3.1. Fc的推导γRIII公司

III型人Fc受体的细胞外配体结合域γRIII，包含两个免疫球蛋白样（类Ig）结构域，通过电喷雾电离测量分子量为21 000 Da质谱法（ESI-­MS）。通过将0.5–1µl不同浓度的预溶重原子化合物溶液与5–10µl Fc混合来制备衍生反应γ2–5 mg ml的RIII⁻¹在室温下在水中浸泡30分钟，然后将样品注入质谱仪。氯化汞的两种加合物₂分子量为2198和21398Da，相当于添加了一个和两个Hg²⁺除了自然峰外，还分别检测到了离子（图1)。此外，FcγRIII也被发现与K反应₂氯化铂₄、TMLA、醋酸铅和KAu（CN）₂（图1)。此外，电喷雾质谱（ESI-MS）发现的重原子位点的数量与晶体重原子的数量有很大的相关性精炼（Sun&Hammer，2000年).

图1 Fc的质谱剖面γRIII（计算分子量20 996 Da）与(一)氯化汞2, (b条)K2氯化铂4, (c（c）)TMLA、(d日)醋酸铅或(e（电子）)KAu（中国）2。在每个面板中标记剩余本征峰的分子量。与蛋白质共价连接的重原子数量显示在加合物峰之上（摘自Sun&Hammer，2000）).

3.2. KIR2DL2的衍生

KIR2DL2的细胞外配体结合区包含两个Ig样结构域，计算分子量为22 228 Da晶体结构之前已使用KAu（CN）测定了可溶性受体的₂作为重原子相位导数（Snyder等人。, 1999)。摩尔KAu（CN）的两个反应₂：在每个反应中使用6.5µg KIR2DL2在溶液中进行30分钟的KIR2DL2浓度比分别为9:1和28:1。ESI-MS显示了多达五个Au（CN）₂除了减少的天然峰外，加合物（图2)。溶液中衍生反应生成的加合物数量与X射线测定的重原子结合位点数量一致衍射分析（Sun&Hammer，2000年)。两个KAu（中国）₂反应中，氰化金与天然蛋白的摩尔比为28:1的反应产生的衍生峰强度高于摩尔比为9:1的反应，表明质谱峰强度与衍生反应中使用的重原子浓度之间存在相关性。

图2 氰化金衍生KIR2DL2的ESI-MS结果。KAu（中国）2-衍生化反应使用重原子与蛋白质的摩尔比(一)9:1和(b条)分别为28:1。KAu（中国）2-衍生峰标记为1-5。(c（c）)天然KIR2DL2的分子量为22 226.0 Da（摘自Sun&Hammer，2000）).

总之，质谱法提供了一种快速筛选重原子衍生物的方法。与传统的X射线衍射筛选相比，质谱法可用于筛选溶液中的潜在衍生物，从而避免使用晶体。溶液中典型的重原子衍生化反应和质谱数据采集可以在几分钟到几小时内完成，与X射线重原子衍生数据分析所需的几天到几周相比。这种基于质谱的筛选技术的局限性在于，它仅用于检测共价加合物。目前尚不清楚该方法是否适用于非共价结合的重原子，例如镧系元素，尽管Na⁺，氯⁻以及其他溶剂离子在质谱中经常被检测为蛋白质的加合物。

4.1. 鸡蛋白溶菌酶晶体的衍生化

两种以前已知能衍生溶菌酶的化合物，KAuCl₄和K₂氯化铂₆，以确定晶体浸泡的最佳时间和应使用的最佳重金属浓度。两种原始衍生物都是在重原子溶液中浸泡7–14天后获得的（Blake等人。, 1974)。对于快速橡木法，将溶菌酶晶体浸泡在10 mM（M）重原子化合物溶液10分钟，以下称为（10 mM（M），10分钟）浸泡。KAuCl的数据₄使用三种不同的浸泡条件从晶体中收集衍生物：（10mM（M），10分钟），（10米M（M），24小时）和（1米M（M），48小时）（表3)。只有10分钟浸泡产生的衍射数据与衍射分辨率判断的本地数据质量相似，R（右）_合并和我/σ(我)用于反射的最外层分辨率壳。浸泡24小时和48小时的晶体都衍射到比天然晶体更低的分辨率。有趣的是，10分钟的浸泡导致了最小的同晶R（右）因素(R（右）_{国际标准化组织})，重原子占位率最高。在10 min K下观察到类似的结果₂氯化铂₆浸泡不会降低溶菌酶晶体的衍射分辨率，而浸泡22和48小时再次导致衍射减弱和重原子占用率降低（表3)。当三个10分钟的数据分别用1、10和12.3 m浸泡时M（M）K（K）₂氯化铂₆对溶液进行了比较，结果表明Pt在1m内的结合明显较弱M（M）与10米和12.3米相比浸泡M（M）浸泡。这表明快速橡木法最需要较高浓度的重原子溶液。虽然长时间的衍生化反应应该会导致更大的重原子附着，但观察到的与较长浸泡时间相关的较低重原子占有率可以用较长浸泡时间引起的晶体非同构性的伴随增加来解释。通过与较长浸泡时间相关的单位-细胞参数的变化也可以看出同构的缺乏，而使用快速浸泡程序浸泡的晶体中没有这种变化。

4.2. 金融衍生品γRIII晶体

Fc公司γRIII结晶于空间组 P（P）2₁2₁2并衍射至1.8°分辨率。醋酸三甲基铅（TMLA）和氯化汞₂与受体发生反应，如下所示质谱法。从三次TMLA衍生浸泡中收集衍射数据：（5 mM（M），10分钟），（10米M（M），10分钟）和（10米M（M），24小时）。与溶菌酶测试类似M（M），10 min）浸泡比24 h浸泡产生更好的重原子衍生化（表4)。5米和10米两次10分钟浸泡的比较M（M）TMLA表明M（M），10分钟）浸泡比（5米）浸泡高出两倍多M（M），10 min）浸泡，再次表明较高浓度的重原子溶液对衍生化有直接影响。对于氯化汞₂浸泡，FcγRIII晶体浸泡在饱和氯化汞中₂（小于5mM（M）)不同时期的解决方案。隔夜浸泡导致晶格衍射的无序和损耗。而10分钟和2小时浸泡都会导致汞衍生化（表4)，浸泡2 h的两个主要Hg结合位点的占有率高于浸泡10 min的位点，这表明完整的HgCl₂衍生化比TMLA衍生化反应耗时更长，最佳浸泡时间可能因重原子化合物和研究中的蛋白质而异。

4.3. T的相位βRII结构

II型转化生长因子的胞外区-β（转化生长因子-β)受体（TβRII）已表达并结晶（博森等人。, 2000)。使用质谱法，氯化汞₂显示为衍生Tβ溶液中的RII。T晶体βRII通过饱和氯化汞浸泡衍生₂溶液10分钟后，在汞柱周围收集衍射数据L（左）_三 吸收边缘对于结构确定使用MAD。为了进行比较，还从使用与快速浸泡实验中使用的重原子浸泡溶液相同的重原子浸泡溶液衍生12小时的晶体中收集了等效MAD数据集。总的来说，快速橡木和12小时浸泡的阶段化统计数据非常相似，说明了快速橡木在衍生化和后续阶段化中的有效性。同样，计算得出的R（右）_{国际标准化组织}快橡木衍生物的（0.23）比长时间浸泡的（0.37）低，表明长时间浸泡会增加晶体的非同构性。这也反映在unit-cell参数的1.1°变化中一在晶体浸泡12小时的情况下一对于浸泡10分钟的晶体，由于相来自同晶置换(F类_酸碱度−F类_P（P）)导数数据集和本地数据集之间的非同构会影响术语，它们通常与由反常和多波长分量导出的相位不一致。结合这些相位的尝试通常会产生电子密度图，其质量比根据MAD阶段独自一人。在这个例子中，从较短浸泡中得到的组合相（SIRAS图）不仅比从较长浸泡中获得的相更好，而且也比MAD相图更好，清楚地证明了快速浸泡在减少晶体非同构方面的好处（图3).

图3 T的实验电子密度图βRII与氯化汞相结合2衍生产品。(一)MAD相电子密度图中1等高线区域σ使用相应的细化模型。(b条)通过10分钟快速橡木制作的SIRAS地图。(c（c）)长时间浸泡12小时得出的SIRAS图（摘自Sun&Radaev，2002）).

4.4. NKG2D–ULBP3晶体的相位

NKG2D是一种14kDa的C型凝集素样受体，表达于自然杀伤细胞和某些T细胞的表面。ULBP3是一种24 kDa I类主要组织相容性复合体抗原样分子和NKG2D配体。NKG2D–ULBP3复合体的晶体衍射到2.6º分辨率（Radaev等人。, 2001)。K（K）₂氯化铂₄、KAuBr₄和KAuCl₄质谱分析显示为重原子加合物。尝试将NKG2D–ULBP3晶体浸泡在含1m的溶液中24小时M（M）所有这些重原子化合物都导致晶格无序，衍射损失超过6º分辨率。相比之下，10米内的晶体快速橡木M（M）K（K）₂氯化铂₄10分钟后，衍射没有明显的恶化。总共确定了四个Pt重原子位点，并且重原子定相导致0.41的总优值。同样，SIR和MAD相的组合比仅从MAD相计算得到的电子密度图更好（图4)。值得强调的是，在这种情况下，只有快速浸泡程序才能产生可用的相位导数，所有较长的浸泡时间都会导致晶格混乱。因此，对于容易被重原子浸泡损坏的低分辨率衍射晶体，与传统的长浸泡相比，短浸泡具有极大的优势。

图4 NKG2D–ULPB3复合物的实验电子密度图2氯化铂4导数。(一)由MAD和SIR相组合生成的电子密度图，等高线为1σ显示β-ULBP3链。(b条)单独由MAD相产生的电子密度图显示了与(一)（摘自Sun&Radaev，2002）).

与较长的传统浸泡法相比，快速橡木法有三个主要优点。首先，它通常保持晶体的衍射分辨率。在所有测试的例子中，与天然晶体相比，快速橡木衍生反应没有导致衍射分辨率明显下降。相比之下，从夜间浸泡的晶体中收集的数据通常显示分辨率和数据质量都有所下降。在某些情况下，浸泡更长的时间会导致完全的晶格紊乱。其次，快速橡木方法最小化了与派生数据集相关的非同构。这反映在这里描述的所有快速橡木示例中较小的单元间参数更改和更好的阶段化统计中。第三，快速橡木法节省了时间，并为高通量的“空中”实时重原子筛选提供了潜力。

4.5. 重原子浓度和浸泡时间的选择

在传统浸泡中，重原子试剂的浓度通常受到其对晶格以及随后的衍射分辨率。在上述所有四个快速橡木试验案例中，这些不利影响可以忽略不计。因此，为了实现彻底衍生化，可以而且应该在快速橡木实验中使用更高浓度的重原子试剂。在溶菌酶和Fc中γRIII示例：最大重原子占用率是在10 mM（M）或更高浓度的重原子试剂。大多数快速橡木实验都是在10分钟到2小时之间进行的。最佳的浸泡时间是在实现高重原子结合占有率和最小化浸泡过程中产生的晶体非同构之间的平衡。