1.简介

单牌DNA-binding（SSB）蛋白已被证明在DNA代谢的许多方面发挥着重要作用（Chase&Williams，1986）). 它们优先结合和保护在DNA复制、重组和修复过程中瞬时形成的脆弱单链DNA（ssDNA）。SSB蛋白的特征是存在保守的OB折叠基序（寡核苷酸/寡糖/寡肽结合折叠），通常长度为100个氨基酸（Murzin，1993).

SSB蛋白可以根据其第四纪构造。真核SSB蛋白称为复制蛋白A（RPA），以人类RPA为例，其异源三聚体结构包括三个亚基：RPA70、RPA32和RPA14（分子量分别为70、32和14kDa；沃尔德，1997年). RPA复合体包含六个OB折叠，其中四个结合DNA：三个位于RPA70上，一个位于RPA32上（Bastin-Shanower&Brill，2001）). RPA70上的N末端结构域也被证明与蛋白质-蛋白质相互作用有关（Jacobs等。, 1999). 相反，细菌SSB蛋白形成同源四聚体，每个亚单位包含一个DNA结合域（Raghunathan等。, 1997). 这些DNA结合域位于单个SSB蛋白亚基的N末端，形成特征性OB折叠。虽然每个亚单位的N末端结合ssDNA并包含同四聚体界面，但人们认为C末端结构域与DNA代谢的其他蛋白质组分相互作用。细菌SSB蛋白的C末端结构域在物种间表现出较低的序列同源性，但末端六个残基除外，它们形成一个高度保守的负电荷DDDIPF基序。这个主题对于大肠杆菌SSB蛋白体内（克思等。, 1996)并已被证明与3′-5′ssDNA降解外切酶I（Genschel等。2000年). 两者的尾部大肠杆菌和硫矿硫化叶菌SSB蛋白不参与DNA结合，但被认为在介导蛋白质与DNA聚合酶复合体内其他亚单位的相互作用中发挥作用（布鲁克等。2002年). 也有证据表明大肠杆菌SSB蛋白、DNA聚合酶和引物酶被用作三点开关来启动这两种蛋白在DNA上的位置交换（Yuzhakov等。, 1999). 此外，最近的一份报告表明，DNA聚合酶和来自RB69（T4类噬菌体）的SSB之间的相互作用导致SSB蛋白对ssDNA的总亲和力增加（Sun&Shamoo，2003). 最后，古尔比斯和同事最近在χPol III全酶的亚单位，可能与SSB（Gulbis）的C末端酸性区域相互作用等。, 2004).

SSB蛋白的DNA-结合域和OB折叠已经得到了很好的研究，结构信息可以从跨越所有三个生命王国（Bochkareva等。, 2001; 博奇卡廖夫等。, 1997, 1999; 韦伯斯特等。, 1997; 拉古纳桑等。2000年; 杨等。, 1997; 克尔等。, 2003). 然而，细菌全长蛋白的结晶被证明是有问题的，大多数研究使用SSB蛋白的蛋白水解N末端片段；因此，对其C末端结构域的结构知之甚少。努力使完整的大肠杆菌SSB四聚体在结晶过程中导致自溶结构测定C末端省略了30个氨基酸（松本等。2000年). 已经假设大肠杆菌SSB被切割以减少因其谷氨酰胺含量高而对结晶不利的相互作用。Kerr及其同事最近的晶体学研究显示，来自crenarcheote的SSB的胰蛋白酶切割片段具有1.2Å的结构索尔法塔利沙门菌C末端尾部缺失了28个氨基酸残基（图1).

图1 SSB蛋白的序列比对超嗜热菌（SSB Aae），大肠杆菌（SSB Eco）和索尔法塔利沙门菌（SSB Sso）。剩余L112下的星点（*）大肠杆菌SSB（SSB-Eco）表示用于确定Raghunathan描述的天然和DNA-结合SSB复合体结构的糜色片段（SSBc，残基1-135，用W135下的$符号表示）的分辨率极限等。(19972000年)（PBD代码1卡瓦和1只眼睛）。残基R119下的散列符号（#）表示索尔法塔利沙门菌克尔结晶的SSB（SSB-Sso）等。(2003)（残基1-119；PBD代码1o7i). SSB Eco N145下的加号（+）表示结构测定松本结晶的自溶碎片等。(2000)（残基1–145；PBD代码1个vc). 注意SSB Aae的富含谷氨酸的C末端与SSB Eco的富含谷氨酰胺的尾部相比。

对ssDNA与SSB结合模式的广泛研究揭示了一系列复杂的蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA相互作用（Lohman&Ferrari，1994; 拉古纳桑等。2000年). 不同的绑定模式[称为（SSB）₃₅和（SSB）₆₅]并且观察到了依赖于寡核苷酸长度、盐和蛋白质浓度的合作性。例如，大肠杆菌（SSB）₃₅绑定约35核苷酸在这种情况下，四聚体中的四个亚基中只有两个与DNA结合。相反，在（SSB）中₆₅结合模式四聚体的所有四个亚基都参与了DNA结合，尽管似乎存在“有限”类型的跨转录体协同性。因此，使用dT（pT）₆₉根据条件的不同，一个SSB亚基与一个或两个DNA寡聚体结合或两个SSB子基与一种DNA结合的各种组合是可能的。然而，使用高（>0.2M（M）NaCl）盐浓度似乎有利于形成一个SSB四聚体与一个dT（pT）结合₆₉.

为了研究全长SSB的结构，我们报道了SSB蛋白（147个氨基酸；M（M）_第页17 131.20; 图1)来自高温细菌埃奥利乌斯（A.aeolicus）（SSBAae公司)自由形式和DNA结合形式。与…对比大肠杆菌SSB，SSB的一级结构分析Aae公司揭示了其C末端的聚谷氨酸区域和EDEIPF基序（图1). 我们希望晶体结构的埃奥利乌斯（A.aeolicus）SSB蛋白将有助于研究通过细菌SSB蛋白C末端介导的复杂蛋白-蛋白质相互作用，数据也可能揭示该SSB在高温下稳定性增强的结构基础。此外，DNA结合结构可能揭示（SSB）的细节₆₅绑定模式。

2.克隆、表达和纯化

这个单边带从完整的超嗜热菌基因组序列（Deckert等。, 1998)，由放大聚合酶链反应随后将得到的451bp片段插入pET-23a表达载体（Novagen）中，使用Nde公司我/Hin公司dIII限制位点。构建物pET23a/ssb的保真度在转化前通过DNA测序进行了验证大肠杆菌BL21（DE3）/pLysS（诺瓦根）。细胞在添加了氨苄西林（100µg ml）的2YT培养基中生长⁻¹)在310 K和250转/分的摇瓶中⁻¹至外径₆₀₀=1.0 m诱导前0.8M（M）异丙基-1-硫代-β-D类-吡喃半乳糖苷（IPTG）。再生长4小时后，通过离心收集细胞，并将其储存在253K下。

将细胞颗粒重新悬浮在10 ml缓冲液中A类（50米M（M）每克细胞糊中的Tris–HCl pH值7.0），在277 K下通过超声波（15次30秒脉冲，间隔30秒）破坏，并离心细胞裂解液（30分钟，35 000克). 过滤上清液（0.45µM（M）)在应用于26/10 Q-­Sepharose阴离子交换柱（Amersham Biosciences）并用线性NaCl梯度（0–1.0）洗脱之前M（M）)在同一个缓冲区中。SDS-PAGE分析显示SSB在460至510 m之间洗脱M（M）氯化钠。值得注意的是，与理论重量17.1kDa相比，SDS-PAGE上蛋白质的表观重量为23kDa，这是一种异常现象，这可能是由Bruck也观察到的C-末端的大量酸性残基造成的等。(2002)（图1和插图如图2所示). 使用10 kDa截止膜（Vivascience）通过超滤（Vivaspin）将含有SSB的组分混合并浓缩至5 ml。

图2 ESI-MS分析结晶的DNA-结合SSB蛋白。主图显示了17 127.3的反褶积质量（使用转换软件；微质量（英国），符合17 131.2的理论值；右插图，结晶SSB蛋白的离子膜；左插图，结晶SSB蛋白的SDS–PAGE分析导致单个条带以约23 kDa的异常重量运行。

浓缩样品通过以下方法进一步纯化尺寸排除色谱法使用之前校准过的Hiload 26/60 Superdex 200色谱柱（Amersham Biosciences）在缓冲液中进行平衡和洗脱C类（50米M（M）Tris–HCl，100米M（M）NaCl pH 7.0）。SSB蛋白具有滞留时间与牛血清白蛋白（66kDa）类似，表明17.1kDa蛋白在溶液中形成稳定的同四聚体：细菌SSB蛋白的特性。通过SDS–PAGE判断SSB蛋白制剂的纯度>98%，并且该优化方案每升细胞培养物持续产生10–15 mg纯化蛋白。ESI显示纯化蛋白为17 131.0±1.50 Da的单一物种质谱法，这与全长的理论重量一致超嗜热菌SSB蛋白（17 131.2 Da）。

3.结晶

使用分子尺寸结构屏幕1和2以及290 K下的静滴蒸汽扩散法获得初始晶体。液滴由5µl蛋白质溶液（7 mg/ml⁻¹缓冲区内C类)和5µl沉淀剂。在两周多的时间里，在三种不同的条件下观察到天然蛋白质的小晶体，用100 mM（M）HEPES pH值7.5，2%(v（v）/v（v）)聚乙二醇400，2.0M（M）（NH₄)₂SO公司₄pH 7.5作为沉淀剂。在细化结晶条件后，在pH值为7.0的条件下使用相同的沉淀剂四周后获得较大的晶体。通过混合7.5 mg ml DNA结合蛋白实现共结晶⁻¹蛋白质（四聚体：ssDNA）与69聚体dT（pT）摩尔比为1:1₆₈（MWG生物技术）。将复合物在冰上培养60分钟并离心（10分钟，35 000克)在结晶之前。每个结晶液滴在50 m中包含1.5µl蛋白质M（M）Tris pH 7.0，0.1M（M）NaCl和1.5µl沉淀剂。所有设备均设置在290 K。晶体在一周内生长；用100米获得了质量最好的晶体M（M）HEPES pH值7.5，2.3M（M）（NH₄)₂SO公司₄.

4.数据收集和处理

在20%甘油井溶液中闪蒸冷却约0.1×0.2×0.2 mm的天然蛋白质晶体，并在100 K（Crystostream冷却器；牛津晶体系统，英国牛津）下在安装在Enraf–Nonius FR591旋转阳极发生器上的MAR Research 345成像板上收集天然SSB的X射线数据，λ=1.5418º，配备有Osmic镜，在40 kV、110 mA下工作。对于DNA结合形式，获得了类似尺寸的晶体，并且还在14.2号站的100 K下收集了数据(λ=0.978Ω）。使用对两种晶体的衍射数据进行分析MOSFLM公司/SCALA公司（莱斯利，1992年; 1994年第4号合作计算项目)生成了表1中所示的数据并允许将天然晶体分配给空间组 P（P）2₁。对于DNA-bound数据，使用空间组获得了类似的处理统计数据我222,我2₁2₁2₁和我4₁.

表1 数据收集和缩减统计 括号中的值表示最高分辨率外壳。 蛋白质 本地 DNA绑定 数据收集 家庭来源 SRS达累斯伯里 振荡范围（°） 180 × 1 120×1 “空间”组 P（P）21 我41 我222 我212121 单位-细胞参数          一(Å) 80.97 108.36 108.65  b条(Å) 73.40 108.36 108.51  c（c）(Å) 109.76 113.20 113.24  β(Å) 95.11 90 90 每个AU的四聚体 2 1 1 1 V（V）M（M）(Å三 Da公司−1) 2.37 1.86† 1.87† 1.87† 分辨率限制 70–2.92 (3.08–2.92) 78.28–2.80 (2.95–2.80) 79.06–2.80 (2.95–2.80) 观察次数 100835 (12811) 79739 (676) 79012 (11550) 无独特反射 27790（3680） 15953 (2324) 16402 (2368) 我/σ(我) 9.2 (3.5) 7.5 (1.4) 7.9 (1.4) 完整性（%） 98.9（98.9） 99.9 (99.9) 99.7 (99.7) R（右）合并‡ 0.057 (0.212) 0.056 (0.525) 0.053 (0.541) MOLREP R公司因素 0.567 0.560 0.520 0.517 MOLREP公司相关系数 0.359 0.316 0.471 0.471 受限制的精细化R（右）因素 0.425 0.401 0.396 0.400 受限制的精细化R（右）自由的 0.487 0.507 0.471 0.488 †对于一个SSB四聚体(M（M）第页=68 400）和一个DNA 69米(M（M）第页= 20 927). ‡R（右）合并=，其中〈我我(小时)〉是我对称等效反射

对于本机SSB数据集，来自大肠杆菌（PDB代码1个vc; 松本等。2000年)用于使用搜索初始解决方案MOLREP公司（Vagin和Teplyakov，1997年). 将搜索分子的柔性环和氨基酸侧链修剪成四聚多胺结构。顶部旋转函数溶液产生令人满意的平移函数溶液，然后用于辅助第二个四聚体的定位。使用索尔法塔利沙门菌结构作为搜索模型。对于绑定到DNA的SSB，使用MOLREP公司使用部分精炼SSBAae公司二聚体(R（右）= 0.272,R（右）_自由的=0.308）提供的溶液，其中最好的每种含有两个二聚体不对称单元在三个空间组中的每一个。20个刚体循环精炼之后是十个循环有节制的精致。该过程的统计数据也如表1所示.精炼目前，这两种晶体的衍射质量都在改善中。

为了确保蛋白质不会发生自溶，将DNA-结合的SSB单晶溶解在10m内M（M）HEPES pH值8.1，并通过SDS–PAGE和ESI–MS进行分析，结果表明蛋白质没有显著降解。SDS-PAGE分析产生了一个约23kDa的单带，与观察到的天然SSB的异常迁移率一致。ESI-MS仅观察到一种主要物种，质量为17 127.3±2.7（图2)，与预测重量吻合良好。从溶解的天然SSB晶体中无法获得LCMS数据。

5.讨论

从SSB蛋白的序列比对可以清楚地看出超嗜热菌和大肠杆菌蛋白质之间的关系比两者之间的关系更密切索尔法塔利沙门菌SSB（图1). 事实证明，使用大肠杆菌结构相对容易获得，而使用索尔法塔利沙门菌结构。非常高的分辨率可溶性硫杆菌SSB揭示了为什么会这样，因为实际的分子结构与真核生物的SSB折叠比与大肠杆菌SSB（克尔等。, 2003). 因此，尽管有适度的序列同一性，但结构是不同的。

对于此处报告的DNA结合晶体，关于空间组。给定SSB四聚体非对称单元，使用单体M（M）_第页17 100的DNA和20 927的DNAV（V）_M（M）可以计算为2.43、2.11、1.86或1.51º^三 Da公司⁻¹对于零、0.5、一个或两个结合DNA，每四聚体69米。预期的1:1复合物需要一个DNA低聚物不对称单元对应于V（V）_M（M）1.86Å^三 Da公司⁻¹在Matthews（1968）发现的范围内)虽然接近下限。在自然结构中观察到的生理四聚体位于两者的晶体二元体上我4₁和我2₁2₁2₁而四聚体位于螺旋二元轴上我SSB四聚体与单个DNA寡聚体结合时不可能有精确的双重对称性，尽管假双重排列是可能的。鉴于当前X射线数据的有限分辨率和精细化，目前还不能排除这种情况。然而，如果DNA低聚物以某种方式在两个四聚体之间共享，这可能会允许与DNA结合的四聚体位于晶体二元体上，同时在不对称单元（法拉利等。, 1994). 三个空间群中每一个空间群的初始电子密度图都显示了预期结合DNA的蛋白质区域附近的额外电子密度（Raghunathan等。2000年). 检查地图以及表1中所示的统计数据让我们更喜欢我222作为空间组，但我们正在继续完善这三种可能性。这些改进应该能够澄清这种不确定性，并使我们能够估计DNA的占有率。

总之，我们的表达和纯化策略已经从嗜热菌中产生了全长SSB超嗜热菌未观察到自溶质谱法和SDS–PAGE。这里报道的晶体中存在灵活的C-末端尾部，与两种晶体中使用的截断SSB不同大肠杆菌和索尔法塔利沙门菌结构测定。我们的首字母精炼这两种形式的结构都允许将电子密度明确分配给残基1–38和41–108，我们目前正在改进模型以区分C末端残基。

证据中添加的注释：在处理这份手稿的过程中，发表了一份报告，描述了全长的结晶大肠杆菌SSB（保存等。, 2004).