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结晶纸\（\def\h填{\hskip5em}\def\hfil{\hski p3em}\def\eqno#1{\hfil{#1}}\）

期刊徽标结构
生物学
国际标准编号：2059-7983
第60卷| 第4部分| 2004年4月| 第770-772页
https://doi.org/10.107/S090744904003221

Y75N突变体的结晶和X射线分析脓疱毛霉菌胃蛋白酶与抑制剂复合

十字标记_颜色_方形_文本.svg
穆罕默德·巴达索,一* V.达纳拉吉,b条 S.P.木材,c（c） J.B.库珀c（c）和T.L.布伦德尔b条

一美国明尼阿波利斯明尼苏达大学口腔科学系，邮编：55455，b条剑桥大学生物化学系，英国剑桥CB1 1QW网球场路，以及c（c）英国南安普顿大学生物科学学院生物化学与分子生物学系，南安普敦SO16 7PX
*通信电子邮件：badas001@umn.edu

(收到日期：2003年10月24日； 2004年2月6日接受)

Y75N突变体脓疱毛霉菌胃蛋白酶在酵母中过表达，纯化后与含碘人肾素抑制剂CP-113972共结晶R（右）,3S公司)-异丙基3-[(L（左）-脯氨酰-第页-碘-L（左）-苯丙氨酸-S公司-甲基半胱氨酸）氨基-4]-环己基-2-羟基丁酸}用于X射线晶体学。四方复合晶体空间组 对4三21采用悬挂滴气相扩散法生成2，衍射至3.0º。晶体显示出单位-细胞参数一=b条=182.5，c（c）=99.1º，并且在非对称单元。使用Cu在298 K下收集了96%的完整数据集K（K）α旋转阳极发生器的X射线。的解决方案晶体结构Y75N突变体微小毛霉胃蛋白酶正在进行中分子置换使用野生型分子坐标微小毛霉胃蛋白酶作为模型。

类似文章

1.简介

天冬氨酸蛋白酶广泛分布于真菌、植物和脊椎动物中，也存在于HIV逆转录病毒中，其中蛋白酶参与颗粒成熟。这些酶在商业和医学研究中都非常重要，并与高血压、疟疾、淀粉样疾病和肿瘤发生等疾病有关（达纳拉吉等。, 1992[Dhanaraj，V.，Dealwis，C.，Frazao，C.，Badasso，M.O.，Sibanda，B.L.，Tickle，I.J.，Cooper，J.B.，Driessen，H.P.C.，Newman，M.，Aguilar，C.F.，Wood，S.P.，Blundell，T.L.，Hobart，P.M.，Geoghegan，K.，Ammirati，M.J.，Danley，D.E.，O'Connor，B.A.&Hoover，D.（1992）。《自然》（伦敦），357，466-471]; 交易等。, 1994【Dealwis，C.、Frazao，C.、Badasso，M.O.、Sibanda，B.L.、Tickle，I.J.、Cooper，J.B.、Driessen，H.P.C.、Wood，S.P.&Blundell，T.L.（1994）。分子生物学杂志。236，342-360。】; Metcalf&Fusek，1993年[Metcalf，P.&Fusek，M.（1993），EMBO J.12，1293-1302。]; 席尔瓦等。, 1996【Silva，M.，Lee，A.Y.，Gulnik，S.V.，Majer，P.，Collins，J.，Bhat，T.N.，Collints，P.J.，Cachau，R.E.，Luker，K.E.，Gluzman，I.Y.，Francis，S.E.，Oksman，A.，Goldber，D.E.&Erickson，J.W.（1996），美国国家科学院学报，93，10034-10039。】). 它们的抑制剂不仅被证明对艾滋病的治疗很重要，而且被认为是其他主要疾病的潜在治疗剂。对这些酶的X射线晶体学分析表明，它们的三维X射线晶体结构彼此相似（安德列娃等。, 1984[Andreeva，N.S.，Zadanov，A.S.，Gustchina，A.E.&Federov，A.（1984）。《天冬氨酸蛋白酶及其抑制剂》，V.Kostka编辑，第137-150页。柏林：Walter de Gruyter。]; James&Sielecki，1983年[James，M.N.G.和Sielecki，A.（1983），《分子生物学杂志》163、299-301。]; 米勒等。, 1989【Miller，M.、Jaskolski，M.，Rao，J.K.、Leis，J.和Wlodawer，A.（1989）。《自然》（伦敦），337，576-579。】; 布伦德尔等。, 1990[Blundell，T.L.，Jenkins，J.A.，Sewell，B.T.，Pearl，L.H.，Cooper，J.B.，Tickle，I.J.，Veerapandian，B.&Wood，S.P.（1990），《分子生物学杂志》211，919-941.]; 达纳拉吉等。, 1992[Dhanaraj，V.，Dealwis，C.，Frazao，C.，Badasso，M.O.，Sibanda，B.L.，Tickle，I.J.，Cooper，J.B.，Driessen，H.P.C.，Newman，M.，Aguilar，C.F.，Wood，S.P.，Blundell，T.L.，Hobart，P.M.，Geoghegan，K.，Ammirati，M.J.，Danley，D.E.，O'Connor，B.A.&Hoover，D.（1992）。《自然》（伦敦），357，466-471]; 阿吉拉尔等。, 1997【Aguilar，C.F.，Cronin，N.B.，Badasso，M.O.，Dreyer，T.，Newman，M.，Cooper，J.B.，Hoover，D.，Wood，S.P.，Johnson，M.S.&Blundell，T.L.（1997），《分子生物学杂志》267，899-915。】; 杨等。, 1997【Yang，J.、Teplyakov，A.和Quail，W.J.（1997），《分子生物学杂志》，第268、449-459页。】; 科代罗等。, 1998【Cordeiro，M.、Lowther，T.、Dunn，B.M.、Guruprasad，K.、Blundell，T.L.、Pais，M.S.和Brodelius，P.E.（1998）。天冬氨酸蛋白酶，M.N.G.James编辑，第473-479页。纽约：Plenum出版社。]). 它们主要包括β-由两个相似的结构域组成的片状结构，每个结构域贡献一个天冬氨酸残基形成一个催化二元结构，起到裂解底物肽键的作用（詹姆斯等。, 1982[James，M.N.G.，Sielecki，A.R.，Salituro，F.，Rich，D.H.&Goffmann，T.（1982）。美国国家科学院院刊，79，6137-6141]; 布伦德尔等。1990年[Blundell，T.L.，Jenkins，J.A.，Sewell，B.T.，Pearl，L.H.，Cooper，J.B.，Tickle，I.J.，Veerapandian，B.&Wood，S.P.（1990），《分子生物学杂志》211，919-941.]). 柔性皮瓣区也位于活性部位的入口，皮瓣上的酪氨酸残基在天冬氨酸蛋白酶中高度保守。该残基Tyr75（胃蛋白酶编号）已被证明参与抑制剂与活性位点的结合。

天冬氨酸蛋白酶在催化活性以及活性位点周围残基发生变化时的底物特异性。这些表明了这类酶的特异性和pH值优化的基础（Fruton，1976）【Fruton，J.S.（1976），酶学，44，1-36。】; 霍夫曼和霍奇斯，1982年[Hofmann，T.和Hodges，R.S.（1982）。生物化学，203603-643。]; Mantafounis&Pitts，1990年【Mantafounis，D.&Pitts，J.E.（1990）。蛋白质工程3，605-609。】). 为此，已使用重组DNA方法进行明确的序列改变，以测试这些假设和一些凝乳酶和微小毛霉胃蛋白酶的特征（铃木等。, 1989[铃木，J.，佐佐木，K.，佐佐，Y.，Hamu，A.，Hawasaki，H.，Nishiyama，M.，Horinochi，S.&Beppu，T.（1989）.蛋白质工程2，563-569.]; Mantafounis&Pitts，1990年【Mantafounis，D.&Pitts，J.E.（1990）。蛋白质工程3，605-609。】; 卡明斯和麦库曼，1986年【Cummings，D.&McCumman，M.（1986），《分子化学杂志》26115348。】; Strop公司等。, 1990【Strop，T.、Sedlacek，J.、Stys，J.和Kaderabkova，Z.、Blaha，I.、Pavlickova、L.、Pohl，J..、Fabry，M.、Kostka，V.、Newman，M.和Frazao，C.、Shearer，A.、Tickle，I.J.和Blundell，T.L.（1990）。生物化学，29，9863-9871。】; Jun-ichi先生等。, 1991[Jun-ichi，A.，Ryuji，H.，Makato，N.，Sueharu，H.&Beppu，T.（1991）。天冬氨酸蛋白酶的结构和功能，由B.M.Dunn编辑，第233-243页。纽约：Plenum出版社。]). 在本文中，我们描述了一种突变形式（Y75N）的成功共结晶微小毛霉胃蛋白酶与一种含碘的人肾素抑制剂复合，并对复合晶体进行了初步的X射线分析。

微小毛霉胃蛋白酶（酶代码EC3.4.23.6）是一种挤奶用真菌天冬氨酸蛋白酶。在牛奶凝结中，微小毛霉胃蛋白酶裂解乳蛋白酪蛋白，具有与哺乳动物小牛凝乳酶相似的特异性，不仅具有较高的切乳活性，而且具有较低的蛋白水解活性，产生较高的凝血物质。Tyr75突变为Asn会降低非特异性蛋白水解酶活性，导致特异性凝血活性的相对增强。X射线晶体结构分析与抑制剂CP-113972复合的突变体Y75N将提供信息，解释所观察到的突变体特性的调制微小毛霉胃蛋白酶。

2.材料和方法

2.1、。净化

如其他地方所述（Jun-ichi等。, 1991[Jun-ichi，A.，Ryuji，H.，Makato，N.，Sueharu，H.&Beppu，T.（1991）。天冬氨酸蛋白酶的结构和功能，由B.M.Dunn编辑，第233-243页。纽约：Plenum出版社。])原生和突变微小毛霉胃蛋白酶被正确加工并从中大量分泌酿酒酵母MC16携带大肠杆菌穿梭质粒JP1。这包括酵母GAL7启动子上游微小毛霉胃蛋白酶基因。简要地，酿酒酵母含有JP1的MC16菌株在含2%的LB培养基中于293 K下生长(w个/v（v）)锥虫双球菌，1%(w个/v（v）)Bacto酵母提取物和2%(w个/v（v）)葡萄糖和含有该酶的培养上清液直接应用于DEAE-Sephadex a-­50离子交换柱上。用50 m洗脱吸收的蛋白质M（M）pH 5.5的磷酸钠缓冲液，含150mM（M）氯化钠。然后将含有突变酶的部分浓缩在带有PM-30膜的Amicon搅拌细胞中，并应用于FPLC系统上的Superdex-200凝胶过滤柱上（瑞典法玛西亚生物技术公司）。蛋白以单峰洗脱，SDS-PAGE显示出单一的蛋白主带。纯和同质突变体小沙鼠使用Centricon-30浓缩器浓缩胃蛋白酶进行结晶。

2.2. 抑制剂

CP-113972是一种去甲肾上腺素类抑制剂（Cooper等。, 1989【库珀，J.B.，Foundling，I.S.，布伦德尔，T.L.，博格，J.，朱普，R.A.和凯，J.（1989）。生物化学，28，8596-8603。】)由辉瑞制药公司提供，用于研究人类肾素。它以前与人和小鼠肾素共结晶，并在pH 7.4时用IC抑制人血浆肾素50310 nm的值（巴达索，1994【Badasso，M.O.（1994），英国伦敦大学博士论文。】). 正如胡佛所描述的那样，它是逐步合成的等。(1989【胡佛·D·J、罗莎蒂·R·L和韦斯特·R·T（1989）。美国专利4 814 342；实施例45。】)来自Boc-SMe-Cys，Boc-第页-I-Phe和Boc-Pro。CP-113972的化学结构如图1所示[链接].

[图1]
图1
CP-113972的化学结构(X（X）=L（左）-Pro和年=S）。

2.3. 结晶

Y75N突变酶与抑制剂CP-­113972复合后，采用悬挂滴蒸气扩散法结晶（McPherson，1999）[McPherson，A.（1999），《生物大分子结晶》，第188页。美国纽约：冷泉港实验室出版社。]). 晶体形成的条件与野生型的有效条件相似微小毛霉胃蛋白酶（纽曼等。, 1991【Newman，M.、Safro，M.，Frazao，C.、Khan，G.、Zdanov，A.、Tickle，I.J.、Blundell，T.L.和Andreeva，N.S.（1991），《分子生物学杂志》221195-1301。】). 突变体小沙鼠胃蛋白酶-CP-113972共晶体是通过将5µl酶抑制剂复合物溶液与等体积的储液溶液混合获得的。将10倍过量的抑制剂溶解在50 m缓冲的酶溶液中M（M）采用pH5.5的磷酸钠和硫酸铵作为沉淀剂。突变酶浓度为10 mg ml−1硫酸铵的浓度在30%到35%之间变化(w个/v（v）). 晶体在293 K温度下出现于2–3 d内，一周后增长至最大尺寸0.5×0.3×0.1 mm。复合晶体是四方的，估计溶剂含量为58.67%（Matthews，1968【Matthews，B.W.（1968），《分子生物学杂志》，第33期，第491-497页。】)，对应于每四个分子非对称单元（图1[链接]).

2.4. 数据收集和处理。

用一系列低温保护剂对这些晶体进行低温保护的几次尝试最初都失败了。晶体在含有不同浓度聚乙烯的母液中稳定时变得不稳定并破裂乙二醇或甘油。在含有30%MPD的溶液中短暂浸泡单晶，50 mM（M）pH5.5的磷酸钠和30%的硫酸铵似乎没有受到显著影响，晶体被冻结。然而，与室温图像相比，冷冻过程并没有改变数据的分辨率极限。使用Cu在内部系统上收集数据K（K）α使用FAST面积探测器进行辐射，振荡角为1°，晶体到探测器的距离为120 mm，曝光时间为2分钟。即使在冷冻状态下，晶体也对辐射相当敏感，只能快速收集到3.0º的数据，共有87 375个独立测量，减少到19个433个独特的反射。数据集已完成96%R（右）合并= 8.4%. 所有数据均使用处理MOSFLM公司（莱斯利，1992年【Leslie，A.G.W.（1992）.Jnt CCP4/ESF-EAMCB.新闻.蛋白质结晶器.26，27-33.】)和缩放比例SCALA公司（合作计算项目，第4期，1994年）[合作计算项目，第4期（1994年），《晶体学报》，D50，760-763。]). 表1总结了数据收集和处理统计数据[链接].

表1
数据收集和处理统计汇总

括号中的值表示最高分辨率的数据外壳。
波长（Ω） 1.5418
振荡角（°） 1
分辨率（Ω） 30–3.0 (3.15–3.0)
“空间”组 对4三212
单位-细胞参数（Ω） 一=b条= 182.5,c（c）=99.1
镶嵌度（°） 1.22
测量的反射数 87,375
测得的独特反射数 19,433
R（右）合并(%) 4.8 (12.4)
完整性（%） 96.0 (92.0)
平均我/σ(我) 14.3 (8.1)

3.结果和讨论

突变体的抑制剂复合晶体微小毛霉胃蛋白酶的制备和X射线分析衍射。分析复杂晶体数据的自动索引算法中央对手方清算所4套房（Leslie，1992年【Leslie，A.G.W.（1992）.Jnt CCP4/ESF-EAMCB.新闻.蛋白质结晶器.26，27-33.】)表明晶体具有具有单位-细胞参数的原始四方晶格一=b条= 182.5,c（c）=99.1Ω，单位体积为3.30×106 Å三中数据的处理和缩放香港（HKL）一套程序得出了表1中给出的统计数据[链接]到目前为止，所有从酵母中生长天然Y75N突变酶晶体而不添加抑制剂的尝试都失败了。然而，我们之前复制了野生型的结晶微小毛霉胃蛋白酶（Bunn等。, 1971【Bunn，C.W.，Camerman，N.，Liang，T.Y.，Moews，P.C.&Baumber，M.E.（1971年）。伦敦皇家学会哲学翻译，257，7010-7015。】)并描述了普氏乳杆菌2.0°分辨率下的胃蛋白酶（纽曼等。, 1991【Newman，M.、Safro，M.，Frazao，C.、Khan，G.、Zdanov，A.、Tickle，I.J.、Blundell，T.L.和Andreeva，N.S.（1991），《分子生物学杂志》221195-1301。】). Y75N突变体-抑制剂复合物晶体的成功生长提供了与真菌衍生野生型不同的新的细胞封装接触微小毛霉胃蛋白酶。野生型中没有糖基化的迹象微小毛霉胃蛋白酶。

对相关天冬氨酸蛋白酶如人肾素、小鼠肾素和糖肽（以前称为酵母蛋白酶-A）进行的抑制剂共结晶实验都提供了明确的例子，证明了单位细胞的变化以及抑制剂结合后晶体质量的显著提高（Foundling等。1987年【Foundling，S.I.，Cooper，J.B.，Watson，F.E.，Cleasby，A.，Pearl，L.H.，Sibanda，B.L.，Hemmings，A.，Wood，S.P.，Blundell，T.L.，Valler，M.，Norey，C.G.，Kay，J.，Boger，J，Dunn，B.M.，Leckie，B.J.，Jones，D.M.，Atrash，B.，Hallett，A.&Szelke，M.（1987）。《自然》（伦敦），327，349-353。】; 巴达索等。, 1992【Badasso，M.、Sibanda，B.L.、Cooper，J.B.、Dealwis，C.&Wood，S.P.（1992）。《克里斯特增长杂志》，第122期，第393-399页。】; 交易等。, 1994【Dealwis，C.、Frazao，C.、Badasso，M.O.、Sibanda，B.L.、Tickle，I.J.、Cooper，J.B.、Driessen，H.P.C.、Wood，S.P.&Blundell，T.L.（1994）。分子生物学杂志。236，342-360。】; 阿吉拉尔等。, 1997【Aguilar，C.F.，Cronin，N.B.，Badasso，M.O.，Dreyer，T.，Newman，M.，Cooper，J.B.，Hoover，D.，Wood，S.P.，Johnson，M.S.&Blundell，T.L.（1997），《分子生物学杂志》267，899-915。】). 在内毒素胃蛋白酶中，这些变化通常与构象变化有关，构象变化被定义为涉及残基190–302的刚体运动（Sali等。, 1989[Sali，A.、Veerapandian，B.、Cooper，J.B.、Foundling，S.I.、Hoover，D.J.和Blundell，T.L.（1989）。EMBO J.8，2179-2188。]). 目前尚不清楚这是否与抑制剂诱导的构象变化、晶体堆积或两者的复杂相互作用有关。

在一些酶抑制剂复合物中单位电池观察到，构象变化仅限于活性部位“皮瓣”区域。在原生野生型中小沙鼠胃蛋白酶结构-活性部位不被晶体接触所阻挡，从而解释了乳糖基-前列腺素如何容易扩散到预制晶体中（Jones，1984【Jones，H.（1984），英国伦敦大学博士论文。】). 异常的扰动晶格在这些浸泡实验中观察到，一定是由于与抑制剂结合相关的构象扰动的传递在某种程度上影响了分子间的相互作用。这些变化可能是刚性体型的，也可能是范围较小的“襟翼”调整。天冬氨酸蛋白酶结构中更广泛的刚体变化往往与晶体堆积排列的极端变化有关，这也在一定程度上解释了整个家族结构的整体可变性。刚体界面的性质及其在家族成员中的变化可能定义了主要的构象类型，其中一种可以通过抑制剂结合来稳定，因此可以充分填充以支持晶体生长。

鸣谢

我们感谢BBSRC（英国）对这项工作的支持。我们也感谢D.Hoover博士（美国辉瑞公司）为共结晶研究提供抑制剂。

工具书类

第一次引用Aguilar，C.F.，Cronin，N.B.，Badasso，M.O.，Dreyer，T.，Newman，M.，Cooper，J.B.，Hoover，D.，Wood，S.P.，Johnson，M.S.&Blundell，T.L.（1997）。分子生物学杂志。 267, 899–915. 交叉参考 中国科学院 公共医学 科学网 谷歌学者
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生物学
国际标准编号：2059-7983
第60卷| 第4部分| 2004年4月| 第770-772页
https://doi.org/10.107/S090744904003221