2.1. 表达、纯化和结晶

本研究中使用的改性人类UCK2的表达、纯化和结晶先前已有报道（铃木等。, 2003). 简言之，带有缺失C-末端（251-260个残基）的UCK2用谷胱甘肽表达-S公司-转移酶在N端融合。亲和力、凝胶过滤和离子交换色谱法这些步骤产生了高纯度的UCK2。蛋白质浓缩至约12 mg ml⁻¹并储存在193 K。使用坐滴蒸汽扩散技术生长衍射质量的晶体。通过将1µl蛋白质溶液与1µl配体溶液（20 m）混合形成液滴（3µl）M（M）胞苷，10米M（M）氯化镁₂，5米M（M）ATP）和1µl储液罐溶液（17–18%PEG 8000，0.2–0.3M（M）醋酸钙，100 mM（M）Tris–HCl pH 7.0）。将滴液与0.5 ml储液罐溶液进行平衡。尽管UCK2是在底物（ATP和胞苷）存在下结晶的，但其结构实际上揭示了一种酶-产物复合物（UCK2–ADP–CMP），表明反应发生在结晶过程中。块状UCK2–ADP–CMP晶体通常在3天内出现并生长约一周，尺寸达到0.2×0.2×0.15 mm。UCK2–ADP–CMP晶体属于单斜晶系空间组 C类2，带单位-细胞参数一= 88.6,b条 = 109.3,c（c） = 64.5 Å,β= 95.0°. 马修斯系数(V（V）_M（M）; 马修斯，1968年)为2.75奥^三 Da公司⁻¹假设两个单体在非对称单元，对应于约54%的溶剂含量。

2.2。衍生制剂

从母液中提取天然UCK2晶体并转移到重原子溶液中（19-20%PEG 8000，0.15M（M）醋酸钐，100米M（M）Tris–HCl pH 7.0）。1小时后，将这些晶体短暂转移到由添加20%甘油的重原子溶液组成的冷冻溶液中，然后在100 K的氮气流中直接冷冻。钐衍生晶体也属于单斜晶系空间组 C类2，带单位-细胞参数一 = 88.5,b条= 108.9,c（c）=64.4Å，β=94.7°，与天然UCK2–ADP–CMP晶体同晶。

2.3. 数据收集

使用内部RUH3R铜旋转阳极收集所有衍射数据，该阳极生产铜K（K）α辐射并配备R轴IV⁺⁺安装在2上的镀膜面积探测器θ舞台（Rigaku MSC，The Woodlands，TX，USA）。X射线束由Osmic Blue共焦光学元件和具有0.6 mm后孔径和0.3 mm前孔径的准直器（Rigaku MSC）聚焦。所有衍射实验的发电机功率设置为50 kV和100 mA。实验装置包含一个垂直主轴(φ轴）。由于UCK2–ADP–CMP晶体的单位-细胞参数合理，并且镀膜探测器的大面积格式，所有衍射数据都是以探测器为中心的直接光束测量的。使用战略软件程序模块CrystalClear公司（Rigaku MSC），确定了唯一的晶体轴(b条轴）与φ轴，使用连续的φ-150°（每张图像1°）轴扫描，晶体到探测器的距离为150 mm，无需重新定向晶体。为将强信号输出到全分辨率范围而选择的曝光时间为每张图像60分钟。CrystalClear公司对Sm衍生物晶体上收集的初始图像的分析表明b条轴几乎垂直于（86°）φ轴，而一和c（c）轴偏离主轴10°以上。因此，可以使用连续的φ-轴扫描。为了收集Bijvoet对并最大化冗余，在Sm导数上收集SAD数据，每幅图像使用1°振荡，共360°，晶体到探测器的距离为180 mm，每张图像的曝光时间为25分钟。所有数据都使用DENZO公司和电子秤组件（Otwinowski&Minor，1997年)（表1). 对于Sm导数数据，异常对被视为非等效反射，并在缩放和合并步骤中使用程序中的“SCALE anomalous”标志将其分开电子秤组件自然晶体的精细镶嵌度和平均数据冗余度分别为0.46°和3.0，Sm衍生晶体的精细嵌合体和平均数据重复度分别为0.61°和3.9（Bijvoet测量）。

表1 结构确定和模型精炼统计学 (一)晶体特征和数据收集统计。外部分辨率外壳的值在括号中给出。   本地 钐衍生物 单位-细胞参数（Ω，°） 一=88.6，b条= 109.3,c（c）= 64.5,β= 95.0 一= 88.5,b条= 108.9,c（c）= 64.4,β= 94.7 “空间”组 C类2 C类2 每个AU的分子数 2 2 X射线源 Rigaku RUH3R公司 Rigaku RUH3R公司 波长（Ω） 1.5418 1.5418 分辨率（Ω） 100.0–2.0 (2.07–2.00) 100.0–2.5（2。59–2.50) 观察次数 120872 156169 独特反射次数 40772 40316† 完整性（%） 98.8 (96.2) 97.9 (96.4) 平均值我/σ(我) 22.0 (6.5) 21.1 (4.7) R（右）合并‡ 0.046 (0.165) 0.062 (0.295) (b条)结晶数据和精炼统计。来自中央对手方清算所4个程序MLPHARE公司和DM公司是米特cos（相位误差）的平均值。 MLPHARE公司FOM公司 21067次反射为0.344（50.0–2.5°分辨率） DM公司表面活性剂 21067次反射为0.747（50.0–2.5°分辨率） 分辨率范围（Ω） 50.0–2.0 反射次数 45293（40732工作组，4561测试组） 完整性（%） 94.1 蛋白质残基/原子数 424/3395 配体原子数 98 水原子数 315 R（右）晶体 0.209 R（右）自由的 0.237 根-平方偏差    粘结长度（Ω） 0.006  结合角（°） 1 Ramachandran图统计：残留物    最受欢迎的地区 367 (94.8%)  其他允许的区域 18 (4.7%)  充分允许的区域 2 (0.5%)  不允许的区域 0（0.0%） †Bijvoet对被视为Sm-导数数据的唯一反射。 ‡R（右）合并=.

2.4. 重原子和结构测定

衍射数据中的异常信号如图1所示，其中Bijvoet比率〈ΔF类^anom公司〉/〈F类〉绘制为分辨率的函数。利用Sm衍生数据的异常差异来确定晶体中的重原子位置。标准化结构系数幅度差异（差异E类s） 使用梦想包装（Blessing&Smith，1999). 异常散射下部结构由双空间直接法确定(摇晃和烘焙)程序（周等。, 1994)使用计算机程序SnB公司（v.2.2；Weeks&Miller，1999年). 从最大的400个diff生成了4000个三重不变量E类值。共处理了1000个试验，每个试验从10个随机原子开始，每个试验运行20个周期的相位精细化。最小函数的轨迹(R（右）_最小值)透露了一个双峰分布。最佳溶液的前四个峰的密度值分别为20.2、16.9、15.4和13.9。列表中接下来的六个密度峰值的高度从7.8到6.1不等。这些结果表明，前四个密度峰代表了Sm原子在非对称单元。这四个站点以图形方式可视化。大约有两倍非晶体学对称性（NCS）轴是通过为四个Sm原子生成几个与对称性相关的位点来确定的，然后根据使用交互式分子颗粒程序的目视检查将特定原子分组为NCS对O（运行）（琼斯）等。, 1991). 然后使用LSQ_EXPLICIT公司中的例程O（运行）该程序生成一个转换矩阵，随后可直接用于密度修改程序，以进行NCS平均。重原子参数精炼并使用MLPHARE公司计划（Otwinowski，1991年)来自CCP4型软件套件（协作计算项目，1994年第4期)使用该程序通过溶剂压平来改善相DM公司（Cowtan和Zhang，1999年). 通过检查得到的电子密度图，确定Sm原子模型的正确手。所有反射到2.5Å分辨率的初始平均品质因数（FOM）为0.344，在密度修改后提高到0.735（表1). 利用可用的两倍NCS平均值，结合溶剂压平，最终FOM为0.747。这个平均实验图质量很好，显示出清晰的主链和副链密度（图2)以及一些溶剂分子。在这张地图的基础上^α第一个分子（分子）的踪迹A类)是手动生成的，然后使用分子颗粒程序添加主链和侧链原子O（运行）（琼斯）等。, 1991). 分子B类然后通过从Sm位点获得的NCS转换生成。刚体后精炼和一轮扭角分子动力学精炼（Rice&Brünger，1994年)使用程序CNX公司（Accelrys，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国）R（右）因子下降至28%，免费R（右）系数为32%，使用2.5º分辨率的数据。通过使用2.0º分辨率的本地数据集进行扭角退火迭代循环，并对模型进行手动调整，进一步改进了模型。在随后的几轮精细化，ADP、CMP、一个镁离子和几个水分子被添加到非对称单元基于不同的密度和合理的氢键距离和几何结构。

图1 衍射数据中存在异常信号。Bijvoet比率〈ΔF类anom公司〉/〈F类〉绘制为UCK2–ADP–CMP钐衍生物晶体上收集的数据的分辨率函数。

图2 从SIRAS相到2.5Å分辨率计算的平均溶剂平坦电子密度图的立体图。地图叠加在核心区域内最终模型的坐标上β-表。

3.1. 人体UCK2的结构

我们的UCK2结构与Suzuki及其同事之前确定的产品绑定结构几乎相同（PDB代码错误定位器类型；Suzuki等。, 2004). 两种结构都结晶空间组 C类2个单位-细胞参数变化小于0.6%。这两种结构的叠加显示了0.15 Au的r.m.s.d²1696个蛋白质骨架原子非对称单元（ASU）。相反，844个分子主链原子的r.m.s.dA类为0.54º²当与分子叠加时B类在我们结构的ASU内。四聚体由ASU中的两个分子和由晶体对称性。UCK2单体包含一个核心五股并联β-床单两侧各有一对α-螺旋（图3). 另外三个α-螺旋体位于芯片结构上方，与大型β-发夹环完成活性部位。酶活性部位包含磷酸盐转移反应、ADP和CMP的产物。由于反应底物被添加到结晶滴中，我们假设反应在结晶过程中进行。这个β-UCK2的发夹环形成了深核苷结合囊的广泛部分。这个环在我们的配体结合结构和载脂蛋白酶（PDB代码）结构中的位置1个ufq; 铃木等。, 2004)提示这种独特的结构元件可能起到调节基质结合和产物释放的作用。UCK2侧链和CMP分子之间总共形成了12个氢键，这在很大程度上解释了该酶的特异性。His117和Tyr112允许UCK2选择核苷通过分别从胞苷的4-氨基或尿嘧啶的6-氧代基团接受氢键或将氢键给予胞嘧啶和尿嘧啶碱基。核糖部分的2′-和3′-羟基参与了Asp84酸性侧链和Arg166胍基的氢键作用。这四个氢键很可能解释了为什么UCK2选择核糖核苷而不是脱氧核糖核苷底物（Van Rompay等。, 2001). 如前所述（铃木等。, 2004)，Asp62的羧酸盐位于一磷酸核苷产物的5′-O原子附近，很可能作为一种通用碱来激活核苷底物的5′-羟基，从而促进对γ-ATP的磷酸盐。对于其他糖和核苷激酶，包括核激酶中的Asp255（Sigrell等。, 1998)腺苷激酶中的Asp300（马修斯等。, 1998)最近，脱氧胞苷激酶中的Glu53（Sabini等。, 2003).

图3 人类UCK2单体的整体结构。股线（绿色）和螺旋线（蓝色）分别由箭头和线圈表示。反应产物ADP和CMP显示为棒状物，而镁离子表示为氰球。N端子和C端子都有相应的标签。

除了核苷酸，UCK2分子在非对称单元也含有一个镁离子。在分子中A类，镁离子由CMP的5′-磷酸盐和β-ADP的磷酸盐以及Ser34和两个水分子。分子活性中心这一区域相对较弱的电子密度B类表明镁和ADP的占用率较低。有趣的是，分子中的镁离子B类似乎从活性位点（～3μl）轻微移除，并由Glu135和Ser34的侧链以及催化碱Asp62的侧链进行协调，与分子中的侧链构象相比，Asp62显示出交替的侧链构型A类（图4). 可能是在磷酸盐转移后，溶剂暴露的ADP分子从活性中心扩散出去，而Asp62的酸性侧链从新形成的CMP分子的5′-磷酸盐上脱落。在此过程中，镁离子可能仍与Asp62羧酸盐结合。如果是这样，分子B类可能代表在反应的产物释放阶段发生的酶的中间构象。事实上，我们已经观察到，在收获之前，UCK2–ADP–CMP晶体在母液中停留的时间越长，ADP的密度就越低，而指示Asp62构象变化的密度差异就越大（数据未显示）。

图4 比较不对称单元中两个分子活性位点的立体视图。Asp62和Ser60具有交替的侧链构象以及来自分子的镁离子B类（洋红）叠加在蛋白质侧链和来自分子的镁离子上A类（青色）。分子反应产物ATP和CMP的粘模型A类也会显示。

3.2. 重原子位置

短时间的高浓度醋酸钐浸泡导致每个样品中添加了四个有序的Sm原子非对称单元UCK2–ADP–CMP晶体（图5). 四个钐位点中的两个位于晶体学相关分子之间的界面（一个位于A类和A类_对称，介于B类和B类_对称)在UCK2四聚体中心附近。带正电的钐离子位于一个分子的Asp158和它的Glu194之间晶体对称性伙计。其余两个Sm原子位置位于UCK2分子的活性位点内，它们似乎取代了结晶所需的镁离子。Sm原子由CMP的5′-单磷酸盐和Asp62的侧链配位。在发现的其余六个峰值中SnB公司，4也与使用振幅计算的异常差傅里叶图中的峰值相关ΔF类^anom公司以及根据四个主要Sm站点计算的相位。这四个峰可能是较小的Sm位点，是晶体中UCK2近表面暴露的酸性残基。包括这四个额外的位点确实使相位统计略有改善，平均溶剂平坦FOM从0.747提高到0.765。然而，新地图的质量显示，与使用四个主要站点计算的初始地图相比，没有重大改进。

图5 立体图，显示四个主要钐场所（红色球体）的位置。镁离子在天然UCK2–ADP–CMP晶体中的位置显示为绿色球体。ADP、CMP和Asp158显示为球杆模型。分子A类和B类相应地标记。

3.3. 结论

将天然UCK2晶体浸泡在0.15中M（M）乙酸钐作用1h后，生成了一种重原子衍生物，该衍生物中有四个主要Sm位点不对称单元。与任何重原子浸泡实验一样，盐的类型、化合物的浓度和浸泡时间都需要针对每个独特的结构确定项目进行一些优化。结晶所需的镁以及随后在产品复合体中出现的镁这一事实可能提高了重原子浸泡程序产生有序Sm位点的可能性。UCK2分子表面额外有序位点的存在确实表明钐离子有潜力为不同的蛋白质晶体组生成有用的重原子衍生物。需要进一步的研究来证实这种技术的普遍应用。

由于他们的值，镧系金属是用于反常衍射研究的一类有用的重原子。钆（Gd）是另一种镧系金属，在高分子材料中已显示出巨大的用途结构测定通过使用常规实验室X射线源（Girard）的SAD技术等。, 2003). Cu处的异常信号K（K）α在我们的研究中，由于钐原子的存在而产生的波长足以确定重原子下部结构通过直接法并提供足够的相位功率以生成可解释的电子密度图。这些结果表明，钐的使用可能代表了一种获得有用的重原子衍生物的一般策略，用于内部结构测定使用SAD和SIRAS阶段化技术。在处理金属结合蛋白质或需要金属离子存在才能结晶的蛋白质时，一定要考虑这种策略。