Structure of a feruloyl esterase from Aspergillus niger

McAuley, K.E.; Svendsen, A.; Patkar, S.A.; Wilson, K.S.

doi:10.1107/S0907444904004937

研究论文

生物
结晶学

国际标准编号：1399-0047

第60卷| 第5部分| 2004年5月| 第878-887页

doi:10.1107/S09074449904004937

阿魏酰酯酶的结构黑曲霉

凯瑟琳·麦考利,^一艾伦·斯文森,^b条 Shamkant A.Patkar公司 ^b条和基思·S·威尔逊 ^c（c）^*

^一英国柴郡WA4 4AD沃灵顿CCLRC Daresbury实验室，^b条丹麦巴格斯瓦尔德6B-S107 2880 Novo Alle Novozymes A/S蛋白质化学部^c（c）英国约克大学约克结构生物学实验室
^*通信电子邮件：keith@ysbl.york.ac.uk

(收到日期：2003年2月4日； 2004年3月3日接受)

阿魏酰酯酶的晶体结构黑曲霉已确定分辨率为1.5º分子替换。该蛋白质具有α/β-具有Ser-His-Asp催化三联体的水解酶结构；蛋白质的总折叠与真菌脂肪酶的折叠非常相似。酶-产物复合物的结构被确定为1.08Å的分辨率，并揭示了活性位点丝氨酸和组氨酸残基的双重构象。

关键词：阿魏酰酯酶；阿魏酸酯酶；橡子；分子置换.

三维视图：1uza、1uwc

PDB参考：阿魏酰酯酶，1uza，r1uzasf；阿魏酸酯酶-阿魏酸复合物，1uwc，r1uwcsf

1.简介

阿魏酸酯酶（FAEs）参与植物细胞壁的降解，在细菌和真菌物种中都有发现（Donaghy&McKay，1997 ; 德弗里斯等。, 1997 ; 布鲁姆等。, 2000 ; 克罗恩等。, 2000 ). 植物细胞壁含有木质素、纤维素、半纤维素和果胶等聚合物。最丰富的半纤维素是阿拉伯木聚糖，它由β-带有阿拉伯糖、醋酸盐或甲基葡萄糖醛酸侧链的（1,4）连接木聚糖单元（图1). 阿拉伯木聚糖链通过交联阿魏酸二聚体加强，阿魏酸二聚体与阿拉伯糖酯化。阿魏酸还参与半纤维素与木质素的连接（拉尔夫等。, 1995 ).

图1
阿拉伯木聚糖的结构。插图显示了一种可以形成的阿魏酸二聚体。

细菌或真菌要打破细胞壁，不仅需要一系列半纤维素酶来降解多糖还有阿魏酰酯酶可以增加细胞壁的可及性水解酶类通过从木质素中释放阿拉伯木聚糖并破坏阿拉伯木聚糖链之间的交联，将其转化为底物。阿魏酸酯酶通过水解阿魏酸和阿拉伯糖之间的酯键来打破交联。水解产物阿魏酸可用于生产具有商业价值的化合物，例如p-香豆酸，通常用于防晒霜，或香兰素，一种广泛用于食品工业的调味剂。

研究最彻底的FAE之一是阿魏酰酯酶A（FAEA或FAE-III），来自黑曲霉。它具有较高的底物特异性酯类其中阿魏酰基连接到阿拉伯糖的C-5位置；它对C-2链接无效酯类（拉莱特等。, 1994 ). 影响底物特异性的其他因素包括芳香环上取代基的变化以及附着糖残基的类型和数量的变化（Kron等。, 1997 ). FAE-III还能够催化植物细胞壁释放二氟酸（Garcia-Conesa等。, 1999 ).

FAE-III的序列分析表明该酶是一种α/β-水解酶具有丝氨酸、组氨酸、天冬氨酸催化三联体。序列相似性最高的蛋白质，不包括非常相似的FAE，其同源性>93%A.瓦森和A.输卵管增多症，脂肪酶来自米黑根霉（房间：Brady等。, 1990 )，总序列一致性为32%。FAE-III包含特征性脂肪酶丝氨酸活性位点基序，鉴于序列相似性，预测FAE-III与真菌脂肪酶具有相当大的结构同源性和类似的催化机制。然而，FAE-III已被证明不具有脂肪酶活性（Aliwan等。, 1999 ).

最近，两种细菌阿魏酰酯酶的结构被发表：FAE_XynZ热梭菌（舒伯特等。, 2001 )和FAE_Xyn10B（赞美等。, 2001 )也来自C.热电偶虽然这些酶的功能与FAE-III相似，但没有明显的序列同源性。因此，为了检查酶的结构及其底物特异性，已结晶FAE-III，并求解天然酶和阿魏酸复合酶的晶体结构。

2.实验

2.1. 蛋白质制备

FAE-III表达于米曲霉并在细胞外介质中分泌。这个发酵通过阴离子交换纯化上清液色谱法使用安达信所述的快速流动Q-Sepharose（Pharmacia-Amersham）等。(2002 ).

2.2. 结晶

FAE-III通过悬挂液滴的蒸汽扩散结晶。1微升15毫克毫升⁻¹将蛋白质溶液与含有1.0的1µl沉淀剂溶液混合M（M）硫酸铵，0.1M（M）乙酸钠pH 4.5，并用500µl沉淀剂溶液平衡液滴。晶体在一到两周后生长。通过在添加有35%葡萄糖的母液溶液中短暂浸泡，对晶体进行冷冻保护。这个空间组是对1和天然酶的单位细胞参数为一= 38.3,b条= 39.7,c（c） = 77.1 Å,α= 75.2,β= 78.8,γ=71.3°。

阿魏酸配合物是通过将晶体浸泡在1.5M（M）硫酸铵，0.1M（M）醋酸钠pH 4.5，10 mM（M）阿魏酸和5%乙醇约2小时。

2.3. 数据收集

第一个本地数据集是在家庭实验室中使用旋转阳极源和MAR 345成像探测器收集的。数据的分辨率扩展到1.86º，数据完成率为93.5%，总体上R（右）_合并8.3%。数据是用处理的MOSFLM公司（莱斯利，1992年 )和缩放比例SCALA公司（合作计算项目，第4期，1994年）).

在欧洲同步辐射设施（ESRF）收集了第二个更高分辨率的本地数据集，在同步辐射源（英国达雷伯里）收集了该综合体的数据集。两个数据集均使用DENZO公司和电子秤组件（Otwinowski&Minor，1997年 ). 原生数据集的分辨率为1.5Å，完整性为94.4%，总体R（右）_合并占6.4%。复合体数据集的分辨率为1.08º，完整性为94%，总体R（右）_合并5.8%。所有数据收集的统计数据如表1所示.

表1
数据统计

括号中的值表示最高分辨率外壳。

	本地	本地	复杂
数据收集源	室内CuK（K）α	ESRF ID14-2号	第9.6条
波长（Å）	1.54	0.933	0.87
温度（K）	120	100	110
“空间”组	对1	对1	对1
单位-细胞参数
一(Å)	38.3	38.3	38.8
b条(Å)	39.7	39.7	40.2
c（c）(Å)	77.1	77	77.9
α(°)	104.9	75.2	75
β(°)	91.4	78.8	78.6
γ(°)	109.2	71.3	71.1
V（V）_M（M）(Å^三 Da公司⁻¹)	1.8	1.8	1.8
溶剂含量（%）	32	32	32
分辨率（Ω）	30–1.86	25–1.5	25–1.08
R（右）_合并(%)	8.3 (18.6)	6.4 (17.2)	5.8 (26.0)
平均值我/σ(我)	18.2 (6.1)	11.5 (2.5)	15.8 (2.5)
我 > 3σ(我) (%)	85	74	69
独特的反射	31690	64076	170583
冗余	3.6 (2.1)	2.1 (1.8)	2.9 (1.8)
完整性	93.5 (93.5)	94.4 (95.3)	93.5 (81.9)

2.4. 分子替换

脂肪酶来自R.米埃伊被选择作为分子替换试验的搜索模型。马修斯系数（Matthews，1968 )与非对称单元，溶剂含量分别为66或32%。在中执行旋转搜索后AMoRe公司（纳瓦扎，1994年 )两种解决方案明显优于其他解决方案，相关系数（CC_F）分别为10.7和9.1%，数据的分辨率范围为10-3.5º。次高的解决方案有相关系数5.8%。在平移搜索后，根据第一个分子和刚体定位第二个分子精炼在里面AMoRe公司，的相关系数增加到31%R（右）值为49%。C之间有大量密切接触^α对称相关分子的原子；然而，经检查发现，碰撞仅影响表面回路。

2.5. 精炼

这个精炼下面将更详细地讨论该策略，但总的来说，所使用的包是REFMAC公司5或REFMAC公司5.1（穆尔舒多夫等。, 1997 , 1999 ),ARP/wARP5.1（佩拉基斯等。, 1999 )和DM公司（Cowtan，1994年 ). 模型重建于XtalView（X塔尔视图）（麦克雷，1999年 ).

2.5.1.精炼内部数据的

僵硬的身体精炼在里面REFMAC公司在分辨率范围为20–1.86º的分子置换模型中R（右）价值和免费R（右）值分别为50.5%和49.3%。在这个阶段，涉及空间位阻的残留物被去除精炼继续使用NCS分阶段精炼ccp4i GUI的任务（协作计算项目，第4期，1994年). 此任务结合了REFMAC公司 精炼使用溶剂平坦化、直方图匹配和NCS平均DM公司由该过程产生的电子密度图被用来继续重建模型，但这些图很难解释。经过几轮精炼和模型重建，免费R（右）该值已降至46%，但没有进一步下降。

一个在精炼较差的分子置换溶液是ARP协议/弯曲（佩拉基斯，2001年 ). 事实证明，当分辨率高于2.0°时，自动构建选项通常很有用。然而，在这种情况下，分子置换模型中相的质量较差，导致由ARP协议/弯曲事实上是免费的R（右）数值增加，地图恶化。这座自动建筑在精炼上述步骤。

1.86º数据未能进一步完善，导致决定在同步加速器上收集更高分辨率的数据。

2.5.2。精炼同步加速器数据

来自更高分辨率数据的更多信息对精细化。重建模型（从精炼）定位于新的单位电池使用AMoRe公司和的warpNtrace模式ARP协议/弯曲然后用于自动构建新模型。warpNtrace的第一个构建周期在预期的520个残留物中发现了243个，导致了R（右）值为44%。迭代期间精细化，模型更新和构建循环免费R（右）稳定下降，直至达到26%，并形成488个残留物。现在，电子密度图的质量非常好，剩余的残留物很容易构建到密度中。

然而，获得在中成功使用的模型的过程ARP协议/弯曲这需要很多天的工作，所以我们研究了一些替代方案。首先，将分子置换溶液输入ARP协议/弯曲没有事先通知精细化。这没有奏效。其次，将分子置换溶液转化为多胺模型，并进行两个周期的REFMAC公司 精炼与结合ARP协议。中的参数ARP协议设置为1以下最多200个原子σ密度可以在每个循环中消除，并且可以添加20个新原子。这样做的目的是除去与邻近分子发生冲突的所有原子，并除去阿魏酰酯酶中不同的脂肪酶区域。231个原子实际上从模型中删除了。新的“trimmed”模型被输入到warpNtrace中，自动化建筑从此成功继续。

通过运行多个ARP协议/弯曲程序具有相同的参数，但在1.9和1.5º之间具有不同的高分辨率极限。100之后精炼循环和33个构建循环ARP协议/弯曲取决于分辨率（见表2). 这些结果表明，在这种特殊情况下，使用几个月前设置的默认参数，自动构建大多数蛋白质模型需要优于1.6º的分辨率。我们计划使用FAE-III数据作为测试案例，以改进精炼较差的分子置换溶液。

表2
ARP协议/弯曲结果

分辨率（Ω）	建成残留物数量（%）	R（右）价值	免费R（右）价值†
1.9	281 (54%)	19.5	50.3 ↑
1.8	275 (53%)	20.5	49.2 ↑
1.7	331 (64%)	20.4	44.5 ↓
1.6	430 (83%)	19.6	34.8 ↓
1.5	487 (94%)	18.4	27.0↓

†箭头表示自由值的增加或减少R（右）期间的值ARP协议/弯曲程序。

2.5.3. 阶段化和精炼FAE–阿魏酸复合物

程序橡子（福亚迪等。, 2000 )用于获取复杂数据的阶段，以避免因阶段划分而产生的模型偏差分子置换。使用天然结构的50个残基片段（残基A17–A67）作为橡子通过Patterson叠加（Sayre方程的两个循环）对碎片计算出的初始相进行了细化精炼动态密度修正47个周期。这个相关系数对于小的E类数值从0.0360增加到0.269。相位重新定义过程在3分钟内完成（Pentium III，1 GHz PC）。

ARP协议/弯曲5.1使用来自橡子在12个循环后精炼和四个建筑周期，共建造501个残留物。在这个阶段R（右）值为25%，免费R（右）值为28%。剩余的蛋白质残留物和两个阿魏酸分子是手动添加的。这个R（右）价值和自由R（右）之后的值精炼在里面REFMAC公司5.1和添加水分子使用ARP协议/弯曲分别为13.7%和15.9%。然后定位另一个阿魏酸分子和两个硫酸根离子并将其添加到模型中。决赛R（右）价值和自由R（右）各向异性温度系数后的值精炼用所有数据计算到1.08Ω分别为11.5%和13.8%。

我们回顾性地测试了橡子使用位于单位电池通过AMoRe公司如上所述，此模型很难用REFMAC公司和ARP协议/弯曲以直截了当的方式。93.5%的人完成了1.08º的间距数据，橡子在7分钟的计算时间后提供了一组相位。生成的地图基本上显示了所有原子，可以使用ARP协议/弯曲几乎没有用户干预。回想起来，这将是相位问题并进一步证明了橡子从相对较差的分子置换溶液中为原子分辨率数据提供一组无偏相位。数据完整性的重要性体现在未能产生令人满意的阶段发展橡子从更高分辨率的1.05º数据集开始，该数据集完成了85%（这些数据没有详细描述，因为它们没有用于最终的细化）。

3.结果和讨论

3.1. 原生结构和活动场地

最终模型由两个FAE-III分子、两个硫酸根离子和399个水分子组成。该蛋白在Asp79处被糖基化N个-在每个糖基化位点构建乙酰氨基葡萄糖（NAG）残基。该区域的电子密度图清晰有序，图中没有显示NAG残基上附加的额外碳水化合物残基。两种分子的电子密度图中都缺少N-末端丙氨酸残基非对称单元，但所有其他残留物都存在。结晶学R（右）模型值为15.6%（免费R（右）值18.8%）。表3提供了的详细信息细化统计和模型质量。

表3
精炼统计

	本地	复杂
分辨率范围（Ω）	30–1.5	25–1.08
R（右）值（%）	15.6	11.5
免费R（右）值（%）	18.8	13.8
R.m.s.偏差，粘结距离（Ω）	0.019	0.021
R.m.s.偏差，粘结角（°）	1.8	1.9
非氢原子总数	4476	4922
水分子	399	713
硫酸盐离子	2	2
阿魏酸分子	0	三
糖基化位点	NAG、AsnA类79和AsnB类79	NAG、AsnA类79和AsnB类79
平均值B类因子（Å²)
所有原子	15.9	11.8
主链条(A类链条，B类链条）	12.8, 14.3	8.5, 9.0
侧链(A类链条，B类链条）	15.4, 16.6	10.6, 11.1
水分子	26.9	23.8
硫酸盐离子	35.6	17.5
阿魏酸分子	—	11.3
NAG单位	10.9, 12.2	7.3, 7.4
拉马钱德兰统计†(A类链条，B类链条）
最受欢迎的地区	89.8, 90.2	91.6, 90.3
其他允许的区域	8.9, 8.4	7.0, 8.4
充分允许的区域	1.3, 1.3	0.9, 1.3
不允许的区域	0, 0	0.4, 0
PDB代码	1乌扎	1uwc（超宽带）
PDB结构系数代码	r1uzasf型	r1uwcsf

†Morris中描述了Ramachandran图的不同区域等。(1992

FAE-III具有α/β-水解酶折叠（Ollis等。, 1992 )由九股绞合线组成β-片芯由五个包围α-螺旋线和另外两个β-股。FAE-III的活性位点残基为Ser133、Asp194和His247。His247占据原子N的位置^∊与O形成氢键^γSer133的原子（2.8º的距离）和原子N^δ与Asp194的氢键（2.8°到O的距离^δ1和3.0º到O^δ2). 这种残基排列是通过亲核攻击分解酰胺或酯键的酶的特征，被称为催化三联体（如图4所示一). 组氨酸通过使丝氨酸脱质子起到普通碱的作用，这使得丝氨酸对底物的羰基C原子进行亲核攻击，产生四面体过渡态。组氨酸上产生的正电荷通过与带负电荷的天冬氨酸残基的静电相互作用而稳定。四面体过渡态坍塌形成酰基酶中间体。下一步是由亲核水分子攻击酰基酶，该分子再次被组氨酸残基激活，导致酸性产物释放通过第二个四面体中间过渡态。四面体中间体羰基O原子上的负电荷由主链N原子形成的氧阴离子空穴稳定，在本例中，主链N是残基Thr68和Leu134。Hedstrom（2002）最近审查了丝氨酸蛋白酶的机制 ).

天然FAE-III的两个分子晶体结构具有有序的活性位残基，具有单一构象，对应于活性催化三元结构，残基之间具有预期的氢键模式。

3.2. 与脂肪酶和细菌FAE的比较

这个三级构造从序列同源性来看，FAE-III与真菌脂肪酶最为相似。FAE-III和RmL之间的均方根（r.m.s.）偏差以及羊毛热菌脂肪酶（TlL）在217校准C上为1.0º^α205以上的原子和1.3μ^α原子。

脂肪酶可以以两种构象状态存在：一种是活性形式，其中催化残基被暴露；另一种是非活性形式，即螺旋盖，其中涉及残基82–96（TlL编号；Brzozowski等。, 2000 )覆盖活动站点。图2显示了FAE-III与开放型和封闭型脂肪酶的比较。FAE-III中的螺旋（残基71-77）对应于TlL的盖子，不屏蔽活性位点残基，大致对应于脂肪酶的开放形式。由于FAE没有显示脂肪酶活性（Aliwan等。, 1999)，该螺旋不太可能需要采用两种构象。

图2
的图表(一)开放式TlL(b条)FAE-III和(c（c）)封闭式TlL。左侧的带状图为黄色，用于β-床单，红色α-螺旋和紫色代表盖子螺旋。右侧是溶剂可及曲面表示。表面按残留物类型着色：蓝色、碱性；红色，酸性；黄色，极性；灰色，疏水；绿色，催化三联体。图2、4、5(b条)和6个是使用PyMOL公司（德拉诺，2002

虽然整体结构相似，但活性位点区域必须不同，以适应底物的差异。这可以从图2所示的表面表示中看出：与具有更多疏水表面的脂肪酶结构相比，FAE-III在活性部位周围的区域中暴露了更多的极性残基。

FAE-III和FAE来自C.热电偶没有显著的序列同源性。序列比对使用多序列比对（汤普森等。, 1997 )未能将催化残基和序列数据库搜索与FAE-III序列对齐，无法将FAE_XynZ或FAE_Xyn10B识别为同源物。FAE-III的结构和C.热电偶使用该程序叠加FAE总工程师（Shindyalov&Bourne，1998年 )得到的基于结构的序列比对如图3所示(一). 在这种排列中，催化残留物重叠，几个二级结构元素重叠。对于146校准C，FAE-III和FAE_XynZ之间的均方根偏差为4.0º^α原子，对于FAE_Xyn10B，153个对齐C的r.m.s.偏差为4.4º^α原子。这些偏差高于上述真菌脂肪酶的偏差，这证实了FAE-III确实与真菌脂肪素比细菌FAE更为相似。

图3
基于结构的序列比对(一)FAE-III与TlL和RmL脂肪酶和(b条)带有FAE_Xyn10B和FAE_XynZ的FAE-III。二级结构元素显示在序列比对之上。催化残留物以粉红色突出显示(电子脚本; 痛风等。, 1999

). 的拓扑图(c（c）)FAE-III(d日)RmL和(电子)FAE_Xyn10B创建人最上等的（西黑德等。, 1999

). 圆圈代表螺旋，三角形代表β-股。形成中心的线束β-床单是红色的。

FAE-III梭菌属FAE和脂肪酶都是α/β-水解酶家族，可以假定起源于共同祖先。所有FAE共享丝氨酸共同的丝氨酸基序水解酶，即。克X（X）S公司X（X）G、它们都有一个催化三联体和中央β-板芯被包围α-螺旋线。然而，序列和拓扑（图3b条)表明FAE-III和脂肪酶的发散时间晚于细菌FAE与共同祖先的发散，即阿魏酸酯酶活性进化了两次：一次用于细菌FAE，一次用于真菌FAE。

3.3. 催化三联体中残基构象的变化

FAE-III及其产物阿魏酸的配合物的结构以原子分辨率测定细化统计如表3所示总的来说，复合蛋白质结构和游离蛋白质结构之间几乎没有差异。C的r.m.s.偏差^α分子的原子被计算为0.24ºA类分子为0.32ºB类然而，活性部位残基的构象存在差异。

3.3.1. 序列133

催化丝氨酸残基Ser133在天然结构的两个分子中均为单一活性构象（图4一). 然而，当阿魏酸结合在活性位点时，我们观察到丝氨酸残基的两种构象（图4b条和4c（c）). 一种构象与原生结构中的构象相同χ₁扭转角约为−155°；这对应于活性构象。在这种构象中，O^γ原子与阿魏酸的羧酸根形成氢键。分子中有额外的氢键B类也见于Ser133和N之间的非酶^∊His247构象之一的原子（如图4所示c（c）). 这个χ₁丝氨酸残基的第二构象角对于分子来说是−49°A类分子为−54°B类在这种构造中，O^γ丝氨酸原子与水分子形成氢键。在以前的高分辨率酯酶结构中观察到催化丝氨酸的交替构象，例如. the茄镰刀菌角质酶（龙喜等。, 1997 )，的紫青霉乙酰木聚糖酯酶（Ghosh等。, 2001 )和枯草芽孢杆菌脂肪酶（川崎等。, 2002 ).

图4
FAE-III活性位点残基的观点：Ser133、Asp194和His247。电子密度显示为1σ青色和3σ紫色。(一)具有活性催化三联体的天然酶。(b条)FAE-III–阿魏酸复合物，如分子所示A类His247改变了位置，留下了一个不活动的三和弦。(c（c）)分子B类FAE-III–阿魏酸复合物。His247在活性构象和非活性构象中都可见。(b条)和(c（c）)还显示了催化Ser133残基的两种构象。

3.3.2. His247号

天然酶中的His247以对应于催化三联体组氨酸残基的活性取向的单一构象存在，即在丝氨酸和天冬氨酸残基的氢键距离内。然而，酶-产物复合物并非如此，在酶-产物复合体中，我们观察到分子活性位点之间的差异A类和分子B类.在分子中A类，His247已经脱离了Asp194和His N之间的氢键^δ天冬氨酸的羧酸基被破坏（非活性形式）。相反，组氨酸与两个水分子形成氢键，如图4所示(b条). 催化三联体组氨酸的这种构象是不寻常的，但在一些丝氨酸蛋白酶抑制剂复合体中，组氨酸以类似的方式旋转出活性位点(例如.詹姆斯等。, 1980 ; 骨骼等。, 1991 ; 科斯泽拉克等。, 1997 ). 分子His247B类以两种构象存在（图4c（c）). 一种构象如分子所述A类另一个是在本地结构中观察到的位置，即。催化活性形式。

为什么我们在分子中观察到His247的两种构象B类分子中只有一种构象A类? 这并不是因为阿魏酸分子的占有率不同B类-阿魏酸分子和周围蛋白质残基之间的值比较表明，这两种分子的占有率相似。平均值B类蛋白质残基在结合位点10度内的因子为8.3度^三对于分子A类和7.9欧^三对于分子B类和平均值B类阿魏酸的因子为10.5º^三对于这两个A类和B类分子。这意味着两种组氨酸构象之间的自由能差接近于零，因此这两种构象可以很容易地相互转化。

3.3.3. Asp194型

当阿魏酸与FAE-III结合时，天冬氨酸194保持不变。天冬氨酰194具有单一构象，在复合物的两个分子和非复合天然结构的两个细胞中都是相同的。

3.4。一个破碎的催化三元体

在天然结构中没有观察到丝氨酸和组氨酸残基的双重构象，尽管具有足够的高分辨率数据以便于识别交替的构象。天然晶体和络合晶体之间的唯一区别是，后者已浸泡在含有阿魏酸的稳定溶液中。组氨酸与分子中丝氨酸和天冬氨酸残基之间缺乏相互作用A类FAE-III产物复合物的活性意味着酶不能被激活，因此我们必须考虑这种失活的原因。当在pH 8.5（Schubot等。, 2001). 一旦收到FAE_XynZ–传真_三复合物在pH 8.0下结晶，组氨酸恢复到其在自由酶结构中的位置。作者得出结论，组氨酸取向的变化是由pH效应引起的。然而，对于FAE-III，游离和络合结构都是在pH 4.5下测定的，这接近于酶的最佳pH值，即pH 5.0（de Vries等。, 1997). 因此，pH值不太可能是FAE-III催化三联体变化的唯一原因。

关于丝氨酸酯酶催化成功是否需要催化组氨酸的移动，文献中存在一些争议。由于组氨酸有利于从丝氨酸中去除质子，因此在四面体中间体分解期间，组氨酸似乎有利于将质子送回丝氨酸，从而导致底物再生，而不是反应继续生成。类似的论点也适用于第二个四面体中间体的坍塌。为了解决这个问题，已经提出了一些涉及组氨酸运动的建议。¹⁵核磁共振研究表明，当四面体中间体形成时，天冬氨酸-H的氢键被破坏，带正电的组氨酸移动到一个位置，向离开组（巴乔夫钦，1986年 ). 另一种理论是组氨酸的咪唑发生“环翻转”（灰烬等。, 2000 ). 在四面体中间物形成后，咪唑环翻转，即。围绕C旋转约180°^β-C类^γ发生键，因此N上的质子^δ1现在位于离开小组。这项提议有反论点：从头算四面体中间体的QM/MM动力学模拟发现组氨酸在四面体结构的两个O原子之间移动，但在模拟过程中没有发生环滑移（Topf等。, 2002 ). 虽然有许多高分辨率的丝氨酸蛋白酶复合物晶体结构(例如库恩等。, 1998 ; 卡托纳等。, 2002 )，只有一例在翻转方向观察到催化组氨酸，即枯草杆菌素在50%二甲基甲酰胺（Kidd等。, 1999 ).

然而，在FAE-III产品复合物中，His247的两个取向都不符合催化组氨酸的假设“翻转”取向。相反，我们观察到His247的两个方向。这两个位置通过围绕C旋转约38°而相互关联^α-C类^β债券。这种运动的作用是破坏组氨酸-天冬氨酸氢键，因此我们的结构反而支持Bachovchin（1986）提出的移动组氨酸机制).

3.4.1. 阿魏酸的结合作用

电子密度图清楚地显示阿魏酸分子结合在酯酶活性部位非对称单元。阿魏酸通过其OH和OCH相互作用_三带有Tyr80羟基的基团。羧酸盐基团位于氧阴离子空穴区域，靠近Leu134的主链N原子、Thr68的骨架N原子和OH基团以及活性位点丝氨酸残基（图5一). Leu199和Ile196提供疏水环境。直接参与阿魏酸结合的氨基酸在天然结构和复合结构中保持不变。电子密度图的高分辨率表明，阿魏酸分子并不像之前的FAE-阿魏酸络合物（Schubot等。2001年; 普拉茨等。, 2001). 羧酸酯基团特别是扭曲远离平面构型（见图5一). 配合物数据集的原子分辨率允许估计阿魏酸羧酸基团的电荷分布。根据O原子位置上的键长和电子密度水平判断，负电荷似乎位于最接近Ser133的O原子（O2）上。电子密度大于6σ在该原子上观察到，但仅在4σ另一个O原子（O1）的能级。C-O1键距离为1.26 Au，C-O2距离为1.34 Au。这将支持羧酸基团的质子化状态，氢附着在O2上。然而，没有显著的密度差异来支持这一点。

图5
阿魏酸在活性部位结合的直接和水介导酶-产品相互作用(一)以及距活动地点较远的地点(b条). (c（c）)阿魏酸的正交视图，电子密度轮廓为1.5σ青色和5σ紫色。

当FAE-III–阿魏酸复合物的结构与C.热电偶FAE–阿魏酸络合物，发现阿魏酸的结合方向非常不同（见图6). 在这三种不同的配合物中，来自FAE-III和FAE_XynZ的阿魏酸的取向和位置最为相似，原子位置的偏差从羧酸基的最小0.85º到分子另一端的最大4.9º不等。FAE_Xyn10B中的阿魏酸可能由于活性位点存在甘油分子以及活性位点丝氨酸突变为丙氨酸而从其“通常”的结合位点被取代。如果从模型中删除甘油，则可以移动阿魏酸，使羧酸基团位于与其他酶-阿魏酸结构中观察到的位置类似的位置，并且只需轻轻旋转分子即可消除空间位阻。或者，如§3.2.

图6
FAE-III（C原子和黄色带状物）、FAE_Xyn10B（蓝色）和FAE_XymZ（绿色）活性位点的立体视图。标记催化三联体的残留物；然而，FAE_Xyn10B和FAE_XymZ有Ser到Ala突变。

有支持性证据表明，阿魏酸可以以非生产性的方式与蛋白质结合，因为在FAE-III复合物中发现的第三种阿魏酸分子距离活性位点约20º。这种阿魏酸与分子相互作用A类残渣AsnA类223和一个分子B类来自不同的非对称单元通过将水分子转化为天冬氨酸B类217; 这些相互作用如图5所示(b条).

4.结论

FAE-III获得的高分辨率晶体学数据在许多方面都很有用。首先，将分辨率提高到1.5º使我们能够细化分子再置换溶液，这是我们无法用原始的1.86º数据完成的。通过收集酶复合物的1.08？数据集，我们能够使用橡子执行阶段精炼从模型的一小部分开始。通过这种方式，我们可以避免模型偏差。其次，高分辨率数据允许使用自动化方法构建蛋白质模型和水结构，用户干预很少。最后，高分辨率允许我们详细检查与底物结合和水解有关的残留物。例如，我们可以看到阿魏酸是非平面的，我们可以识别活性位点残基的双重构象，这在较低分辨率下是不可能的。

支持信息

三维视图：1uza、1uwc

PDB参考：阿魏酰酯酶，1uza，r1uzasf；阿魏酸酯酶-阿魏酸复合物，1uwc，r1uwcsf

工具书类

Aliwan，F.O.，Kron，P.A.，Faulds，C.B.，Pickersgill，R.&Williamson，G.（1999）。科学杂志。粮食农业。 79, 457–459. 交叉参考中国科学院谷歌学者
 Andersen，A.、Svendsen，A.，Vind，J.、Lassen，S.F.、Hjort，C.、Borch，K.和Patkar，S.A.（2002）。胶体。冲浪。B类,26, 47–55. 科学网交叉参考中国科学院谷歌学者
 Ash，E.L.、Sudmeier，J.L.、Day，R.M.、Vincent，M.、Torchilin，E.V.、Haddad，K.C.、Bradshaw，E.M.、Sanford，D.G.和Bachovchin，W.W。(2000).程序。美国国家科学院。科学。美国,97, 10371–10376. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Bachovchin，W.W.（1986）。生物化学,25, 7751–7759. 交叉参考中国科学院公共医学科学网谷歌学者
 Blum，D.L.、Kataeva，I.A.、Li，X.-L.和Ljungdahl，L.G.（2000）。《细菌学杂志》。 182, 1346–1351. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Bone，R.、Sampson，N.S.、Bartlett，P.A.和Agard，D.A.（1991）。生物化学,30, 2263–2272. 交叉参考公共医学中国科学院科学网谷歌学者
 Brady，L.、Brzozowski，A.M.、Derewenda，Z.S.、Dodson，E.J.、Dodison，G.、Tolley，S.、Turkenburg，J.P.、Christiansen，L.，Hugejensen，B.、Norskov，L.和Thim，L.&Menge，U.（1990年）。自然（伦敦）,343, 767–770. 交叉参考中国科学院公共医学科学网谷歌学者
 Brzozowski，A.M.，Savage，H.，Verma C.S.，Turkenburg，J.P.，Lawson，D.M.，Svendsen，A.&Patkar，S.（2000年）。生物化学,39, 15071–15082. 谷歌学者
 协作计算项目，第4期（1994年）。《水晶学报》。D类50，760–763交叉参考 IUCr日志谷歌学者
 考坦，K.（1994）。Jnt CCP4/ESF–EACBM新闻。蛋白质结晶仪。 31, 34–38. 谷歌学者
 DeLano，W.L.（2002）。PyMOL分子图形系统。 https://www.pymol.org. 谷歌学者
 Donaghy，J.和McKay，A.M.（1997）。J.应用。微生物。 83, 718–726. 科学网交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 Foadi，J.、Woolfson，M.M.、Dodson，E.J.、Wilson，K.S.、Yao，J.-X.&Zheng，C.-D.（2000年）。《水晶学报》。D类56, 1137–1147. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Garcia-Conesa，M.-T.，Kron，P.A.，Ralph，J.，Mellon，F.A.，Colquhoun，I.J.，Saulnier，L.，Thibault，J.-F.和Williamson，G.（1999）。欧洲生物化学杂志。 266, 644–652. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Ghosh，D.、Sawicki，M.、Lala，P.、Erman，M.和Pangborn，W.、Eyzaguirer，J.、Gutierrez，R.、Jornvall，H.和Thiel，D.J.（2001年）。生物学杂志。化学。 276, 11159–11166. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Gouet，P.、Courcelle，E.、Stuart，D.I.和Metoz，F.（1999）。生物信息学,15, 305–308. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Hedstrom，L.（2002）。化学。版次。 102, 4501–4523. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 James，M.N.G.，Sielecki，A.R.，Brayer，G.D.，Delbaere，L.T.J.&Bauer，C.A.（1980）。分子生物学杂志。 144, 43–88. 交叉参考中国科学院公共医学科学网谷歌学者
 Katona，G.，Wilmouth，R.C.，Wright，P.A.，Berglund，G.I.，Hajdu，J.，Neutze，R.&Schofield，C.J.（2002年）。生物学杂志。化学。 277, 21962–21970. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Kawasaki，K.、Kondo，H.、Suzuki，M.、Ohgiya，S.和Tsuda，S.（2002年）。《水晶学报》。D类58, 1168–1174. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Kidd，R.D.、Sears，P.、Huang，D.-H.、Witte，K.、Wong，C.-H.和Farber，G.K.（1999）。蛋白质科学。 8，410–417页科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Koszelak，S.、Ng，J.D.、Day，J.、Ko，T.-P.、Greenwood，A.和McPherson，A.（1997）。生物化学,36, 6597–6604. 交叉参考中国科学院公共医学科学网谷歌学者
 Kron，P.A.，Faulds，C.B.，Brezillon，C.&Williamson，G.（1997年）。欧洲生物化学杂志。 248, 245–251. 交叉参考中国科学院公共医学科学网谷歌学者
 Kron，P.A.、Williamson，G.、Fish，N.M.、Archer，D.B.和Belshaw，N.J。(2000).欧洲生物化学杂志。 267, 6740–6752. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Kuhn，P.、Knapp，M.、Soltis，S.M.、Ganshaw，G.、Thoene，M.&Bott，R.（1998）。生物化学,37, 13446–13452. 科学网交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 Leslie，A.G.W.（1992年）。Jnt CCP4/ESF–EAMCB新闻。蛋白质晶体学。 26，27-33谷歌学者
 Longhi，S.、Czjzek，M.、Lamzin，V.、Nicolas，A.和Cambillau，C.（1997年）。分子生物学杂志。 268, 779–799. 交叉参考中国科学院公共医学科学网谷歌学者
 McRee，D.E.（1999）。J.结构。生物。 125, 156–165. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Matthews，B.W.（1968年）。分子生物学杂志。 33, 491–497. 交叉参考中国科学院公共医学科学网谷歌学者
 Morris，A.L.、MacArthur，M.W.、Hutchinson，E.G.和Thornton，J.M.（1992）。蛋白质,12, 283–291. 交叉参考科学网谷歌学者
 Murshudov，G.N.、Vagin，A.A.和Dodson，E.J.（1997年）。《水晶学报》。D类53, 240–255. 交叉参考中国科学院科学网 IUCr日志谷歌学者
 Murshudov，G.N.、Vagin，A.A.、Lebedev，A.、Wilson，K.S.和Dodson，E.J.（1999）。《水晶学报》。D类55, 247–255. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Navaza，J.（1994）。《水晶学报》。A类50, 157–163. 交叉参考中国科学院科学网 IUCr日志谷歌学者
 Ollis，D.L.、Cheah，E.、Cygler，M.、Dijkstra，B.、Frolow，F.、Franken，S.M.、。，Harel，M.、Remington，S.J.、Silman，I.、Schrag J.、Sussman，J.L.、。，Verschueren，K.H.G.和Goldman，A.（1992年）。蛋白质工程。 5, 197–211. 谷歌学者
 Otwinowski，Z.&Minor，W.（1997年）。方法酶制剂。 276, 307–326. 交叉参考中国科学院科学网谷歌学者
 Perrakis，A.、Harkiolaki，M.、Wilson，K.S.和Lamzin，V.S.（2001）。《水晶学报》。D类57, 1445–1450. 科学网交叉参考中国科学院 IUCr日志谷歌学者
 Perrakis，A.、Morris，R.和Lamzin，V.S.（1999）。自然结构。生物。 6, 458–463. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Prates，J.A.M.、Tarbouriech，N.、Charnock，S.J.、Fontes，C.M.G.A.、Ferreira，L.M.A.和Davies，G.J.（2001）。结构,9, 1183–1190. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Ralet，M.-C.，Faulds，C.B.，Williamson，G.&Thibault，J.-F.（1994）。碳水化合物。物件。 263, 257–269. 交叉参考中国科学院公共医学科学网谷歌学者
 Ralph，J.、Grabber，J.H.和Hatfield，R.D.（1995）。碳水化合物。物件。 275, 167–178. 交叉参考中国科学院科学网谷歌学者
 Schubot，F.D.、Kataeva，I.A.、Blum，D.L.、Shah，A.K.、Ljungdahl，L.G.、。，Rose，J.P.和Wang，B.-C.（2001）。生物化学,40, 12524–12532. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Shindyalov，I.N.&Bourne，P.E.（1998年）。蛋白质工程。 11，739–747页科学网交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 汤普森，J.D.、吉布森，T.J.、普列尼亚克，F.、詹穆金，F.和希金斯，D.G.（1997）。核酸研究。 25, 4876–4882. 科学网交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 Topf，M.，Varnai，P.&Richards，W.G.（2002年）。美国化学杂志。Soc公司。 124, 14780–14788. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Vries，R.P.de，Michelsen，B.，Poulsen，C.H.，Kron，P.A.，van den Heuvel，R.H.H.，Faulds，C.B.，Williamson，G.，van sen Hombergh，J.P.T.W.&Visser，J.（1997）。申请。环境。微生物。 63, 4638–4644. 公共医学科学网谷歌学者
 Westhead，D.R.、Slidel，T.W.、Flores，T.P.和Thornton，J.M.（1999）。蛋白质科学。 8, 897–904. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者