GRETA, a new multifermenter system for structural genomics and process optimization

Hedrén, M.; Ballagi, A.; Mörtsell, L.; Rajkai, G.; Stenmark, P.; Sturesson, C.; Nordlund, P.

doi:10.1107/S090744490603441X

研究论文

生物
结晶学

国际标准编号：1399-0047

第62卷| 第10部分| 2006年10月| 第1227-1231页

doi:10.1107/S090744490603441X

GRETA，一种用于结构基因组学和过程优化的新型多发酵系统

玛丽·赫德伦,^一安德拉斯·巴拉吉,^b条拉尔斯·默特塞尔,^b条吉吉·拉杰凯,^b条波尔·斯坦马克,^一克里斯特·斯特里森 ^b条和帕尔·诺德隆德 ^一 ^*

^一瑞典斯德哥尔摩SE-109 51卡罗林斯卡研究所医学生物化学和生物物理系^b条瑞典索尔纳Ingentingsgatan 2号Belach Bioteknik AB
^*通信电子邮件：par.nordlund@ki.se

(2005年12月7日收到； 2006年8月27日接受)

作为欧洲结构蛋白质组学（SPINE）项目的一部分，开发了自动化多发酵系统GRETA，将结构基因组学作为主要应用。GRETA包括6–24个并联发酵室，每个室单独控制发酵温度、搅拌、pH值、溶解氧浓度和进料曲线等参数。使用六种人类蛋白优化GRETA发酵并将这些过程与结构基因组学项目中使用的典型挡板烧瓶方案进行比较。优化后的GRETA工艺允许在有限的人工干预下，每升培养物产生数倍多的蛋白质，并为结构蛋白质组项目的扩大生产和发酵过程优化提供了潜在有用的替代方案。

关键词：结构基因组学发酵;高电池密度;高通量管道.

1.背景

结构基因组学计划旨在建立成本效益高的管道，以生产大量不同的蛋白质。结构基因组学中开创性的蛋白质生产工作集中于实施精简和稳健的原核蛋白质生产方案并评估其效率（Edwards等。, 2000 ; 海涅曼等。, 2000 ; 迪克曼等。, 2002 ). 目前，结构基因组学中的蛋白质生产仍然采用相对简单的表达和纯化策略。

基于大肠杆菌表达系统，然后扩大规模发酵在带挡板的摇瓶中，一到两个通用纯化步骤是靶向原核蛋白的成功项目的共同标准。然而，按结构研究所需数量生产蛋白质的成本仍然相对较高，部分原因是放大过程需要大量的人工干预。真核蛋白质的研究进展一直滞后，因为它们在适当数量和质量上比原核蛋白质更难用于结构研究。与原核蛋白质相比，真核蛋白质的通用蛋白质生产方法仍可能需要更复杂的技术和策略。高效大规模生产低表达蛋白质和蛋白质结构域很可能是这些策略的重要组成部分。此外，每个真核蛋白质或蛋白质结构域的几个不同结构体的扩大生产可能是一个关键组成部分。因此，在未来的结构基因组学项目中，放大过程的自动化和集成对于降低成本和高效生产仅以低或中水平表达的蛋白质至关重要（Lesley&Wilson，2005 ).

目前，在带挡板的烧瓶中培养是扩大规模的主要解决方案发酵在结构基因组学项目中。使用富培养基，可以通过流线型培养基常规获得10–25 OD区域的细胞密度发酵协议。然而，这些培养物的维护是耗时的，因为它包括准备和收获以及OD的监测。最近，开发了允许自动感应的介质，因此不需要OD测量来确定感应时间（Studier，2005 ). 然而，这些培养基中的蛋白质表达通常发生在静止相，这可能导致产生较低水平的可溶性蛋白质。在需要重新生长以生产更多批次蛋白质的情况下，折流瓶培养物的再现性也是一个潜在问题，因为它们的控制水平较低，并且可能比封闭发酵罐系统更容易受到感染。

作为折流瓶培养物的替代品，平行气泡瓶发酵还开发了用于结构基因组学应用的设备（Lesley&Wilson，2005). 泡泡瓶允许在有限的空间内进行更多的发酵，每个培养单元中的细胞密度可以比带挡板的摇瓶中的细胞稍高。诺华研究所通常使用96个带气泡的烧瓶，每个烧瓶可以培养80毫升的细菌（Lesley&Wilson，2005). 然而，气泡烧瓶发酵该系统仍需要与摇瓶培养类似水平的人工干预，尚未被更广泛的结构基因组学社区使用。

高度自动化的发酵罐配备了更广泛的发酵控制系统，具有生产高密度细胞培养物以及高度重复性的潜力。它们还提供了一个自动化平台，可以在其中添加采集和进一步的细胞处理。然而，迄今为止，发酵罐尚未广泛用于结构基因组学项目，尽管一些项目已经调查了它们的用途。在结构基因组学中缺乏发酵剂的一个主要原因是市场上缺乏合适的商业发酵剂。

在本研究中，我们开发了一个多发酵系统GRETA，专门为结构基因组学项目的需要而设计。我们使用GRETA建立了一个高细胞密度来生产六种人类蛋白质。我们表明，与在典型的折流瓶培养中达到的值相比，该过程可以在不损失每个细胞的可溶性蛋白量的情况下产生高细胞密度。因此，GRETA为结构基因组学项目中发酵的有效放大提供了一个潜在的平台。

2.GRETA多重发酵

GRETA多发酵系统由生物反应器单元组成，每个单元包括六个并联单元发酵腔室（图1). 一个GRETA系统可以集成多达四个生物反应器单元（24个平行发酵室）。每个发酵罐室均采用不锈钢制成，最大工作容积为0.5或1升。1 l发酵罐室允许发酵范围为0.2–1 l。每个发酵罐室配备一个磁性耦合底部搅拌器，带有组合式叶轮/喷雾器、无菌空气过滤器和O型环₂/N个₂/空气-气体混合系统。单个就地清洗（CIP）站支持GRETA系统的1–4个生物反应器单元。该装置为CIP、容器和输送管线以及介质制备和温度调节提供高压洗涤液。所有与介质或产品接触的部件都可以在将介质注入六个发酵罐之前进行就地消毒（SIP）。发酵罐内的培养基也可以进行选择性杀菌。GRETA多发酵系统由GRETA生物幻影该程序允许从灭菌到收获对所有发酵罐室进行完全控制（图2). 每个腔室都是单独控制的，可以调节溶解氧浓度（DO）、pH值、温度和搅拌。每个发酵罐中也可以单独应用介质添加和诱导的进料曲线。传感器的校准以并行方式和半自动化模式进行，以最小化设置时间。这个GRETA生物幻影程序经过专门设计，以便于设置并行发酵从并行运行和监视数据发酵运行（图3). 该系统还向数据历史记录员提供过程和操作数据的采集，以便进行报告和归档。

图1
GRETA的生物处理单元，包括12个发酵室。

图2
这个GRETA生物幻影显示四个可能的生物处理器单元A–D之一的配置和输出参数的软件。

图3
BL21（DE3）中表达的六种不同蛋白质的生长曲线，生长在含有特棒肉汤饲料的支持最小培养基中。

GRETA发酵罐可根据预期用途进行不同配置。对于将执行简化流程的结构基因组应用程序，预计可能需要比用于例如生物制药流程优化的系统更低的控制水平。本研究中使用的GRETA系统配置有两个生物处理装置（12发酵腔室）。每个腔室都配备了四个泵（主要用于pH控制和喂料）、pH传感器和溶解氧传感器，但没有气体传感器。该系统还配备了用于自动导入的气动注射器。光学密度由内置光度计在每个反应器中测量。校准后，该设备允许在规定的吸收间隔内准确测量外径，在本研究中使用的系统中设置为10-50外径。

3.材料和方法

3.1. 细菌菌株和质粒

大肠杆菌用六种不同的人类磷酸酶相关基因转化BL21（DE3）菌株。基因AH04（PPME1_HUMAN）、AH09（PP2CG_HUMAN₆).

3.2. 媒体准备

实验中使用的培养液的组成列于表1中.所含的培养基（TB饲料）（每升蒸馏水）：胰蛋白胨（46.5 g）、酵母提取物（46.5克）、甘油（600 g）、MgSO₄·7小时₂O（3 g）和微量元素（1 ml）。将四环素添加到最终浓度30µg ml⁻¹以供选择。将硫酸镁、甘油、聚丙烯二醇（PPG 2000）和微量元素的储备溶液在394 K下分别消毒20分钟。所含微量元素溶液（每升蒸馏水）：FeCl_三·6小时₂O（54克），锌硫氧化物₄·7小时₂O（22克），氯化钴₂·6小时₂O（0.5克），钠₂哞₄·2小时₂O（0.5克），硫酸铜₄·5小时₂氧（0.13克），氢_三BO公司_三（0.5克），二氧化锰₄·H（H）₂O（11克）和浓缩H₂SO公司₄（10毫升）。硫胺储备（2 mg ml⁻¹)和IPTG（异丙基β-D类-吡喃半乳糖苷）储备（476 mg l⁻¹)通过过滤消毒并储存在253 K。开始时添加防泡剂PPG 2000，如果需要，在诱导时添加。

表1
媒体的组成

TB，美味的肉汤。SMM，支持的最小介质。

基本培养基（1升）	TB，摇瓶	SMM，摇瓶	SMM，发酵罐
色氨酸（g）	12	10	10
氯化钙₂（毫克）			14.7
酵母提取物（g）	24	5	5
甘油（g）	40	5	5
K（K）₂高性能操作₄（g）	2.31	5	5
千赫₂人事军官₄（g）	12.5	4	4
柠檬酸钠（g）			0.5
（NH₄)₂SO公司₄（g）		2.5	2.5
硫酸镁₄.7小时₂O（克）	0.98	0.98	0.98
硫胺–HCl（mg）	2	2	7
维生素混合物（ml）			1
微量元素（ml）	1	1	1

为每种构建物准备一个工作细胞库（WCB），并用于所有发酵的种子培养。收集菌落并在LB培养基中生长过夜，并用于在250ml锥形烧瓶中用0.1%甘油接种50ml LB。WCB的转速为303 K，200转/分⁻¹在HT Aquatron振动筛中（瑞士Infors），直到OD₆₀₀介于0.1和0.3之间。将甘油加入到17%的最终浓度，并将悬浮液在193K下储存在1ml等分试样中。在每次实验之前，将50µl WCB添加到50 ml LB（含1%甘油）中，进行接种培养，并在303 K下生长12–14小时。

3.3. 折流板烧瓶中的表达

800 ml培养基的培养（表1)在一个2 l的带挡板的烧瓶中接种20 ml接种物，并在310 K和200 rev min下培养⁻¹.在OD₆₀₀在～5℃时，温度在40分钟内降至291 K，然后进行IPTG诱导（0.5 mM（M）最终浓度）。培养物在291 K下隔夜继续生长，并通过离心法收获。

3.4. 发酵罐中的表达

发酵器实验在GRETA多发酵系统（瑞典Belach Bioteknik AB）中进行发酵每个反应器的容量为1升。大肠杆菌BL21（DE3）在310 K下生长，搅拌初始设定为500转/分⁻¹每15分钟测量一次OD。通过添加14%，将pH值调整到6.8到7.1之间(v（v）/v（v）)氨溶液或28%(v（v）/v（v）)磷酸。生物反应器中的溶解氧浓度（DO）通过改变搅拌器速度至1500转/分来控制，以保持大于30%的空气饱和度的恒定水平⁻¹接种物、消泡剂、IPTG和酸、碱或进料通过盖上有隔板的填充口转移到反应器中。通过下侧壁中的隔板端口进行样品去除。分批培养和分批培养都从800 ml培养基开始（表1)在反应器中，将pH调节至6.8至7.0之间。将消泡剂（1 ml）和20 ml接种物添加到反应器中以启动生长。通过以指数进给速度添加进料溶液来启动Fed-bacch模式，以确保0.3–0.4 l h⁻¹OD之前的比增长率₆₀₀达到50。这个发酵将温度降至291 K，并降低甘油进料速率以确保0.1 l h⁻¹特定增长率。蛋白质表达始于添加400 mM（M）IPTG。细胞生长14-15小时直到收获。

3.5. 收获

外径₆₀₀在稀释1/100的样品中测定。与160 OD相对应的摇瓶和发酵罐培养物₆₀₀装置以4500转/分的转速离心⁻¹在277 K下保存15分钟，并在193 K下保存颗粒，等待分析。

3.6. 镍净化和斑点

将冷冻沉淀重悬于2 ml细胞裂解缓冲液[20 mM（M）Tris–HCl pH值8.0，300 mM（M）氯化钠，1毫克毫升⁻¹溶菌酶，10 U ml⁻¹苯酶，0.1%n个-十二烷基β-麦芽糖苷（DDM），5%甘油，1 mM（M）硫酸镁₄，每25 ml，5 m，1×不含EDTA的完整蛋白酶抑制剂片M（M） β-巯基乙醇]在非变性条件下。细胞在193 K下通过三次冷冻-解冻循环被破坏。可溶和不可溶细胞组分在3000 K下通过离心分离和澄清克持续30分钟。通过添加150µl H制成镍净化板₂O和25µl Ni–NTA琼脂糖（Qiagen）涂抹到多屏幕板（MABVN1250，Millipore）的每个孔中。液体通过真空歧管吸入过滤器。在150µl颗粒缓冲液（20 m）中平衡Ni–NTA琼脂糖M（M）Tris–HCl，100米M（M）NaCl），在转移50µl澄清的裂解液之前，将平板在277 K下搅拌30分钟，并在100 K下旋转克30 s。用200µl洗涤缓冲液（20 mM（M）Tris–HCl pH值8.0，300 mM（M）氯化钠，500米M（M）咪唑，5%甘油，5米M（M） β--巯基乙醇）三次。50µl洗脱缓冲液（20 mM（M）Tris–HCl，500米M（M）氯化钠，40米M（M）咪唑，5%甘油，5米M（M） β-添加巯基乙醇），并在277 K下搅拌平板约5分钟。洗脱液通过100 g离心1分钟将其收集到一个新的平板中。将裂解液作为1.5µl点施加到Whatman硝化纤维素膜上，并在室温下风干。

3.7. 蛋白质检测

用TBST缓冲液（20 m）浸泡吸液膜M（M）Tris–HCl pH值7.5，150 mM（M）NaCl，0.05%吐温-20）在室温（RT）下振动筛上放置10分钟。在振动筛上用TBST清洗膜四次，持续15分钟。清洗后，用印度HisProbe-HRP（美国皮尔斯生物技术公司）在10 ml TBST中稀释1:5000培养60分钟，轻轻摇晃。在与根据制造商协议使用的SuperSignal West Pico Substrate（Pierce）孵育之前，对膜进行至少四次洗涤，并使用Fluor-s MultiImager（BioRad）CCD相机和相关设备检测信号数量1软件v.4.2.1。

4.结果和讨论

为了研究GRETA多发酵剂在结构基因组学应用中的有用性，我们进行了大量的发酵使用六种人类蛋白质进行测试。使用GRETA多发酵器和结构基因组学程序中通常使用的挡板烧瓶工艺在各种条件下进行发酵，以允许比较（i）细胞产量和（ii）每单位细胞产生的可溶性蛋白的量。最初，在GRETA多发酵罐中进行无补料分批发酵，以研究培养基的基本效果。随后，使用分批进料序列对这些工艺进行优化，以获得更高的OD。为了测试GRETA多发酵中心可持续的最大培养密度，在24小时OD达到120的情况下，在310 K温度下培养非诱导培养物h.使用相同菌株和相同培养条件的六种平行培养物提供了非常相似的生长曲线，表明GRETA多发酵罐中进行的过程具有高度的再现性（数据未显示）。

对于比较研究中使用的六种人类蛋白质发酵接种后在310 K下进行。将温度降至291 K后进行诱导。低温通常是有利的（Neubauer&Winter，2001 )用于生产可溶性蛋白质，并用于许多结构基因组学项目。OD也进行离线测量，作为额外的控制，以确定收获时的最终OD。一般情况下，GRETA上分批进料过程的最终OD在50–110 OD范围内（图4)，而挡板烧瓶中的OD在10–25 OD范围内。

图4
OD比较₆₀₀从摇瓶培养物和GRETA多重发酵中收获时。TB，美味的肉汤。SMM，支持的最小介质。

采用小规模亲和纯化和点-点程序测定每单位细胞可溶性蛋白的初步产量。OD在亲和纯化之前进行了标准化，以确保恒定的细胞质量。在大多数表达条件下，三种蛋白（AH19、AH20和AH26）的表达水平非常稳定，而其他三种蛋白质（AH04、AH09和AH33）对发酵使用的协议。对最终分批补料发酵的每OD单位蛋白质产量进行了更详细的量化，并与折流瓶发酵进行了比较（图5). 结果表明，高密度培养物每细胞产生的可溶性蛋白质数量与折流瓶培养物相似。GRETA产生的细胞质量是带挡板的烧瓶的2-5倍，该系统非常适合于中表达和低表达蛋白质的研究。这一点，再加上GRETA发酵的低培养基和人工成本以及培养物的高再现性，使GRETA成为一个有吸引力的扩大规模的平台发酵在结构基因组学项目中。

图5
通过计数摇瓶和发酵罐中每种蛋白质的蛋白质表达进行斑点印迹。

致谢

这项工作得到了欧洲委员会、瑞典研究委员会和沃伦堡北方联盟的支持，作为综合方案“生活质量和生物资源管理”下第QLG2-CT-2002-00988号SPINE（欧洲结构蛋白质组学）合同的一部分。

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