2.1、。收集无序序列的数据

任何无序预测方法的核心都是对已知的有序或无序序列数据库进行排序。有序序列可以很容易地从蛋白质数据库（PDB；Sussman等。, 1998; 伯曼等。, 2000). 虽然不可能知道哪些残基是有序的，哪些是无序的，但结构尚未确定的蛋白质也可以通过使用诸如异核单量子相关（HSQC）光谱等技术进行大量排序。相反，很难收集无序序列的数据。为了确认是否存在紊乱，必须有可溶性蛋白质，在许多情况下，这是不可能的，因为紊乱区域本身的存在加剧了这种情况。通过晶体学方法无法确定完全无序的蛋白质的结构，因此必须使用包括核磁共振在内的光谱方法来研究这些蛋白质（Wright&Dyson，1999). 对于部分有序的蛋白质，可以确定局部结构从而推断缺失区域是无序的，例如在人类朊蛋白（Zahn等。, 2000). 由于这些部分结构通常被沉积，PDB也是与部分有序结构相关的无序序列的最大存储库。乌弗斯基等。(2000)以光谱方法为特征的表列完全无序序列，而Yang等。(2005)在2004年4月29日发布的PDB中搜寻，使用大分子结构数据库（MSD；Boutselakis）寻找无序序列等。, 2003)在欧洲生物信息学研究所。虽然只有一小部分已知蛋白质的结构得到了测定，而且由于只能包括部分结构蛋白质，因此这种方法有一定的偏差，但这是迄今为止最大的无序序列资源。在本文中，重复并更新了分析，以反映截至2005年10月18日PDB的状态（表2; 详细数据可从罗恩网站，https://www.strubi.ox.ac.uk/RONN). 预计数据会包含一些错误，例如晶体结构测定，其中蛋白质的末端区域可能被错误地归类为无序。这些区域可能会丢失（i），因为它们确实是无序的，（ii）因为它们通过柔性连接物连接到分子的其余部分，因此相对于分子的其余部位没有固定的方向，或者（iii）因为该区域可能由于意外的蛋白水解而从结晶实体中缺失。创建了另一个实验测量的紊乱序列资源，以评估折叠索引（普里卢斯基等。, 2005)可以在以下位置访问https://www.weizmann.ac.il/sb/faculty_pages/Sussman/papers/supl/Prilusky_2005.

表2 从PDB中提取的疾病信息 该表总结了假定存在于结晶/分析实体中但未构建结构的蛋白质序列部分。2005年10月18日的分析仅限于X射线晶体学测定的结构。   PDB，2004年4月29日 PDB，2005年10月18日 PDB中的条目 25931 34347 仅包含短无序区域的条目 5754（5–20个残留物） 6105（5–18个残留物） 过滤后这些条目中无序区域的数量† 1925 2866 包含至少一个长无序区域的条目 1573（>20个残留物） 1841（>18个残留物） 过滤后这些条目中长无序区域的数量† 530 687 筛选后这些条目中的长有序区域数† 891 1358 †过滤异多聚物复合物和高度冗余序列的删除条目。冗余使用解决CD-HIT光盘（李等。2001年, 2002)以去除与集合中的其他序列相同超过70%的序列。

2.2. 预测问题的不同方法

众所周知，无序序列的氨基酸组成不同于有序序列（加纳等。, 1998)由于氨基酸侧链的物理性质不同。因此，大多数无序给药方法侧重于单个氨基酸的特性，要么基于实验测量的参数，要么基于已知有序或无序序列的统计分析计算（Wright&Dyson，1999; Dyson&Wright，2004年)例如蛋白质紊乱数据库(https://www.disprot.org/). 许多不同的参数化方法已经尝试过，并体现在基于规则的神经网络方法中，例如PONDR公司,全球地图,DisEMBL（解散）和已被淘汰2（见表1). 然而，这种方法最简单地封装在折叠索引（普里卢斯基等。, 2005)，它对Uversky派生的规则进行编码等。(2000). 该程序最初设计用于对任何给定序列进行“有序”或“无序”的单一总体预测，但后来被修改为给出过残留无序倾向，因为这对结构设计很有用。虽然氨基酸的物理性质在确定无序性方面显然是基本的，但神经网络用于罗恩（杨等。, 2005)故意避免以这种方式对氨基酸进行显式参数化。相反，它使用非间隙序列比对来测量未知蛋白质的序列窗口与PDB分析得出的已知折叠状态蛋白质的窗口序列之间的“距离”。因此，在某种意义上，折叠索引和罗恩代表了解决无序预测问题的两种极端方法，尽管这两种方法各有优缺点，但与其他无序预测方法相比，它们表现得很好。图1使用2004年4月29日发布的PDB数据，将这两种方法与其他最广泛使用的疾病预测因子进行比较。不出所料，鉴于上述讨论，折叠索引对于完全有序或完全无序的序列表现特别好，而罗恩在识别部分无序序列方面更为成功。

图1 九种不同无序预测方法的预测性能评估。(一)完全有序和完全无序序列的平衡混合盲测试结果。(b条)从PDB中提取的部分有序序列的盲测试结果。参见§2.3用于术语讨论。转载自杨等。(2005)经牛津大学出版社许可。

2.3. 预测的测量精度

乍一看，评估用于预测给定氨基酸（或氨基酸序列）是有序还是无序的算法的价值似乎微不足道。然而，由于任何算法的有效性都严重取决于正确预测和错误预测的重要性和后果，而正确预测和不正确预测又取决于算法的应用，因此不可能设计出一种通用的度量方法。计算机科学中已经定义了这种二进制分类器的许多度量方法，并且在web上发布了一篇关于文本分类的可访问讨论(https://www.islanddata.com/downloads/irt_whitepaper_perfmeasure.pdf). 第二个问题是，对算法的描述通常引用交叉验证结果，而不是真正的盲测试结果，这会产生更真实的结果。最后，由于测试集往往包含相对较少的无序氨基酸，并且在实验结构设计的“现实世界”中，它们的出现频率甚至更低，因此，算法性能的良好度量不能受到这些相对类频率差异的过度影响。从事结构设计的实验科学家真正想要的是一个关于算法比简单猜测好多少的现实想法。诸如“概率过剩”（Yang等。, 2005)CASP试验中使用的相关评分函数试图提供这样的衡量标准，并表明目前可用的最佳算法大约比对部分有序结构进行盲测试的猜测要好50%。图1介绍了常见方法的概率过剩评估，包括罗恩和折叠索引然而，如果问题只是“给定的序列是否构成有序结构？”然后是当前的方法，特别是全局预测因子，如折叠索引，可以提供更高确定度的答案。

衡量算法性能的最后一个复杂因素是，无序序列本身并不构成同质类：有些复杂度较低，例如含有20个或更多连续谷氨酸残基，有些是看起来相当复杂的长序列，有些是有序序列中的短区域，显然对无序有强烈的偏好。下文将详细讨论这些观察结果。不同的算法可以更好地适应不同种类的无序，因此算法的相对性能会根据无序预测的上下文而有所不同。例如，使用无序预测来检测域之间的链接器区域本质上是检测短（ish）无序区域和使用长预测窗口的方法的要求，例如当前版本的罗恩，因此可能会降低灵敏度。

3.1. 脊椎结构分析

为了评估预测方法的稳健性，将沉积有PDB的初始SPINE结构集用作现实的（但不是严格意义上的“盲”）测试集。在分析时，MSD已对139个沉积的脊椎结构进行了充分注释，其中15个对应于蛋白质-蛋白质复合物，但未进行进一步分析；其他4人因其他原因被排除在外。其余120个结构中，47个不含无序，73个部分无序，共有25230个有序残基和1476个无序残基。与“真实世界”的用法一致，数据集没有以任何方式进行过滤以删除相似的序列，也没有删除训练集中可能使用的序列。此外，这组包含的真核来源的结构（45%的结构）比PDB整体上的结构要多得多（表3). 因此，预计该数据集对于预测算法来说是困难的，尤其是折叠索引它既不是为部分有序结构设计的，也不是针对部分有序结构进行训练的。的预测结果罗恩（表3)表明其表现与之前公布的盲试结果一致（杨等。, 2005)尽管本试验中无序残留物的比例大大降低（5.5%，而10.9%）。然而，原核生物蛋白质的表现明显更好，这表明训练偏向于这些蛋白质，并且原核生物和真核生物领域的蛋白质之间存在显著差异。有点令人惊讶的是，真核生物组比原核生物组含有更少的失调，尽管使用失调预测工具的基因组研究表明，失调在真核生物中更为普遍。这种明显的异常可能反映了在真核蛋白质研究中的困难：要么靶点选择更保守，要么只有非常有序的真核蛋白质才能成功地进行结构测定。与此形成鲜明对比的是，对于一小组病毒蛋白，这两种预测罗恩和折叠索引实际上是无用的。虽然这项试验的规模使得很难对这一观察结果给予太大的重视，但很有可能表明病毒蛋白，特别是结构蛋白中的紊乱决定因素可能与其他蛋白质的紊乱决定因子有所不同。如上所述，折叠索引发现所有预测都更加困难（表3)尽管对原核蛋白的预测仍然有用。

3.2、。无序预测在建筑设计中的应用

在结构蛋白质组学开发方法的SPINE范围内，无序预测的唯一最重要用途是作为构建设计的辅助。许多生物医学上重要的蛋白质都含有紊乱区域，这些区域往往与结构测定， 例如因为它们可以促进聚集，降低溶解度或抑制晶体生长。然而，由于PDB中的许多结构部分无序，PDB是无序数据的最大来源，也是大多数分析的基础。在许多怀疑无序的情况下，晶体生产的最佳策略是并行使用多个结构（例如，参见Banci等。, 2006)无序预测已成为结构设计过程中的一个重要工具。

无序预测只是一系列工具中的一种，可以为建筑设计提供信息。其他包括与基于序列或结构的域定义的比较、信号检测肽类和核定位序列，检测疏水性和低复杂性区域，与PDB中已经沉积的结构以及与感兴趣蛋白质相关的任何已知功能数据或突变数据对齐。生物信息学的一个重要目标是以一种简单、最好是可视化的方式呈现所有这些信息，研究人员可以方便地访问和评估这些信息（参见Albeck等。, 2006).

大多数疾病预测器的输出是一个过残留疾病概率图，50%的概率被用作决策阈值。然而，这有点不切实际，主要是因为方便，例如，一个残基是否有序还取决于总序列长度，完整的结构域是否在表达结构中，当然，也取决于最终的蛋白质环境。然而，这些图表很有用，我们的经验主要基于罗恩和折叠索引，表明对输出进行更仔细的分析是合理的。首先，被预测具有极低无序概率的区域往往对应于疏水区域和跨膜序列，这些区域可能使构建物与无序区域一样难以使用。其次，尽管使用了50%的单一预测阈值，但最好将精确的转移残差定义为在一侧的有序残差和另一侧的无序残差的概率平台之间的一半。第三，对于依赖预测窗口的方法，用户应该了解它们引入的平滑效果。虽然结构域之间的短无序连接体可能不够长，无法对任何超过50%的残基进行单独预测，但在图中仍然可以清楚地看到较低的峰值。

最后一个考虑因素是，结构设计的目标是能够以稳定、良好的可溶性形式表达部分（或全部）感兴趣的蛋白质。这可能需要在决定起点和终点时相当精确。将一个或两个以上的残基切割成有序结构域可能会破坏整个结构域的折叠，而过于保守并在表达结构上留下一条长而无序的尾巴可能会对溶解度产生不利影响，同质性和结晶性。所有可能的N端和C端截短的详尽表达筛选结果（Hart&Tarendeau，2006)表明可接受的窗口可能很窄，可能不超过五种氨基酸。虽然许多疾病预测因子可以给出与观察到的疾病基本一致的结果，但要达到这一精度水平，还需要进一步改进算法。

3.3. 不同类型的紊乱？

很可能，蛋白质并不是偶然地具有紊乱的区域。随着对无序的研究进展，人们已经清楚地认识到，并非所有的无序都是等价的，而且似乎如果存在不同类型的无序，那么它们必须实现不同的目的。长期以来，携带许多带电氨基酸的低复杂度序列被认为是无序的，其中一些可能在将蛋白质锚定在带电表面（如膜）上发挥作用。还存在其他含有脯氨酸和甘氨酸重复序列的低复杂度序列，它们可能充当间隔物或“柄”。一些长的无序区域具有更复杂的序列，类似于结构区域，甚至可能包括“结构保护”氨基酸，如Trp、Tyr和Phe。一种可能性是，当这些区域与同源伴侣结合时，可能会转变为有序状态，而“结构友好”氨基酸则可能在复合物形成中发挥关键作用。短的紊乱区域经常出现在大量有序的蛋白质中；在这里，一种可能性是它们在某种程度上反映了父基因的进化历史，另一种可能性则是它们在蛋白质表面上增加了一个需要多样性的点。氨基酸在这些柔性环中的分布很有特点，以甘氨酸为主。最后，无序区域中最常见的一个基序完全是人为的：纯化His标签是所有无序序列组中最容易检测到的。

上述讨论产生的自然问题是，这些不同类型的无序序列是否以任何可能对无序预测算法有用的方式聚集在一起。这又取决于不同类型的疾病是否可以从序列中单独分类。三种方法提出了自己的观点：（i）无序区域是否可以划分为可单独表征的子组，（ii）不同长度的无序区域，尤其是非常短的区域，是否具有特征序列，以及（iii）有序和无序之间的过渡特征？根据对从PDB中提取的疾病数据的初步分析（结果如表2所示)前两个问题的答案并不明确。除了明显无序的序列外，要产生将有序序列和无序序列分开的序列簇，需要将非常精细的簇聚成许多小簇。这与牛津集团在罗恩增加原型序列的数量显著提高了性能。然而，检测有序到无序和无序到有序转换的特征序列更为成功（图2). 尽管之前尝试过小规模（Radivojac等。, 2003)，这项大规模分析表明，不仅某些氨基酸更有可能在过渡的两侧发现，而且这些频率明显高于在有序或无序的长区域中间观察到的频率。此外，有序-无序转换的氨基酸分布实际上反映了无序-有序转换的分布，表明这些效应在初级序列中是双向的。我们正试图在新的无序预测算法中利用这些发现。

图2 基于PDB分析的有序态过渡边界两侧的氨基酸频率（表2). 基于频率(一)关于1709年有序无序转变和(b条)关于1918年无序到有序的转变。考虑了过渡边界两侧五个氨基酸的窗口，并用WEBLOGO公司（弯钩等。, 2004). 每个单字母氨基酸代码堆栈的高度与(即氨基酸在）每个残基位置的重要性，而堆栈中每个氨基酸代码的高度与其在该位置的相对频率成正比（参见Crooks等。, 2004更多详细信息）。颜色反映了氨基酸的种类(即带电、芳香等.）.顺序状态转换边界由每个图中的中心间隙表示。

3.4. 结论

对于结构蛋白质组学（因此对于脊椎），疾病预测的最重要应用是构建生物医学重要性蛋白质的设计。这是一个要求极高的应用，因为许多这些蛋白质都是部分有序的（最难预测的无序），并且需要非常准确地定义有序和无序区域之间的边界，以便有助于定义稳定的可溶性结晶结构。

许多简单易用的预测蛋白质紊乱的方法现在可以在互联网上找到。虽然不同的方法具有不同的优势，因此不同的程序可能更适合特定的应用，但最好的工具似乎比猜测要好50%左右。折叠索引计算序列中所有氨基酸的物理性质，以确定有序或无序的总体概率。许多方法将氨基酸的物理性质参数化，以训练神经网络等学习算法，而罗恩使用神经网络结合无间隙序列比对原型序列，以避免必须明确定义相关物理属性。

随着这些方法的发展和更多无序序列的分析，无序显示出许多微妙之处。氨基酸在无序区域中的分布取决于无序区域的长度和与有序区域的接近程度。这为新一代无序预测仪带来了希望，它将更加可靠，尤其是在定义无序区域的精确末端方面更为出色。目前正在进行改进算法的工作。