晶体学极大地受益于互补光谱技术，如离线（Bourgeois等。, 2002)和在线（McGeehan等。, 2009)紫外-可见荧光和吸收（皮尔逊等。, 2004; De la Mora-Rey&Wilmot，2007年)、拉曼（卡彭提尔等。, 2007)，EPR（乌特希格等。, 2008)和X射线吸收光谱（Hough等。, 2008). 存在广泛的动力学晶体学最新评论（Petsko&Ringe，2000; Bourgeois&Royant，2005年; Bourgeois&Weik，2009年; 平井一夫等。, 2009)在这里，我们将重点放在使用X射线辐照作为反应触发的温控晶体学上。

Schlichting及其同事将X射线诱导电子产生和温控晶体学相结合用于开创性工作，以生成、捕获和表征结晶酶P450cam（Schlichtin）反应途径上两种功能相关的中间态等。, 2000). P450cam催化樟脑在2e中的羟基化⁻氧化还原反应。大多数中间产物积累到特定的触发点（两个电子，O₂)让反应进一步进行。结晶P450cam的结构起点是其二氧基中间体[物种(6)如图2所示一].体内，向活性氧中间体的过渡[物种(7)如图2所示一]由P450cam晶体中不存在的另一种蛋白质（恶臭氧化还原蛋白）提供的电子触发。相反，电子是在接近100 K的温度下，通过延长晶体的X射线照射而产生的水辐解产生的。为了最大限度地提高X射线吸收（这与λ^三)在辐照过程中，波长从0.9º（采集数据时）移到1.5º。过渡到酶-产品复合物[物种(4)如图2所示一]要做到这一点，蛋白质和底物必须获得足够的灵活性，这是由一个瞬时温度上升到蛋白质动力学转变以上（室温下30s）所提供的。实验策略总结如图2所示(b条). 在另一个例子中，同步辐射还原血红素铁，然后短暂升温至室温，用于生成和捕获结晶肌红蛋白（Hersleth等。2008年). 在接近100 K的温度下，对X射线诱导还原的其他晶体氧化还原敏感蛋白的研究（Berglund等。2002年; 亚当等。, 2004; 巴克斯特等。, 2004; Mees公司等。, 2004; 罗伯茨等。, 2005; 埃沙利耶等。, 2006; 伯特利西等。, 2007; 屈内尔等。, 2007; 皮尔逊等。, 2007; 霍夫等。, 2008)如果对中间状态的结构信息感兴趣，则可以从温控晶体学中受益。

图2 (一)P450cam的反应途径（基于Schlichting等。, 2000)和(b条)该实验协议用于捕获并生成由彩色矩形突出显示的三个中间状态。

温控结晶学也有助于乙酰胆碱酯酶（AChE）的机制研究，AChE是一种在神经系统中起核心作用的酶。乙酰胆碱酯酶通过将神经递质乙酰胆碱水解为醋酸盐和胆碱来终止胆碱能突触的神经脉冲传递（Silman&Sussman，2005）). 为了实现其生物功能，乙酰胆碱酯酶需要快速高效，这使得很难通过晶体学方法探索基质和产品流量的结构和动力学细节。每秒高达10000个底物分子在深谷底部的活性部位水解（苏斯曼等。, 1991). 基于分子动力学模拟，已经假设存在一个“后门”，可以在活性部位附近瞬时打开，并允许快速清除产品（Gilson等。, 1994). 设计了几种温度控制晶体学方法，使我们能够了解AChE内分子交通的某些方面。在第一种方法中，在结晶酶中添加过量的底物，通过一种称为底物抑制的现象（Colletier等。, 2006). 因此，在室温下建立了各种稳态状态，并通过闪蒸冷却（图3一)这使得酶反应中的不同中间产物得以可视化，例如乙酰基和胆碱这两种产物被阻断峡谷入口的底物分子捕获在活性位点（图3b条). 被捕获的胆碱能通过后门逃逸吗？两个进一步的温度控制实验证明了这一点。在第一个实验中，胆碱的一种光敏前体（所谓的“笼状化合物”）通过结合活性位点（Colletier）抑制酶等。, 2007). 松开化合物，即胆碱的释放是通过紫外激光照射晶体，在9 s到室温的短时间温度漂移期间实现的（图3c（c）). 部分差异精炼然后显示，在20%的晶体酶中，Trp84的微小运动打开了后门（图3d日). 在另一种方法中，使用X射线照射触发反应。在两个温度下收集一系列数据集期间，X射线对一种与催化丝氨酸结合的非水解乙酰胆碱类似物进行了放射裂解（Colletier等。, 2008). 在将晶体转换为之前未曝光的部分后，在100 K下收集了四个连续的数据集，在150 K下收集四个连续数据集（图3e（电子）). 这两个温度值低于并接近溶剂玻璃化转变，分别是。通过计算每个温度下序列数据集之间的差异傅里叶图，捕获不同的酶中间状态。在100 K下，不可水解底物类似物被放射裂解，释放的假胆碱分子仍被困在活性部位。在150 K下，辐解释放出一种不能位于活性部位的假胆碱。相反，Trp84和Tyr442处的一对正负差异密度峰表明这些残基已经移动；这些运动归因于假胆碱通过后门离开活性部位，因此建议后门在150K时打开，但在100K时不打开（图3（f）). 温控晶体学收集的信息片段对于解决自然界中最快酶之一的底物和产品运输这一复杂难题是有价值的。

图3 温控动力学晶体学研究乙酰胆碱酯酶中底物和产物交通的结构细节（摘自Bourgeois&Weik，2009）). (一)室温下将乙酰胆碱酯酶晶体浸泡在过量的底物乙酰硫胆碱中会导致(b条)在100K下捕获的稳态种群，其中底物、胆碱和乙酰基位于活性位点峡谷（Colletier等。, 2006). (c（c）)使用笼状胆碱的紫外线照射作为短时间室温漂移期间的反应触发器(d日)一个中间状态被捕获，其中Trp84的一个小的移动打开了从活性部位到溶剂区域的通道（Colletier等。, 2007). (e（电子）)当在150 K温度下从乙酰胆碱酯酶晶体与非水解底物类似物（Colletier等。, 2008)Trp84的类似运动(（f）)如中所示(d日)观察到。

如上述和其他示例所示（Dub­novitsky等。, 2005)，蛋白质活性位点对辐射特别敏感。因此，必须进行仔细的控制实验，以便从蛋白质结构的功能相关特征中反褶积辐射损伤。如果使用X射线来触发反应，这一点尤其正确。在这种情况下，监测准确的X射线剂量显然是强制性的（穆雷等。, 2005). 自二次辐射损坏取决于温度（§5） 如果数据集之间的数据收集温度发生变化，则控制实验必须伴随使用明亮同步辐射源的任何晶体研究。

7.观点

作为温度函数的高分子晶体学目前包含一个可以扩大的小范围实验。进行慢冷实验的可能性（Warkentin&Thorne，2009)已经在§中讨论过4.比较缓慢冷却和闪速冷却后缓慢加热期间测定的蛋白质结构，可能会让我们更多地了解捕获在闪速冷却结晶蛋白质中的构象亚态集合。温度控制晶体实验也可以用中子代替X射线进行。中子晶体学允许质子的可视化，这对于解释酶的中间状态很有意义。当中子衍射仪上有更多的开放式冷却系统时，温控动态中子结晶学将更容易实现。另一个观点是对膜蛋白进行多次温度控制的X射线晶体学实验（Hirai等。, 2009). 为此，仔细描述膜蛋白晶体及其脂质和/或洗涤剂基质的温度依赖性X射线衍射将是有益的。中子光谱实验确实表明，脂质动力学而非水动力学控制着膜蛋白的动力学（Wood等。, 2007). 当然，有必要进一步探索X射线辐射对大分子晶体及其组分损伤的温度依赖性。晶体中光谱技术（UV–vis、Raman、EPR、，XAS公司 等）是对这方面晶体学的一个有价值的补充。