2.1. 蛋白质复合物的共表达大肠杆菌

2.2. 昆虫细胞中蛋白质复合物的共表达

杆状病毒感染昆虫细胞中蛋白质的表达和共表达已经使用了一段时间（有关最新综述，请参阅Kost等。, 2005). 最初，大多数实验都是用多个病毒进行的，每个病毒都携带一个过表达的基因。由于无法对这些病毒进行选择，因此这种方法的主要问题是，它会产生部分和全部的共同感染，通常需要非常仔细地量化病毒滴度才能获得合理的结果。然而，使用该技术已经获得并纯化了大的配合物，尽管数量很小（Tirode等。, 1999). 使用带有多个启动子的单个载体，其方式类似于大肠杆菌(§2.1.3），明显提高了产量，并已在许多情况下使用（伯杰等。, 2004).

2.3. 一种新的共同表达策略大肠杆菌

斯特拉斯堡实验室以前已经开发了一个共表达系统（弗里堡等。, 2001)基于两种载体【pET15b（Novagen）和pACYC11b，具有不同的抗性标记和兼容的复制来源】，这两种载体在许多情况下都被证明是成功的（Gangloff等。, 2001; 韦尔滕等。, 2002; 罗米耶等。, 2003). 该系统的主要局限性是只能同时表达两个基因。为了克服这一局限性，我们开发了一组新的载体（pET-MCN；pET米多用途-c（c）克隆和表达n个)这允许表达两个以上的基因，但也有足够的灵活性来测试纯化标签的影响，而不需要大规模克隆。最初，所有感兴趣的基因都被克隆到这两种载体中；克隆到pET15b载体中会产生每个基因的His标记版本，而克隆到pACYC11b载体中则会产生无标记版本。通过所有两两共表达实验，可以很容易地测试标签在复杂结构中的可能影响。为了能够一次表达两个以上的基因（每个载体一个），我们修改了pET15b和pACYC11b载体，以实现简单的“剪切粘贴”策略。在“切割”步骤中，切除包含RBS和感兴趣基因（已克隆到此载体）的T7启动子片段（切割）。在“粘贴”步骤中，将切除的片段连接到已经包含另一个基因（粘贴）的另一载体的T7启动子中。这种结构导致了一个带有两个不同基因的启动子，每个启动子前面都有自己的RBS。这种机制是基于限制性位点的兼容性Spe公司我，Xba公司我，Nhe公司我和平均二、 它们在每个克隆步骤中都不受影响，因此可以根据需要多次重复此过程，从而形成多顺反子结构。

Strasbourg中pET15b载体的进一步修改使其N-末端His标签被C-末端His标记或N-末端融合蛋白（硫氧还蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶、麦芽糖结合蛋白或NusA）替换，该融合蛋白与N-或C-末端的His标签相关或无关。这些不同的组合是为了提高将可溶性较差的蛋白质表达为可溶性融合蛋白的成功率，然后通过与天然伴侣的相互作用来稳定可溶性融合蛋白。到目前为止，已经使用了两个蛋白酶位点：凝血酶或TEV。限制性位点的引入能够很容易地替换融合蛋白或质粒上的蛋白酶位点，从而消除可能的溶解度问题或通过隐秘蛋白酶位点降解。总之，当考虑所有不同的融合时，已经生成了34个载体，它们都与剪切粘贴克隆程序兼容。

使用pET-MCN系统的典型工作流如图1所示(一)如下所述。

图1 (一)使用pET-MCN的建议工作流(pET米多用途-c（c）朗宁与表达n个)系统。参见§2.3了解更多详细信息。(b条)人类转录因子NFY的NFYB–NFYC异二聚体和NFYA–NFYB-NFYC异源三聚体的共表达（所有亚基都被截断到其进化保守区域）。所有样品都代表保留在钴珠上的络合物。分子量标记。通道1–3，使用原始pET15b/pACYC11b载体（1）和来自两个载体（2）或启动子（3）上带有两个基因的单个载体的pET-MCN载体共同表达His标记NFYC和非标记NFYB。车道4与车道3相同（双顺反子），但在NFYC编码基因前没有编码标签（没有保留）。通道5，表达来自pET-MCN载体的His-tagged NFYA。车道6，用于车道4和车道5的向量组合（His-tagged NFYA和双顺反子非标记NFYB/NFYC复合体），以生成完整复合体；这三种蛋白质都保留在珠子上。

最后，我们共同表达了三亚单位转录因子NFY，将His标记的NFYA克隆到修饰的pET15b中，将非标记的NFYB/NFYC组蛋白样对作为双顺反子克隆到修饰pACYC11b中。表达式测试显示三元NFY的正确形成（图1b条，车道6）。pET-MCN系统也在欧洲其他实验室进行了测试。值得注意的是，在EMBL中，三聚体复合物表达为两个载体的组合，一个载体包含单个基因，另一个载体在单个启动子上包含两个基因。将该复合物表达、纯化并解决其结构（Bono等。, 2004). 最近，编码三个亚单位的基因被附加到单个启动子中，复合物被表达和纯化为从两个载体表达的复合物（E.Conti，个人通信）。如有要求，可从斯特拉斯堡实验室获得所有矢量及其各自的地图。

3.1. 工作流和数据模型

数据模型如图2所示。我们选择了一个特定的数据模型，而不是一个更抽象的模型：这种选择保证了功能和开发速度，因为图形用户界面直接指的是数据结构。然而，未来的可扩展性受到了损害，这应该被视为一种短期解决方案，将被PIMS取代。虽然工作流程和模型的设计明确允许在大分子复合物中进行实验，但它们也可以用于简单的单蛋白实验（此功能将不进行描述）。

图2 §2.1.

EBI目标是开始实验的先决条件。作为第一步，可以创建虚拟目标。虚拟目标与目标相关，但可以是目标的子集；例如目标的小域或出于实际原因而设计的小删除。工作流的下一步是创建表达式构造。表达结构由一个或多个蛋白质（虚拟靶点）和一个表达系统组成(大肠杆菌，昆虫细胞等.）。此时，用户可以创建一个表达多个蛋白质的多顺反子质粒（通过包括多个虚拟靶点），如§§2.1.2所述, 2.1.3和2.2同时，用户可以向表达结构的每个组件添加亲和标签和蛋白酶切位点。需要注意的是，表达式构造是为某个表达式系统设计的；各种表达式系统都预先注册在数据库中，而随着新系统的出现，可以很容易地添加此列表。所有常用的载体和病毒都可以以灵活的方式进行描述。给定一个Expression Construct，用户可以像在真实实验室中一样，通过改变温度、生长和诱导条件来执行Expression Trials，表达宿主等在一次表达试验中，可以组合多个表达结构，从而有效描述§§2.1.1中的实验, 2.2和2.3当表达试验产生可溶性大分子复合物（或单个大分子）时，该分子可用于与其他大分子和/或非蛋白质组分形成高阶复合物（体外重组）和进行实验。阿姆斯特丹集团开发的信息管理系统的后一部分的描述超出了本文的范围。

3.2. 实施

MySQL关系数据库服务器(https://www.mysql.com/)用于为Complex-3D数据库后端提供数据库支持，WebObjects是一种基于Java的技术，用于实现数据库的稳定和可维护的web界面。应用程序部署到运行Linux或MacOSX的服务器上。提供http的Linux服务器将应用程序服务器连接到互联网。

3.3. 共享信息和敏感数据的隐私

在一个有许多参与者的项目中，对隐私的需求往往与共享信息的义务相冲突。任何小组/参与者都可以参与一个或多个项目。例如，NKI（阿姆斯特丹集团）参与了SPINE，但也参与了“NKI内部项目”。在数据库中注册实验时，用户还必须明确此实验属于哪个项目；例如，NKI的用户必须澄清注册是SPINE还是NKI内部项目。用户可以注册实验A类作为脊椎实验和实验B类作为NKI内部实验。两个实验注册后，NKI的所有用户都可以访问这两个实验的全部细节A类和B类然而，NKI以外的用户只能看到实验A类只有当他们是SPINE项目的注册参与者时；这些用户将无法访问实验B类，其中包含NKI内部数据。此外，某些高度敏感的信息，例如虚拟目标的确切序列或Expression Trials的确切条件，只对小组成员可见：在我们的示例中，所有NKI用户都可以看到实验的所有细节A类和B类; 其他参与SPINE的用户将看到该实验A类存在并连接到特定目标，但无法获取详细信息，例如作为此实验一部分的每个虚拟目标的确切序列。如果任何人需要有关某个特定实验的更多数据来复制它，可以从数据库的图形用户界面中直接联系进入该实验的用户。

当然，数据库管理员随时都可以获得所有信息，而用于报告和科学原因的数据挖掘（查询）非常简单。

4.1. TFIID子复合体

通用转录因子TFIID是一种参与RNA聚合酶II启动转录的多蛋白复合物。它由15个亚基组成：TATA-box结合蛋白（TBP）和14个TBP-相关因子（TAF）_二s） ●●●●。

4.1.1. TAF公司_二6/塔夫_二9

两名TAF_二s、 TAF公司_二6和TAF_二9，分别与组蛋白H4和H3显示序列相似性。异二聚体的结构果蝇属已经解决，证实这两种蛋白质通过组蛋白基序相互作用（谢等。, 1996). 在该研究中，两个伴侣在大肠杆菌从包涵体中纯化，并通过复性重组异二聚体。

斯特拉斯堡研究小组试图通过在大肠杆菌使用双质粒策略的BL21（DE3）：质粒pET15b（Novagen）和pACYC11b（Fribourg等。, 2001)具有不同的抗性标记和不同的复制来源，pACYC11b编码无标签。图3(一)表明，在His标记蛋白的单一表达后，在预期分子量（通道1/2和6/7）下未获得可溶性产物。相反，在这两种蛋白质共同表达后，可获得一种标记的和另一种未标记的可溶性复合物，未标记的伴侣通过与标记蛋白质的相互作用保留在亲和柱上（3/4和8/9通道）。标签的位置对酵母复合物的形成（3/4通道）并不重要，但在人类病例中，TAF的His-tagging_二9，但不是TAF_二6，大大减少了复杂的编队（与8号和9号车道相比）。

图3 参考案例研究，考马斯蓝染色聚丙烯酰胺凝胶用于蛋白质生产的各个阶段。在所有凝胶中，分子量是分子量标记，相关条带的大小在每条条带的侧面或上方用数字表示。指示每个感兴趣的蛋白质的标签位于每个凝胶的侧面，箭头指向每个蛋白质带的相应高度。(一)酵母（y）和人（h）TAF的表达及共表达二6（T6）和TAF二9（T9）。所有样品都代表保留在钴珠上的蛋白质。通道1、2、5和6，His-tagged yTAF的单一表达二6、yTAF二9，hTAF二6和hTAF二分别为9。第3、4、7和8通道，His-yTAF的共同表达二6年TAF二9、他-年二9/yTAF公司二6、His-hTAF二6/小时TAF二9和His-hTAF二9小时TAF二分别为6。(b条)hTAF之间形成的复合物的共表达二4和hTAF二12.通道1显示了纯化的复合物。(c（c）)His-ER-LBD的表达及与SRC-1片段的共表达。泳道1，His-ER-LBD表达的可溶性部分；通道2，钴珠亲和纯化后的His-ER-LBD；通道3，His-ER-LBD和SRC-1共表达的可溶性部分；通道4，通过ER-LBD上的His-tag对钴珠进行亲和纯化后的His-ER-LBD-SRC-1复合物。(d日)人类VDR、RXR和Drip205片段之间形成的复合物的共表达。车道1显示了纯化的复合物。请注意，MW和车道1都来自同一个凝胶，但位于相反的一侧，并且被描绘在一起。(e（电子）)病毒E1和病毒E2之间形成的复合物的共表达。车道1显示了纯化的复合物。(如果)人类Cdt1和双生素的共表达试验。通道1，诱导前的细胞。通道2，来自两个质粒的共表达。通道3，来自一个质粒的共表达，产生一个转录本。通道4，来自pETDuet的联合表达。所有车道均呈现总细胞提取。泳道5（从不同的凝胶上粘贴），通过Cdt1上的His标签亲和纯化后的复合物。(克)小鼠Ring1b和Bmi1环结构域片段的共表达试验。通道1，镍中保留的蛋白质2+His-tagged Ring结构域共表达后的小珠。通道2，GST标记的Ring1b和未标记的Bmi1共表达后保留在谷胱甘肽珠中的蛋白质。(小时)人类Rad18和HR6B的共表达试验。通道1和通道2，保留在Ni中的蛋白质+共表达His标记结构后的小珠，使用一个质粒（第1道）或两个质粒（第一道）进行共表达实验。(我)人MSH2和MSH6在杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞中的共表达。通道1，未感染细胞；第2道，细胞感染MSH2病毒后72小时；通道3，感染His-tagged MSH2病毒的细胞；车道4，细胞感染MSH6病毒；泳道5，来自分离的病毒的MSH2和MSH6的共表达；通道6，来自编码His6-MSH2和MSH6的不同病毒的共同表达；第7条，单一杆状病毒MSH2和MSH6的联合表达；通道8（用不同的凝胶粘贴），纯化的His-tagged MutSα. (j个)昆虫细胞SCF组分与Ni的共表达2+-珠亲和纯化。通道1–3，对Rbx1（1）、Cul1（2）和Skp1-F-box（3）使用单独的病毒；lane 4，共转染和优化后使用所有三种病毒。(k个)昆虫细胞中CTD-活化激酶（CAK）亚单位的共表达。车道1，提纯Flag-Cdk7；第2泳道，Flag-Cdk7/细胞周期蛋白H；车道3，Flag-Cdk7/cyclin H/MAT1。

4.2. 核受体复合物

核受体超家族（NRs）是一大类后生动物转录调控因子，控制哺乳动物从发育到体内平衡的大部分生理过程，是药物作用的重要靶点。它们特异性结合调节其转录活性的疏水小分子（Renaud&Moras，2000). 这些配体构成调节信号，以三步机制改变NR转录活性：抑制、去抑制和转录激活。大多数NR具有二聚体形式的生理功能，既可以是雌激素核受体（ER）等同二聚体，也可以是维生素D核受体（VDR）等异二聚体。转录活性依赖于NRs和多种共激活物复合物的协同作用。

4.3. 病毒E1/病毒E2

病毒E2及其结合伙伴病毒E1是参与土壤细菌DNA转移的两种蛋白质根癌农杆菌进入植物细胞，引起植物转化（邓等。, 1999; 阿布·阿里什等。, 2004). 有人建议，病毒E1与细菌中的病毒E2结合，以防止病毒E2与ssDNA的结合以及病毒E2的自聚集。Weizmann小组发现，病毒E2仅在包涵体中表达，试图将病毒E2变性包涵体重新折叠，得到可溶性聚集体。当病毒E2与病毒E1在pACYCDuet中共同表达时，获得了两种蛋白质的可溶性复合物（图3e（电子）)通过病毒E1蛋白上的N末端His-tag纯化。该复合物的功能如ssDNA-结合活性所示（数据未显示）。

4.4. Cdt1/双核蛋白

真核细胞内DNA的复制需要形成复制前复合物（pre-RC，复制许可证），与染色质结合并招募MCM解旋酶，从而为DNA复制创造条件。前-RC组装是一个有序的过程，其中起源识别复合体（ORC）、Cdc6和Cdt1在G1期依次与染色质结合（Bell&Dutta，2002). 随着S阶段的进行，通过禁止进一步许可，可以防止复制的源代码被重新复制。这是通过细胞周期素依赖性激酶和一种叫做双生素的抑制蛋白的联合活性实现的；双生素在DNA复制开始后与Cdt1紧密结合，防止Cdt1在前RC上重新组装（Nishitani&Lygerou，2002).

阿姆斯特丹研究小组采用了三种不同的共同表达策略，以产生人类Cdt1和双生素之间的复合物大肠杆菌（i）来自具有不同抗性标记但复制来源相同的两种不同载体的共表达：pET28b和pET22b（Novagen）。（ii）来自产生一个转录本的载体的共表达。在这种情况下，pET28b或pET22b启动子的一部分（连接区和RBS）被切割并粘贴在另一载体的第一个基因的下游（使用类似于§2.3），导致单个启动子有两个编码序列，前面有一个RBS。所有四种可能的组合都产生了，Cdt1要么作为上游基因，要么作为下游基因，但His标记编码序列也位于上游或下游基因的前面。（iii）我们还使用了pET-Duet（Novagen）系统，因此从一个产生两个转录物的载体中进行了共表达。再次，构建了与Cdt1或双核蛋白His-tagged的两种组合。

所有三个表达系统在Rosetta2（DE3）细胞中并行测试共表达。在所有使用的表达式系统中，生成未标记的Cdt1的所有尝试均失败。相反，当标记Cdt1时，观察到两种蛋白的表达（图3如果，第2–3道），无论双顺反子载体上基因的顺序如何（数据未显示）。使用双矢量策略获得最高产量（图3如果，车道2）。Cdt1在一种载体、一种转录策略中也相对良好地产生，但在pET-Duet中表达时几乎无法检测到（图3如果，比较泳道3和4）。表达的复合物很容易使用仅在Cdt1中可用的His标记进行纯化（图3如果，车道5）。

4.5. 环1b/Bmi1

指环蛋白Ring1b和Bmi1属于多梳组蛋白（PcG），它们通过维持特定基因的转录抑制在控制发育模式中发挥重要作用。最近的证据支持Ring1b和Bmi1在泛素化途径中的作用。这些环指蛋白对PRC1复合物的功能至关重要，该复合物形成E3泛素连接酶，单泛素化组蛋白H2A（Wang等。, 2004).

为了制作Ring1b–Bmi复合物，阿姆斯特丹团队在大肠杆菌。（i） 修饰的pGEX6P载体与单个启动子上的两个基因共表达，而Ring1b与GST融合表达，Bmi1未标记。（ii）一种双载体策略，将Ring1b转化为pET28b载体，将Bmi1转化为pET 22b载体，从而分别获得具有N末端和C末端His标签的蛋白质。在这两种情况下，蛋白质都表达良好，表明两种系统都同样工作良好（图3克). 利用GST标记的环1b进行纯化并切割GST融合物，产生可溶性纯化的环1b–Bmi1复合物。没有尝试纯化His-tagged复合物，因为该实验只是为了比较表达水平，以期提高蛋白质产量。

4.6. HR6B/Rad18型

E2/E3泛素连接酶复合物HR6B–Rad18靶向复制过程因子PCNA以实现泛素化（Hoege等。, 2002). 人类Rad18是一种模块化蛋白质，包含一个环结构域、一个锌指、一个SAP结构域和一个预测的线圈区域，此外还有几个预测的未折叠区域，这些区域可能是蛋白质相互作用或识别的位点，例如HR6B，Pol-eta，PCNA（Ulrich&Jentsch，2000年; 普拉卡什等。, 2005).

Rad18单独在细菌中表达时不溶，除非与GST融合；然而，取消商品及服务税会导致严重且不可逆转的聚集。阿姆斯特丹研究小组采用了两种不同的方法，以获得与其合作伙伴之一人类HR6B的复合物中的可溶性和活性蛋白质。（i） 双顺反子（一个启动子，一个转录子）构建是通过与pET25b载体进行三点连接来完成的，每个基因都有自己的RBS，下游基因hr6b前面有一个His-tag编码序列。（ii）使用两个单独的质粒表达这两种蛋白，Rad18在PET22b中克隆为未标记，HR6B在PET28a表达载体中克隆为N末端His-tag。

这两种表达系统都产生了可溶性人类HR6B–Rad18复合物。单质粒系统PET25b-hRad18-His6hHR6B产生大量的复合物（每升培养物约2毫克），HR6B大约过剩20倍，尽管该蛋白编码为第二个基因（图3小时，车道1）。双质粒系统产生的蛋白质复合物数量稍大（每升培养物约5毫克），HR6B的过量量相似（图3小时，车道2）。在这两个表达系统中，一个明显的替代起始密码子导致了一个短的Rad18片段，该片段起始于Met312残基，经N末端测序证实。

4.7. MutS（静音）α失配-再配对复合体

DNA错配修复通过修复DNA复制过程中引入的碱基错配和小环来维持基因组稳定性（Kunkel&Erie，2005). 在eukarya中，MutS识别不匹配α是MSH2和MSH6的异二聚体，结合错配并启动修复。人类MSH2和MSH6亚单位的共表达在大肠杆菌使用具有不同抗生素耐药性但具有相同复制来源的pET衍生的表达载体。这两个基因都被克隆到不同的pET载体中，产生了未标记或N末端的His-tagged和GST-tagged蛋白质。几个大肠杆菌对表达菌株、生长方案和诱导程序进行了测试，但在所有情况下只观察到MSH2的可溶性表达（阿姆斯特丹；结果未显示）。

MutS（静音）α复合物在感染重组杆状病毒的Sf9昆虫细胞中共表达。任一亚单位的独立表达导致感染后72小时产生少量每种蛋白质（图3我，车道2、3和4）。通过同时感染这两个亚单位的单独病毒，以及从携带毫秒2和6毫秒在p10和多面体启动子控制下的基因分别导致了两个亚基的数量相似（图3我，车道5和7）。本机（无标签）MutSα复合物可以从这些细胞中以95%以上的纯度纯化为稳定的异二聚体。扩增病毒的稳定性似乎是可变的，产量通常低于每升昆虫细胞培养物1毫克纯蛋白。N末端His标记的融合MSH2增加了该亚单位的产量，并允许纯化到98%以上的纯度（图3我但产量不超过每升培养物1毫克。

4.8. SCF泛素连接酶

许多细胞过程依赖泛素/蛋白酶体系统对蛋白质降解的严格调控和高度特异性。目标蛋白的多泛素化是一个三步过程，首先涉及激活酶（E1），然后是结合酶（E2），最后是泛素连接酶（E3）（Pickart，2001）). SCF复合物是许多泛素连接酶之一，参与许多细胞周期调节蛋白和转录因子的降解（Cardozo和Pagano，2004）). 这种多亚单位E3连接酶由四种蛋白质组成，即Skp1、Cul1、Rbx1和F-box蛋白，后者的成分是可变的，确保了广泛的底物特异性。

阿姆斯特丹研究小组的经验证明，将这些蛋白单独作为His-tag融合物进行细菌过度表达是极其困难的。除Skp1外，该复合物的所有蛋白质的表达水平都很低或检测不到。其他融合(例如GST或MBP）在某些情况下导致表达轻微增加，但剥离这些标签会导致蛋白质聚集或沉淀。通过PCR连接所有四个基因，构建四顺反子表达载体，尝试在细菌中共表达，每个基因前面都有一个连接子和核糖体结合位点(TGATCTAGAAAATATTTTTTAACTTAAG公司AAGGAG公司ATCCATGG，链接器序列为斜体，RBS为粗体），并插入到pET向量中。只有一种蛋白质被His标记。不幸的是，除Skp1外，其表达量极低。改变质粒上基因的顺序并没有导致表达水平的增加。

我们随后尝试在昆虫细胞中表达这种复合物。Rbx1和Cul1是由两种不同的病毒表达的，而Skp1和F-box蛋白是由一种病毒表达的。使用单独的病毒进行蛋白质表达，我们获得了Skp1-F-box组合的良好表达（～2 mg l⁻¹)Rbx1的合理表达（～0.2 mg l⁻¹)，但Cul1的表达仍然很差（图3j个). 在组合各种病毒后，我们观察到一些Cul1表达，并且在优化用于感染的病毒量后，我们能够以相似的数量同时表达所有四种蛋白质（图3j个).

4.9. TFIIH的CAK亚复合物

Cdk活化激酶（CAK）是一种由cdk7、细胞周期蛋白H和MAT1组成的三聚体复合物，通过T环激活细胞周期调控Cdk磷酸化。此外，当CAK与TFIIH核心蛋白组装时，已经确定了CAK复合物的其他底物，从而调节转录和核苷酸切除修复（Fisher等。1995年; 蒂洛德等。, 1999).

斯特拉斯堡小组试图在大肠杆菌无论是通过从单个质粒共表达双顺反子cdk7和cyclin H，还是通过从具有兼容抗生素抗性和复制来源的两个质粒共表达，均未成功。测试了各种诱导策略和生长条件，但在所有情况下，在不溶性颗粒中发现cdk7，而在可溶性提取物中产生His标记的细胞周期蛋白H。

当在昆虫细胞中表达时，cdk7可以作为可溶性蛋白获得，可以单独与细胞周期蛋白H复合，也可以与细胞周期素H和MAT1复合；这是用抗旗帜抗体进行小规模测试的（见图3k个详细信息）。为了生产，在P10和多面体启动子的控制下克隆了编码组氨酸标记的cyclin H和cdk7的基因。从10⁹细胞。