Introduction to phasing

Taylor, G.L.

doi:10.1107/S0907444910006694

研究论文

结构
生物学

国际标准编号：2059-7983

第66卷| 第4部分| 2010年4月| 第325-338页

https://doi.org/10.107/S090744910006694

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阶段划分简介

加里·泰勒 ^一 ^*

^一苏格兰法夫KY16 9ST圣安德鲁斯大学生物分子科学中心
^*通信电子邮件：glt2@st-andrews.ac.uk

(收到日期：2009年8月30日； 2010年2月22日接受)

当从晶体中收集X射线衍射数据时，我们测量从一系列平面散射的衍射波的强度，我们可以想象这些平面从各个方向穿过晶体。根据这些强度，我们导出了散射波的振幅，但在实验中我们丢失了相位信息；也就是说，当我们将这些波叠加在一起以重建分子图像时，我们如何偏移这些波。这通常被称为“阶段问题”。我们只能从分子结构的一些知识中得出相。在小分子晶体学中，一些关于原子性的基本假设导致了振幅之间的关系，从中可以提取相位信息。在蛋白质晶体学中，这些从头算方法只能在数据分辨率至少为1.2º的罕见情况下使用。在大多数情况下，蛋白质晶体学相是通过使用结构相似蛋白质的原子坐标（分子替换）或通过找到蛋白质固有的或已添加的重原子的位置（如MIR、MIRAS、SIR、SIRAS、MAD、SAD或这些方法的组合）导出的。佩鲁茨、肯德鲁、布洛、克里克等人的开创性工作发展了同晶置换：在不影响蛋白质结构的情况下，向蛋白质中添加电子密度原子。现在，小分子晶体学的方法可以用来寻找重原子下部结构整个蛋白质的相可以从这个先前的知识中引导出来。最近，X射线源、探测器和软件的改进导致了反常散射从掺入的硒或固有硫中获得相信息。在最好的情况下，只需要一组X射线数据（SAD）就可以提供异常散射体的位置，这与密度修改程序一起可以揭示完整蛋白质的结构。

关键词：阶段划分.

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1.简介

1.1. 阶段化

有许多关于大分子晶体学的优秀综合文本，其中包括关于相位方法的章节（Blundell&Johnson，1976）; 德伦特，1994年 , 2006 ; Blow，2002年 ; Lattman&Loll，2008年 ; 罗德斯，2006 ; McPherson，2009年 ; Rossmann&Arnold，2001年 ; Rupp，2009年 ). 本次CCP4试验阶段研究周末介绍旨在对新进入该领域的人员的阶段划分进行概述。许多进入蛋白质晶体学的人来自生物学背景，不熟悉傅里叶求和和和复数的细节。硒代蛋氨酸在蛋白质中的常规掺入、同步加速器的广泛应用以及检测器技术和软件的改进意味着，在许多情况下，结构解决方案已成为“黑匣子”。然而，并非所有的结构解决方案都是一帆风顺的，对阶段划分有一些了解仍然是有用的。在这里，我们将强调相位的重要性，描述相位是如何从结构的一些先验知识中推导出来的，并简要介绍相位调整方法（直接、，分子置换和重原子同晶取代）。在大多数重原子定相方法中，目的是保持同构，使得重原子取代时唯一的结构变化是局部的，并且细胞单位尺寸或蛋白质在细胞中的取向没有变化。单波长和多波长异常衍射（SAD/MAD）实验通常可以实现这一点，因为在没有辐射损伤的情况下，当从单晶中收集所有衍射数据时，可以保持同构。在确实发生非同构的情况下，这可以用于提供相位信息，我们将查看一个示例，其中非同构用于将相位从6°扩展到2°。

衍射实验中（图1)，我们在探测器上测量从平面散射的波的强度（表示为香港特别行政区)在水晶中。强度值是一个特定平面中电子数量的度量。波的振幅|F类_{香港特别行政区}|与强度的平方根成正比。计算某一位置的电子密度(xyz公司)在中单位电池对于晶体，我们需要对所有香港特别行政区飞机。换句话说，我们可以将其表示为(xyz公司)是对该点贡献的总和(xyz公司)从平面上散射的波(香港特别行政区)其振幅取决于平面中的电子数量加上正确的相对相位关系或数学上的相对相位关系，

$[\rho（xyz）={1\over V}\textstyle\sum|F_{hkl}|\exp（i\alpha_{hk l}）\exp[-2\pi i（hx+ky+lz）]，\eqno（1）]$

哪里五是的体积单位电池和α_{香港特别行政区}是与结构系数振幅相关的相位|F类_{香港特别行政区}|. 我们可以测量振幅，但相位在实验中丢失了。这就是相位问题。

图1
衍射实验。

1.2. 阶段的重要性

相位在产生正确的电子密度或结构方面的重要性如图2所示和3在图2中三个“电子密度波”被添加到单位电池，这显示了由于添加不同相位角的第三波而导致的显著不同的电子密度。在图3中来自Kevin Cowtan的傅里叶书(https://www.ysbl.york.ac.uk/~cowtan/fourier/fourier.html)，很好地说明了阶段在携带结构信息方面的重要性。用鸭子衍射得到的振幅和猫衍射得到的相位计算“电子密度图”，得到猫：相位携带更多信息。

图2
(一)相位角的定义α(b条)将三个波相加的结果，其中第三个波以两个不同的相位角相加。

图3
信息传播阶段的重要性。顶部，鸭和猫的衍射图案或傅里叶变换（FT）。左下角，将鸭子衍射图的振幅与猫衍射图的相位相结合，得到衍射图。右下角，将产生这种混合衍射图案的图像。在衍射图案中，不同的颜色表示不同的相位，颜色的亮度表示振幅。承蒙凯文·考坦转载。

2.恢复相位

振幅和相位之间没有正式的关系；唯一的关系是通过分子结构或电子密度。因此，如果我们可以假设一些关于电子密度或结构的先验知识，这可以得到相位的值。这是所有阶段化方法的基础，包括阶段改进或密度修改（表1).

表1
结构解中使用的方法

方法	先前的知识
直接方法	ρ≥0，离散原子
分子替换	结构相似模型
异形置换	重原子子结构
异常散射	异常原子子结构

密度修改	溶剂压平
（阶段改进）	直方图匹配
	非晶体学对称平均
	局部结构自动检测
	阶段扩展

2.1、。直接方法

直接方法基于电子密度的正性和原子性，这导致了（归一化）结构因子之间的相位关系，豪普特曼和卡勒为此分享了1985年诺贝尔化学奖（参见他们在https://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laurates/1985/). 三元组关系（2）显示了三个反射的相位是如何相关的。例如，考虑以下情况小时是（2，3，5）反射，并且小时′是（1，0，3）反射，因此小时 − 小时因此，′为（1，3，2）。三重态关系表明，（−2、−3、−5）、（1、0、3）和（1、3、2）反射的相位之和约为零。因此，知道两次反射的相位，就可以得出第三次反射的位相。切线公式（3）是针对相位导出的方程精炼基于三胞胎关系，

$[\alpha_{-{\bfh}}+\alpha_2{\bf h}'}+\alpha_{{\bf-h}-{\bf h}'}\simeq 0，\eqno（2）]$

$[\tan\alpha_{\bfh}={{\langle E_{{\bf h}'}E_{\bf-h}-{\bh h}'{\sin（\alpha{{\bf h}'}+\alpha_{\bv h}-}）\rangle_{\fh h}'}\cos（\alpha_{{bfh}'}+\alpha_{{bf h}-{bf h}'}）\rangle_{{\bf h{'}}，\eqno（3）]$

哪里E类表示归一化结构系数振幅；也就是说，点原子静止时产生的振幅。这样的方程意味着，一旦某些反射的相位已知，或者可以给出各种起始值，那么就可以推导出其他反射的相位，从而进行自举以获得所有反射的相位值。蛋白质的高分辨率数据（<1.2º）的需求限制了从头算尽管如此，蛋白质晶体学中的相位测定直接法已被用于小蛋白质（高达～1000个原子）的相。1.2°的高分辨率要求，或所谓的Sheldrick规则（Sheldrick，1990 )，已经给出了蛋白质的结构基础（Morris&Bricogne，2003 ). 然而，直接法通常用来寻找重原子下部结构通过程序，如摇晃和烘焙(SnB公司; 米勒等。, 1994 ),SHELXD公司（谢尔德里克，2008年 ),橡子（福亚迪等。, 2000 )和HySS公司（Grosse Kunstleve和Adams，2003年 ).

2.2.分子替换（MR）

当结构相似的模型可用时，分子置换使用迈克尔·罗斯曼（Michael Rossmann）和大卫·布罗（David Blow）（罗斯曼和布罗，1962 ). 根据经验法则，通常需要大于25%的序列恒等式以及C之间的均方根误差<2.0º^α模型的原子和新结构，尽管也有例外。分子替换通常使用Patterson函数。A类帕特森地图使用与用于计算电子密度图相同的傅立叶求和来计算，但是(F类_{香港特别行政区})²或强度，作为系数，因此不需要了解相位。由此得到的图谱是电子密度与其自身的卷积，并提供了一个在原子间矢量而不是在绝对原子位置具有峰值的图谱。A类帕特森地图也可以使用从结构相似模型的原子坐标计算的振幅来计算，并在帕特森地图根据新晶体的结构因子振幅计算，以获得新晶体中模型的取向单位单元格。相对于新模型的起源，正确定向模型的翻译单位电池可以使用类似的Patterson方法通过在新的单位电池，尽管可以使用其他方法（图4).

图4
分子置换的过程。

2.3. 异形置换

使用重原子替换来解决相位问题很早就被小分子晶体学家发明了，例如同晶晶体CuSO的（相同单位单元）₄和CuSeO₄（格罗斯，1908年 ). Beevers&Lipson（1934）使用了某些类别反射强度的变化 )定位Cu和S原子。Max Perutz和John Kendrew最先将该方法应用于蛋白质（Perutz，1956 ; 肯德鲁等。, 1958 )通过将蛋白质晶体浸泡在重原子溶液中，生成同晶的重原子衍生物（相同单位电池，蛋白质在细胞中的方向相同），从而产生可测量的强度变化，可用于推断重原子的位置（图5).

图5
两个蛋白质衍射图样相互重叠并垂直移动。一个来自本地牛β-乳球蛋白和另一种来自浸泡在汞盐溶液中的晶体。注意某些反射的强度变化和相同的单位细胞（斑点的间距），这表明存在同构现象。（照片由林赛·索耶教授提供。）

弗朗西斯·克里克（Francis Crick）最著名的是他对DNA结构的贡献，但他也对大分子晶体学做出了几项贡献，包括估算了在同晶置换（克里克和马格多夫，1956年 ). 例如，使用以下公式，将单个汞原子添加到1000个原子的蛋白质中，预计会产生25%的强度平均分数变化

$[left\langle{{Delta I}\over I}\right\rangle=\left（{N_{H}}\over{2N_{p}}\right）^{1/2}{f_{H{}}\ over{f_p}}}，\eqno（4）]$

哪里N个_H（H）和（f）_H（H）是sin处重原子的数量及其散射因子θ=0°和N个_第页和（f）_第页是光原子的数量及其在sin下的散射因子θ=0°。同一篇论文还表明，对于100Ω立方单位电池单位细胞尺寸变化0.5%或分子在单位电池将产生平均15%的强度变化。因此同构是至关重要的。

$[\alpha_{\rm P}=\ alpha_}\rm H}\pm\cos^{-1}[（F^{2}_{\rm PH}-F^{2}_{\rm P}-F^{2}_{\rm H}）/2F_{\rmP}F_{\rm H}]，\eqno（5）]$

导致关于重原子相对称分布的两个可能解。

图6
SIR的Argand图|F类_P（P）|是自然晶体反射的振幅|F类_酸碱度|就是导数晶体的情况。

图7
SIR天然蛋白相的估计。

哈克结构更好地说明了这种相位模糊性（图8). 两个可能的相位值出现在圆相交的位置。然后出现了选择哪个阶段的问题。这需要考虑相位概率。

图8
SIR的Harker结构。

3.相位概率

实际上，存在与结构因子测量相关的误差、标度误差和非同构误差，以及导出的重原子位置及其占有率的误差，因此图6的矢量三角形很少关门。David Blow和Francis Crick（Blow&Crick，1959）)引入了缺少闭包的概念∊(6)及其在定义相位概率中的应用（7）（图9),

$[\eqaligno{\varepsilon&=|F{\rm PH（obs）}|-|F{\fm PH（calc）}|\cr&=|F{\rm-PH（obs(6)}]$

假设所有错误都存在于F类_{PH（计算值）}如果误差服从高斯分布，则相位具有特定值的概率为

$[P（\alpha_{\rm P}）\propto\exp（-\varepsilon^{2}/2E^{2{），\，\，{\rm-where}\，\。\等式（7）]$

例如，可以以10°的间隔计算从0°到360°的概率，以产生相位概率分布，其形状可以由多项式的四个系数表示：所谓的Hendrickson–Lattman系数HLA、HLB、HLC和HLD（Hendrickson&Lattman，1970 ). Blow和Crick还表明，用代表相位分布质心的加权振幅计算的电子密度图误差最小。图10显示了SIR实验中一次反射的相位概率分布。分布的质心表示为F类_最好的其振幅为自然振幅|F类_P（P）|乘以功绩米，这是相位误差余弦的估计值。现代分阶段计划现在使用最大似然使用先进概率分布的方法，可以更好地模拟实验，从而获得更好的参数估计值（Otwinowski，1991 ; de La Fortelle&Bricogne，1997年 ; 潘努等。, 2003 ; Pannu&Read，2004年 ). 这些方法用于MLPHARE公司（合作计算项目，第4期，1994年）),夏普,英国石油公司3和相位器（麦考伊等。, 2007 ).

图9
缺乏封闭性。

图10
SIR实验中一次反射的相位概率。F类_最好的是分布的质心。使用计算的地图|F类_最好的|经验(我α_最好的)[或米|F类_P（P）|经验(我α_最好的)〈成本Δα〉，其中米是优点的数字]误差最小。米=0.23表示76°相位误差，因为cos（76）=0.23。

图11显示了部分单位电池唾液酸酶的鼠伤寒沙门菌（克伦内尔等。, 1993 )使用单一汞衍生物进行定相。虽然蛋白质-溶剂边界部分明显，但电子密度仍然无法预测。

图11
(一)带有最终C的无法解释的2.6ÅSIR电子密度图^α叠加结构的痕迹。ρ(x个) = (1/五) $[\textstyle\sum]$ 米|F类_P（P）|经验(我α_最好的)×经验（-2π我小时·x个). (b条)地图的一小部分，最后的结构叠加在一起。

使用多个重原子衍生物同晶置换（MIR）可以打破相位模糊，如图12所示对于三个圆以一个相位角重叠的完美情况。

图12
带有两个重原子衍生物的MIR的哈克图。

相位概率是通过将各个相位概率相乘得到的，如图13所示与图10相同的反射但这一次，三种重原子衍生物导致了尖锐的单峰分布，并伴随着较高的优值。

图13
一次反射的相位概率。(一)SIR实验中的单导数。(b条)三种衍生品。在MIR实验中P（P）(α_P（P）) ∝Πexp（−∊_我²/2E类_我²)，其中我从1到导数的个数相加。

4.阶段改进

很少有实验测定的相位足够准确，能够给出完全可解释的电子密度图。实验阶段通常是使用各种密度修改方法改善阶段的起点，这些方法也基于一些结构的先验知识。溶剂压平、溶剂翻转、直方图匹配和非结晶平均是用于修改电子密度和改善相的主要技术（图14). 溶剂压平是一种强大的技术，可以消除负电子密度，并将溶剂区域的电子密度值设置为典型值0.33 e Au⁻³与典型的蛋白质电子密度0.43e Au相比⁻³.使用自动方法定义蛋白质-溶剂边界；它们最初是由王（1985）开发的 )并扩展到互易空间莱斯利（1988）). 这种方法的一种变体是所谓的溶剂滑移法（Abrahams&Leslie，1996），它避免了迭代溶剂压平和相组合带来的偏差问题 ). 直方图匹配改变电子密度点的值，以符合电子密度值的预期分布。非晶体学对称性当一个分子的多个拷贝存在于非对称单元。这些方法最初被编码到程序中，例如糖尿病（Cowtan&Zhang，1999）),决心（特威利格，2002年 )和中枢神经系统（布伦格等。, 1998 ). 通过追踪主链和侧链自动解释电子密度图是另一种改进相位的有效方法。程序ARP协议/弯曲特别有用，并执行将虚拟原子放入电子密度图的循环，然后精细化，模型建立和更新（兰格等。, 2008 ). 类似方法可在RESOLVE（解决）尤其是作为菲尼克斯在阶段改进、模型构建和精炼（亚当斯等。, 2002 ). 对于广泛的自动判读，包括侧链的分配，这些方法通常需要至少2.7º分辨率的数据。然而，其他方法允许识别α-螺旋线和β-低分辨率的线，如Cowtan的海盗在这个问题的其他地方讨论过。在SHELXE公司，Sheldrick使用一种独特的新颖方法来调整密度（Sheldrick，2008)他的程序的最新版本包含了链式追踪，这在本期的其他地方也有讨论。密度修正技术不会把一张糟糕的地图变成一张好地图，但它们肯定会改进显示一些可解释特征的有希望的地图。

图14
密度改性技术。(一)溶剂展平使用自动方法定义蛋白质-溶剂边界，然后将溶剂电子密度修改为某个固定值。(b条)直方图匹配重新定义了地图中电子密度点的值，以便它们符合电子密度值的预期分布。(c（c）)非晶体学（NCS）对称平均将相同的电子密度值施加到与局部对称，在这种情况下，形成非对称单元。duck中与点相关的局部NCS对称算子A类给鸭子B类和C如图所示。

密度修正是一个循环过程，包括对修正后的电子密度图进行反向变换以得到修正后的相，将这些相与实验相重新组合（以免丢弃实验事实），以及计算一个新的图，然后对其进行修正，使循环继续收敛。如果采集到的原始数据具有更高的分辨率，则还可以使用此类方法提供超出可用实验相位信息的分辨率的相位。在这种情况下，修改后的贴图会在每个周期中反向转换为略高的分辨率，以为高分辨率反射的子集提供新相位。该过程如图15所示。溶剂展平和直方图匹配的应用示例糖尿病如图16所示对于鼠伤寒沙门氏菌唾液酸酶分阶段作用于三种衍生物。

图15
通过密度调整改善相位。

图16
(一)2.6μMIR电子密度。(b条)溶剂展平和直方图匹配后的电子密度糖尿病.溶剂包络线由糖尿病以绿色显示。

5.异常散射

5.1. 这个反常散射因素

这个原子散射因子包含三个分量：法线散射项（f）₀取决于布拉格角和两个术语（f）'和（f）不依赖于散射角，但依赖于波长。后两个术语代表反常散射发生在吸收边当X射线光子能量足以从内壳层提升电子时。色散项（f）'修改了法向散射因子，而吸收项（f）′′为同相提前90°。弗里德尔定律认为|F类_{香港特别行政区}| = |F类_{−小时−k个−我}|; 然而，在存在反常散射体的情况下，弗里德尔定律失效，产生反常差异，可用于定位反常散射物。图17显示了反常散射在K硒的边缘和图18显示了弗里德尔定律的崩溃。

图17
异常散射信号的变化与附近的入射X射线能量K硒的边缘。

图18
存在反常散射体时弗里德尔定律的破坏。（f）(θ, λ)=（f）₀(θ) +（f）′(λ) +如果′′(λ)|F类_{香港特别行政区}| ≠ |F类_{−小时−k个−我}|或|F类_PH（+）| ≠ |F类_PH（−）|.ΔF类^±= |F类_酸碱度（+）|−|F_酸碱度（−）|是Bijvoet差值。

反常或Bijvoet差异可以与Patterson或直接法定位异常散射体。然后，可以采用与SIR或MIR情况类似的方式导出自然结构因子的相位。异常散射可以用来打破单个中的相位模糊同晶置换实验，导致SIRAS（单一同晶置换异常散射）。注意，由于（f）“”术语，反常散射为同构项提供正交相位信息。在图19中有两个可能的相位值对称地位于（f）〃和两个可能的相位值对称地位于F类_H（H）MIRAS是一个术语，用于描述使用反常散射的多个同晶重原子替换。

图19
SIRAS的Harker结构。

5.2. 摩洛哥迪拉姆

异形置换有几个问题：晶体之间的非同构（单位-细胞变化，蛋白质的重新定向，构象变化，盐和溶剂离子的变化），定位所有重原子的问题，精炼重原子位置的问题，占有率和热参数以及强度测量的误差。如果没有明显的辐射损伤，使用多波长反常衍射/色散（MAD）方法至少可以克服非同构问题。为了最大限度地提高吸收和色散效应，数据是从单晶中收集的几个波长（通常是三个波长）的数据。通常，波长是在吸收时选择的(（f）′′）峰(λ₁)，在吸收曲线的拐点(λ₂)，其中色散项（f）′（它是（f）“”曲线）具有最小值，且在远程波长(λ_三和/或λ₄)最大化色散差λ₂.图20显示了反常散射体的典型吸收曲线，以及相位图和哈克图。

图20
MAD阶段化。(一)反常散射体的典型吸收曲线。(b条)相图|F类_P（P）|未测量，因此选择其中一个数据集作为“本机”。(c（c）)哈克建筑。

结构系数振幅的变化反常散射通常较小，需要精确测量强度。吸收曲线的实际形状应通过同步加速器的晶体荧光扫描实验确定，因为异常散射体的环境可能会影响吸收的细节。需要优秀的光学元件，以确保准确的波长设置，最小值为波长色散。通常，所有数据都是从具有高多重性的单个低温冷却晶体中收集的，以增加测量的统计显著性，并且数据收集的完整性尽可能高。信号大小可以使用类似于Crick和Magdoff针对同晶变化导出的方程来估计。图21显示了使用Ethan Merritt的网络计算器计算的200个氨基酸中两个Se原子的情况下的预测信号(https://www.bmsc.washington.edu/scatter/AS_index.html). 请注意，信号随分辨率增加而增加。

5.3. 悲哀的

现在，越来越多的蛋白质结构正通过单波长异常色散/衍射（SAD）方法仅使用一组衍射数据进行定相（Wang，1985）). 这方面的第一个证明是46残基蛋白crambin，它是利用Cu收集的内部数据与六种固有硫分阶段进行的Kα波长（亨德里克森和蒂特，1981年 ). 随后，证明了129只残留母鸡的蛋清溶菌酶（Dauter等。, 1999 )这种方法现在已成为常规（道特等。, 2002 ; 多德森，2003 ). SAD实验只提供了异常或Bijvoet差异的测量ΔF类^±= |F类_酸碱度(+)| − |F类_酸碱度(−)|. 然后将这些值用作重原子对散射的贡献的估计值，并启用直接或Patterson方法用来推导重原子的位置下部结构。假设SAD实验中单个反射的哈克结构（图22)表明，一旦知道重原子子结构，就可以得出该贡献的计算振幅和相位(F类_H（H）). 然而，蛋白质的阶段仍然存在模糊性结构系数，值对称地位于吸收贡献周围(（f）'）至反常散射。这种相位模糊性必须通过密度修改程序来打破，近年来，密度修改程序变得更加强大。在其最纯的形式中，SAD可以简单地利用大分子中存在的固有反常散射体，例如半胱氨酸和蛋氨酸的S原子或结合离子。挑战在于最大化和测量非常小的信号，因为当典型合并时，Bijvoet比率可能低至1%R（右）因子是该值的几倍。诀窍在于对适当波长的反射进行多次测量，以获得较高的多重性，从而在统计上准确测量异常差异。数据也应尽可能完整。

图22
SAD的哈克建筑。

人们对数据收集策略、缩放协议和收集数据的最佳波长进行了大量讨论。汉堡EMBL的一个小组进行了一项有趣而全面的研究，结果表明，对于一系列含有异常散射体的蛋白质，如S、P、Ca、Xe、Cl或Zn，波长约为2Å时，会产生最大的异常信号（Mueller Dieckmann等。, 2007 ). 铬的可用性Kα波长为2.29欧的辐射导致铬阳极用于基于S（Yang）的大分子的内部定相等。, 2003 ; 瓦塔纳贝等。, 2005 )或硒原子（Xu等。, 2005 ).

现在给出了两个示例，说明了SAD方法的威力。第一种方法涉及基于S原子（S-SAD）的相位调整，第二种方法基于单个汞原子的相位调整（Hg-SAD）。数据集和教程指南可以在https://www.st-andrews.ac.uk/~glt2/CP4对于那些希望尝试数据处理和结构解决方案的人来说。

5.4. S-SAD示例

本例使用在ESRF波束线BM14上采集的高精度S-SAD数据，分辨率为2.1º，波长为1.722º。晶体的两个方向用于收集760°的数据，其多重性为30倍。合并R（右）数据因子总体为0.067，最高分辨率外壳为0.252。该蛋白质由238个残基（27.3 kDa）组成，含有9种蛋氨酸，不含半胱氨酸，Bijvoet比率的估计信号为1%(ΔF类^±/F类;https://www.ruppweb.org/new_comp/anomalous_scattering.htm). 如果数据是使用Cu内部收集的Kα辐射信号将为～0.8%，而如果数据是在K硫边缘（～5°波长）信号为6%。在如此长的波长下收集数据是不可行的，有许多实际原因，例如空气吸收和衍射图样的扩散。ESRF也收集了高分辨率数据集，在0.9762欧的波长下，分辨率为1.45欧。这些晶体属于空间组 P（P）2₁2₁2₁，其中一个分子位于非对称单元估计溶剂含量为40%。SHELXC公司用于读取使用香港（HKL）-2000（Otwinowski&Minor，1997）)并准备一份由反常差异得出的重原子结构因子估计值列表。S-SAD数据的统计如图23所示并建议异常信号[〈d日''/sig \9002；或\9001(ΔF类^±)/σ(ΔF类^±)〉]可检测到约2.7℃。SHELXD公司（谢尔德里克，2008年)然后与分辨率为2.7º的数据一起使用，以找到下部结构异常散射体。SHELXE公司（谢尔德里克，2008年)用于计算Harker构造的质心相位，并进行密度修改以打破相位模糊。注意，重原子的双手都需要尝试，因为在确定重原子位置时可以任意选择手。在SHELXE公司这只需要用一个额外的开关再次运行程序来反转手。SHELXD公司似乎发现了所有九个硫位点和四个可能被溶剂离子占据的额外位点（图23).

图23
(一)来自的统计信息谢尔克斯显示S-SAD示例的异常信号。(b条)重原子位置由确定SHELXD公司.

图24显示了使用密度修正前后这些重原子衍生的相位计算出的2.1°下的电子密度图后者清晰地显示了密度修饰后的蛋白质-溶剂边界。将1.45º数据合并到SHELXE公司允许相位扩展，以提供高度可解释的地图（图25b条). 如果数据可用分辨率至少为2.0º，则在SHELXE公司可以调用（Usón等。, 2007 ). 在这种情况下，由于数据可用到1.45º，使用自由午餐算法将相位计算到1.0º，从而生成一个显著的图谱，从中可以很容易地读取蛋白质序列（图25c（c）). 请注意，这不是一个真正的1.0º图，因为扩展数据是生成的，而不是实验推导的，但自由午餐算法可以成为一个强大的工具来改进实验测量数据的阶段。最后，最新版本的SHELX公司结合了一种自动赛车算法，该算法试图创建聚丙氨酸模型（如图26所示），其主要用途是进一步改进阶段。SHELXE公司将160个残基构建到地图中，远远低于预期的238个残基；然而，该蛋白的前60个残基是无序的，在电子密度中不可见。在这个S-SAD示例中SHELXE公司用于自动构建符合序列的模型，使用ARP协议/弯曲（科恩等。, 2008 ).

图24
2.1 S-SAD示例密度修改前后的电子密度图SHELXE公司.

图25
S-SAD问题的改进阶段。(一)2.1Ω分辨率密度修正图。(b条)1.45º分辨率相位扩展图。(c（c）)“1.0°分辨率”免费午餐地图。

图26
由生产的自动变速聚丙氨酸模型SHELXE公司以1.45º的分辨率叠加在密度修正电子密度图上。

5.5. Hg-SAD示例

第二个例子涉及内部使用Cu从440个残基的Hg衍生蛋白收集的数据Kα辐射。该结构实际上是使用SIRAS（Xu等。, 2009 )，但有趣的是，可以使用反常散射Hg衍生数据集中的信息。此示例表明，在导数与本机不同构的情况下，值得查看单导数数据集的相位。汞衍生物衍射到2.1º的分辨率，收集的数据集只有四倍的多重性。立方晶体属于空间组 P（P）2₁3，带unit-cell参数一=125.3º，并且在非对称单元溶剂含量为64%。该蛋白质每个单体含有一个汞原子，估计Cu的Bijvoet比率为2.7%Kα（1.54º），仅略低于汞柱下获得的3.6%信号L（左）_三边缘（1.009°）。SHELXC公司显示异常信号出现在～3.2º；因此，仅限于此分辨率的数据被输入到SHELXD公司很容易找到单一汞站点。SHELXE公司用于确定2.1º分辨率的相，并通过自动跟踪调整密度SHELXE公司生成了一个由最终模型432个有序残基中的389个组成的多胺模型（图27).

图27
A类SHELXE公司-从Hg-SAD数据集导出2.1μl分辨率的电子密度图，该数据集由SHELXE公司视图位于晶体三重轴下方。

6.交叉晶体平均

蛋白质结晶学并不是针对每个蛋白质的黑盒技术；在MAD或SAD技术无法用于绘制高分辨率地图的情况下，仍然存在挑战。有时一种蛋白质有两种或两种以上的晶体形式，其中一种晶体形式可能有低分辨率的相，而另一种晶体形态则有高分辨率的数据。跨晶体平均涉及从一种晶体中映射电子密度单位电池进入另一个。然后可以导出新晶体形式的相位，并且通过晶体形式之间的密度的平均以及作为密度修改过程的一部分的可能的相位扩展，可以将相位引导到高分辨率。程序如图28所示.

图28
交叉晶体平均。同一蛋白质的两种晶体形式，其中一种形式的相位信息为低分辨率，存在高分辨率数据，但另一种形式（右侧）的相位信息未知。

交叉晶体平均的力量的一个例子是纽卡斯尔病病毒血凝素-神经氨酸酶（HN），其结构解决方案受到非同构问题的困扰（克伦奈尔等。, 2000 ). 来自同一结晶滴的原生晶体可能具有明显不同的单位-细胞尺寸。这种蛋白质是从鸡胚中生长的病毒中提取的，所以SeMet方法是不可能的。大多数重原子衍生物与天然晶体以及彼此之间都是非同晶的。发现了一种铂衍生物，在异常Patterson中出现了一个清晰的峰值，这导致了MAD阶段化，但信号太小了。这个P（P）2₁2₁2₁ 单位电池尺寸变化如下：一= 70.7–74.5,b条=71.8–87.0，c（c）= 194.6–205.4 Å. 最后，使用交叉晶体平均值从一个难以解释的低分辨率6.0ºMIR图引导到一个清晰可解释的2.0º分辨率图（图29). 选择了四个数据集进行交叉晶体平均DMMULTI公司并根据以下标准进行选择：（i）它们之间尽可能不同构，（ii）分辨率尽可能高。这些是pH值为7的室温数据，分辨率设置为2.8º(一 = 73.3,b条= 78.0,c（c）=202.6º），其中MIR相可用到6.0º，pH 6室温数据设置为3.0º分辨率(一= 72.0,b条= 83.9,c（c）=201.6º），pH 4.6低温冷却数据设置为2.5º分辨率(一= 71.7,b条 = 77.9,c（c）=198.2º），pH 4.6低温冷却数据设置为2.0º分辨率(一= 72.3,b条 = 78.1,c（c）= 199.4 Å). 该方法的威力在于不同的单位细胞在不同的地方对分子转化进行采样。和大多数东西一样，这个想法并不新鲜，布拉格和佩鲁茨在血红蛋白的早期确实使用过这个想法（Bragg&Perutz，1952 )，当他们改变单位电池通过控制脱水对晶体进行处理，以对单位单元格。这篇论文值得一读，如果只是因为它以伦敦和剑桥之间的火车时刻的形式完美地包含了随机测试数据的话！

图29
血凝素-神经氨酸酶（HN）的交叉晶体平均值。左，显示6.0º分辨率MIR图的单位单元，该图源自于8个重原子衍生物，轮廓为2.0σ，显示了与非对称单元。右，在四个非同构数据集上进行相位扩展和交叉晶体平均后的2.0º分辨率图的一部分。

7.结论

这个相位问题是根本性的，永远不会消失；然而，由于MR、MAD和SAD，其解决方案现在相当常规。同步辐射源的广泛可用性、探测器技术的改进、低温结晶学以及更复杂软件包的开发，促成了MAD的常规使用，并且SAD越来越多，在收集衍射数据的几分钟内就形成了新的大分子结构。SAD是一个不幸的缩写，它是一种可以给结构生物学家带来巨大欢乐的方法！

致谢

我感谢由苏格兰资助委员会和BBSRC资助的苏格兰结构蛋白质组学基金在S-SAD示例中使用的数据，并感谢George Sheldrick激发的讨论。我要感谢伊桑·梅里特（Ethan Merritt）允许我复制图17中他网站上的图表, 20和21.

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