2.1. 克隆和表达

这个腔色链霉菌actIIIORF5基因是通过PCR扩增从生物体中分离的基因组DNA中克隆出来的，使用的引物添加了Nde公司N末端的I限制位点和Hin公司dIII位于C终点站。酶切限制位点并将该基因首次连接到商业载体pET26b（Novagen）。在成功测序后，通过限制性内切酶将该基因从该非标记载体中切除，使用Nde公司我和Xho公司I（pET26b固有）。使用相同的限制性位点将基因插入质粒pET15b中，以掺入N-末端His₆在N末端标记，这导致总共20个额外残留物（MGSSHHHHSSGLVPRGSH）。该质粒被转化为大肠杆菌菌株BL21（DE3）用于IPTG诱导表达。通过从LB琼脂平板（1 ml）接种单菌落产生培养物。这些前培养物在310 K下培养过夜。然后使用过夜培养物接种0.5–1 l LB液体培养基。它们在310 K下生长为A类₅₉₅介于0.6和0.8之间。然后，通过添加IPTG至最终浓度1 m来诱导培养M（M）细胞在3×30 s内被超声波破坏。细胞碎片在6000℃离心去除克30分钟后，通过以下步骤从细胞提取物中纯化出完全活性的酶亲和层析在镍上²⁺柱（Novagen）。含有KR的馏分被脱盐到缓冲液中A类（100米M（M）磷酸盐，10%甘油，pH 7.2），并储存在193 K。

将酮还原酶、NADPH（辅因子）和丙二酰辅酶A（底物）添加到PKS最小体系中进行活性测定。通常，该分析含有50µM（M）ACP，1µM（M）KS/CLF，10µM（M）韩国，0.1米M（M）DTT，2米M（M）EDTA，1米M（M）丙二酰辅酶A，2 mM（M）NADPH和10%甘油，用0.1 m缓冲M（M）千赫₂人事军官₄pH 7.3，最终体积为100µl。聚酮代谢物用乙酸乙酯萃取、冷冻干燥并溶解在甲醇中进行HPLC分析。使用诱变剂的存在来确认活性KR的存在。

2.2. 结晶和数据收集

将蛋白质浓缩至10 mg ml⁻¹50米M（M）pH值为8的磷酸盐缓冲液，含10%的甘油。与其他SDR结构的比较表明，酮还原酶寡聚态可能是四聚体。这是通过原生PAGE进行研究的（图1). 在没有NADPH的情况下，酶似乎以低聚物状态（四聚体、二聚体和单体）的混合物存在。在其他相同条件下向酶中添加NADPH会产生代表四聚体的紧带。NADP公司⁺因此，将其添加到浓缩蛋白中，从而降低磷酸盐浓度，并确保酶以完整形式和均匀低聚状态存在。用于结晶的母液含有5 mg ml⁻¹蛋白质和5米M（M）NADP公司⁺25米M（M）pH值为8，10%的磷酸盐缓冲液(v（v）/v（v）)甘油。使用稀疏矩阵筛网（MDL筛网I和II），在291 K下使用悬挂液滴蒸汽扩散确定结晶条件。从含4.0–4.4的孔中获得的晶体中收集数据M（M）甲酸钠和10%(v（v）/v（v）)甘油在等体积的储液罐和母液混合后形成3µl的悬滴。这些晶体属于空间组 P（P）三₂21，带单元间参数一 = b条 = 103.9,c（c）= 123.1 Å,α=β= 90.0,γ= 120.0°. 将小的（0.1×0.05×0.05 mm）宝石晶体短暂转移到25%的低温保护剂中(v（v）/v（v）)甘油和75%(v（v）/v（v）)直接在氮气流中闪蒸冷却之前的井溶液。使用达累斯伯里实验室SRS 14.2号站的同步辐射在100 K下收集100%完成至2.5º分辨率的衍射数据（分辨率范围为20–2.5º的25 369次反射），并使用香港（HKL）2000（HKL Research Inc）（表1). 晶体中的溶剂含量表明不对称单元含有二聚体。与四聚体一致齐聚状态，这要求四聚体的双对称轴与双晶体轴一致，其余双对称轴为非晶体轴。

图1 酮还原酶的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。车道A类在pH为9的Tris缓冲液中显示17µl酮还原酶。车道B类显示同一缓冲液中17µl酮还原酶加上20 mM（M）NADPH公司。