ALFY定位于早期内体和细胞突起，以促进细胞定向迁移

ALFY（也称为WDFY3）是一种进化上保守的大蛋白，通过与自噬成分和磷脂酰肌醇-3-磷酸的相互作用促进蛋白质聚集物的清除[PtdIns（3）P](Simonsen等人，2004年;Lystad等人，2014年;Clausen等人，2010年;Filimonenko等人，2010年;Han等人，2015年;Fox等人，2020). ALFY的耗尽导致泛素阳性聚集体的积累(Filimonenko等人，2010年;Finley等人，2003年)在亨廷顿病小鼠模型中，其杂合子缺失显著加快了发病年龄和发病机制(Fox等人，2020;Dragich等人，2016年). ALFY基因敲除（KO）小鼠出生后数小时死亡，其特征是整个大脑半球间轴突束的丢失和紊乱，这表明ALFY参与大脑皮层神经发生过程中的神经迁移(Dragich等人，2016年;Kadir等人，2016年;Orosco等人，2014年).

细胞迁移涉及细胞极化以形成一个前端和后端，随后肌动蛋白细胞骨架的募集以及在前缘形成细胞突起和焦点粘连（FA）。FA是由多个支架和信号蛋白组成的大型复合物，如整合素、帕西林和管状蛋白，它们将细胞外基质连接到细胞内信号通路，导致肌动蛋白重塑和细胞向前运动所需的牵引(Winograd Katz等人，2014年). 当细胞移动时，FA的动态装配和拆卸对于细胞体的生产位移非常重要(Kenific和Debnath，2016年). 在细胞迁移过程中，整合素（FA的跨膜蛋白）内化到RAB5阳性的早期内体中，在那里它们可以被靶向溶酶体降解或再循环到前沿的质膜，通过RAB11阳性再循环内体（注意哺乳动物有不止一个RAB5、RAB7和RAB11，除非另有规定，这里我们泛指它们），以促进另一轮细胞运动(Maritzen等人，2015年;Shafaq-Zadah等人，2016年;Nader等人，2016年).

在这里，我们报道了ALFY在定向细胞迁移中的新作用。我们表明，ALFY在细胞突起和早期内体中高度富集，并与整合素-α5共定位，调节几种整合素的蛋白质水平和糖基化，这意味着它在细胞定向迁移过程中调节整合素贩运。

ALFY包含几个C末端结构域，包括一个功能未知的PH-BEACH-domain、五个WD重复序列、一个与GABARAP蛋白结合的LC3-相互作用区域（LIR）和一个PtdIns（3）P-结合FYVE-domains(Simonsen等人，2004年;Lystad等人，2014年) (图1A） ●●●●。ALFY的大尺寸（3526个氨基酸，68个外显子）使得克隆和表达全长蛋白变得困难，因此以前的研究是基于用抗ALFY抗体对固定细胞进行免疫染色或表达缺失突变体(Clausen等人，2010年;Simonsen等人，2004年). 我们现在已经分别在HeLa和U2OS T-Rex Flp-in细胞中成功克隆并表达全长ALFY，标记有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）或串联二聚体NeonGreen（tdNG）(图S1A、B).两种细胞系的活细胞成像显示ALFY定位于分布在细胞质中的动态小泡状结构，细胞突起丰富，靠近基底质膜(图1B类；图S1C). 有趣的是，ALFY阳性结构被积极地重新分配到迁移细胞的前进前缘和后退后缘(图1C） ，表明ALFY在细胞迁移过程中的作用。

为了进一步研究野生型（WT）和突变型ALFY蛋白的定位和功能，在HeLa T-Rex Flp-in细胞（HeLa ALFY）中耗尽ALFY^击倒对手)具有两种不同的引导RNA(图S1D)经western blotting证实(图1D类；图S1E)用几种抗ALFY抗体进行免疫沉淀(图S1F). 选择了几个KO克隆进行进一步研究（ALFY^KO1-1公司、ALFY^KO2-6型、ALFY^KO2-9型和ALFY^KO2-11型)以及用于生成可诱导表达EGFP–ALFY WT、LIR或FYVE域突变体的救援细胞系(图1E和4B） 。与EGFP–ALFY、EGFP-ALFY LIR类似^{多用途终端}和FYVE^{多用途终端}局限于细胞内结构和细胞突起(图1F、 G），表明ALFY对突起的定位独立于其与GABARAP蛋白和PtdIn（3）P的结合(Simonsen等人，2004年;Lystad等人，2014年). 同样，在用VPS34抑制剂（VPS34IN1）处理的细胞中，EGFP–ALFY在突起处的定位不受影响(图1F、 G）。相反，缺乏WD40-FYVE结构域（EGFP–ALFYΔWD40-FYVE）或PH-BEACH结构域的ALFY突变体在细胞突起中没有表现出富集(图1F、 G），提示其C末端部分在靶向细胞突起中的作用。

通过不同细胞质标记物的联合免疫染色分析EGFP–ALFY阳性结构的性质。令人惊讶的是，EGFP–ALFY与早期内体标记物EEA1和RAB5广泛共定位(图2A、 B类；电影1)而晚期内体标记RAB7或再循环内体标记LAB11检测到动态的“接吻和奔跑”相互作用(图S1G、H,电影2,三). 我们在活细胞成像过程中注意到，EGFP–ALFY的亚细胞定位对温度高度敏感，因为在室温下用冷PBS洗涤细胞10分钟后，其对细胞突起的定位丢失(图S1I). 考虑到许多细胞内事件，包括内吞和分泌，在低温下受到抑制(Saraste等人，1986年;Tomoda等人，1989年)以及ALFY-FYVE结构域与PtdIns（3）含磷膜的弱结合(Reinhart等人，2021年)，ALFY向早期内体的募集可能依赖于活性。

因为ALFY的LIR和FYVE域对其突起定位都不是必需的(图1F、 G），我们询问这些基序是否是ALFY向早期内体募集所必需的。赫拉·阿尔菲^KO1-1公司表达EGFP–ALFY、EGFP-ALFY LIR的细胞^{多用途终端}或EGFP–ALFY FYVE^{多用途终端}转染了组成性活性GTPase缺陷RAB5突变体（Myc–RAB5^Q79升)产生扩大的早期内体。EGFP–ALFY和EGFP-ALFY LIR^{多用途终端}被有效招募到Myc–RAB5^Q79升囊泡，同时补充EGFP–ALFY FYVE^{多用途终端}大大减少了(图2C） 表明ALFY向早期内体的募集需要其FYVE结构域，但与GABARAP的结合无关。EGFP–ALFY FYVE^{多用途终端}然而，是否局限于小型RAB5阴性结构(图2C类；图S2B)与VPS34IN1处理的细胞中存在EGFP–ALFY阳性结构一致(图1F） 。

如前所述(Simonsen等人，2004年;Lystad等人，2014年)，我们观察到EGFP–ALFY与自噬标记物mScarlet-I–LC3B（LC3B也称为MAP1LC3B）的一些共定位(图2D） 和mCarlet-I–GABARAP(图2E） 而全长ALFY在基础条件下未能与自噬受体mScarlet-I–SQSTM1共定位(图S2A).

为了阐明ALFY的可能内体功能，我们分析了转铁蛋白（Tfn）的循环和Tfn受体（TfR）的降解，以及WT和ALFY中表皮生长因子（EGF）受体（EGFR）和罗丹明EGF的降解^KO1-1公司细胞。而在ALFY中，Tfn再循环和TfR降解不受影响^KO1-1公司单元格(图S2C-E)在ALFY中，EGFR和罗丹明–EGF水平降低^KO1-1公司细胞与野生型细胞相比(图S2F–J)表明ALFY调节EGFR从早期内体到溶酶体的货物分类。

总之，我们发现EGFP–ALFY以PtdIns（3）P依赖的方式定位于早期内体，但它也独立于PtdIns（3）P被募集到细胞质结构。

ALFY定位于迁移细胞的前缘和后缘，以及它在大脑皮层神经发生过程中的神经迁移作用，促使我们研究ALFY在细胞迁移中的作用。28小时的伤口愈合分析显示ALFY^击倒对手细胞显示伤口闭合减少(图3A、 B），但与HeLa相比增殖相似^重量单元格(图S3A)，表示ALFY^击倒对手细胞迁移能力减弱。通过手动跟踪单个细胞，我们发现ALFY^击倒对手细胞迁移速度比HeLa快^重量细胞，但缺乏方向性，因此无法迁移到伤口中(年-方向，FMIy）(图3C、 D类；图S3B). 这让人想起在ALFY KO小鼠中观察到的轴突寻路缺陷，即轴突对趋化性线索没有反应(Dragich等人，2016年).

此外，皮质素的补充，这是一种促进肌动蛋白分支的蛋白质，在细胞迁移过程中补充到细胞的前沿(Ammer and Weed，2008年)，在ALFY中被显著废除^KO1-1公司细胞与HeLa的比较^重量细胞，但通过EGFP–ALFY的表达解救(图3E、 F），表明ALFY在细胞定向迁移过程中促进前缘的形成，与前缘细胞突起的富集相一致(图1C） ALFY的方向性降低^击倒对手单元格(图3C、 D类；图S3B).

由于ALFY定位于细胞突起并调节细胞迁移，我们询问ALFY是否可能调节FA的周转，这对细胞在迁移过程中的粘附和分离非常重要。事实上，ALFY的依附性显著降低^击倒对手细胞与HeLa的比较^重量单元格(图4A） ●●●●。为了确定这是否由FA蛋白的变化引起，我们检测了ALFY中整合素蛋白的表达水平^击倒对手和救援小组。有趣的是，ALFY中整合素-α5、整合素-A V和整合素β1蛋白带的迁移减少^KO2公司克隆，在EGFP–ALFY的重新表达后得到了拯救(图4B） 。此外，在ALFY中检测到整合素-αV和整合素-β3的蛋白水平增加，以及帕罗西汀水平降低^KO1-1公司细胞系(图4B） 。尚不清楚为什么这两个ALFY^击倒对手克隆影响不同的整合素，但由于ALFY是一种具有多个转录物的非常大的蛋白质，我们不能排除两个导向（g）RNA（靶向不同的外显子）导致ALFY的一部分可能具有显性负功能的表达，尽管可用抗体没有观察到截短蛋白(图S1E、F). 然而，在ALFY耗竭时观察到的整合素变化可以通过全长ALFY的表达来挽救，这表明ALFY调节整合素的贩运以及可能的翻译后修饰。为了解决后者，WT和ALFY^击倒对手用PNGaseF酶处理细胞以裂解N-聚糖或小牛肠磷酸酶（CIP）以去除磷酸盐。整合素-α5和整合素-β1在ALFY中的迁移率差异^击倒对手用PNGaseF处理的细胞中细胞完全丢失，而CIP处理没有影响(图4C） ，证明ALFY调节整合素的N-糖基化。整合素-α5和整合素-β1都含有几个潜在的N-连接的糖基化位点，它们的糖基化可以影响异二聚和结合特性、细胞迁移和粘附(Isaji等人，2009年,2006;Marsico等人，2018年;Hang等人，2017年). ALFY如何调节整合素糖基化的机制尚不清楚，但在细胞突起和细胞内结构中与整合素-α5–mScarlet-I共定位(图4D） 以及RAB5A和EEA1(图2A、 B类；电影1)提示它可能调节整合素从质膜的内吞作用及其向再循环室的转运。我们观察到ALFY与再循环内体标记RAB11A和晚期内体标记LAB7A紧密并置和短期共定位(图S1G、H,电影2,三)支持这一假设。RAB11阳性再循环内体中整合素的糖基化(Kitano等人，2021年)和跨高尔基网络或核周再循环隔间，其中整合素在长循环再循环过程中是横向的(De Franceschi等人，2015年)，可以解释ALFY中整合素-α5β1的不同糖基化模式^击倒对手细胞。有趣的是，据报道整合素-α5的N-糖基化可调节EGFR的激活(Hang等人，2015年)这可能解释了ALFY的作用^击倒对手EGFR营业额(图S2F–J).

活细胞成像显示，ALFY在与帕罗西林降解脂肪酸密切相关的高流动性结构中富集，表明它们可以传递或去除脂肪酸成分(图S3C). 已经确定，迁移细胞必须去除细胞后部聚集的黏附物，并在细胞前缘将其重新导入以向前迁移(Bretscher，1989年,1992). 正如我们在细胞前缘和后缘观察到的EGFP–ALFY阳性结构(图1C） 我们推测ALFY参与了早期内体的双向运输(图4E） ●●●●。然而，还需要进一步的实验来确定ALFY介导的贩运的性质及其在整合素糖基化中的作用。

在本研究中，我们首次报道了活细胞中全长ALFY的细胞内定位和动力学。我们发现ALFY定位于细胞突起和早期内体，从那里它似乎调节整合素的正确分类，从而控制细胞的定向迁移和附着(图4E） ●●●●。因此，我们的结果为在缺乏Alfy的小鼠中观察到的缺陷神经元迁移和寻路表型提供了解释(Dragich等人，2016年).

HeLa T-Rex Flp-In细胞系(Tighe等人，2008年)作为礼物从英国曼彻斯特大学的安东尼·蒂奇和斯蒂芬·泰勒以及U2OS T-Rex Flp-In细胞系获得(Malecki等人，2006年)是美国哈佛医学院Stephen C.Blacklow的一份礼物。细胞保存在杜贝科改良的Eagle’s培养基（DMEM；Gibco）中，补充有10%的胎牛血清（FBS）、5 U/ml青霉素和50µg/ml链霉素以及5µg/ml速溶素（Invitrogen）和100μg/ml zeocin（Invitrogen）维持TET阻遏物和Flp-In位点。将在Flp-in位点具有稳定整合基因的细胞系保存在5µg/ml速效杀菌素和100µg/ml潮霉素B（VWR）中，并用1µg/m1多西环素（Clonetech/AH）或四环素（Sigma，T7660）处理17-24 h诱导基因表达。以2µg/ml的浓度使用嘌呤霉素（Sigma）来选择转染CRISPR质粒的细胞。以5µg/ml的浓度使用VPS34IN1（Selleckchem）2 h。以100 nM的浓度使用Bafilomycin A1（BafA1；Enzo，BML-CM110-0100）抑制溶酶体降解。对所有细胞系进行常规污染检测。

以下主要抗体用于免疫荧光和/或免疫印迹：兔抗ALFY（1:1000；Novus Biologicals，NBP1-03332，Bethyl Laboratories，A301-869A，Abcam，ab84888，LSBio，Cat.No LS-C483076和Simonsen等人，2004年)抗EEA1（1:250，BD Biosciences，610457），抗Myc（1:500，Abcam，ab9132），抗rtactin（1:200，Millipore upstate，05-180），抗paxillin（1:1000，Abcan，ab32084），抗β-actin（1:1000；Cell Signaling Technology，#3700），反标志（1:1000、Sigma，F1804），抗GFP（1:1000），克隆泰克，#632381），抗整合素-α4（1:1000，细胞信号技术，8440T），抗整合酶-α5，抗整合素-β5（1:1000，细胞信号技术，3629T），抗EGFR（1:5000，Fitzgerald，20-ES04），抗转铁蛋白受体（1:5000，Zymed，13-6890），抗小鼠IgG（Starbright 700，BioRad，12004158），抗兔IgG（DyLight 800，赛默飞世尔科学公司，SA5-10044），抗绵羊IgG（DyLight 594，赛默飞世尔科学公司，SA510056），抗兔IgG（HRP，Jackson，ImmunoResearch 111-035-144）、抗鼠IgG、抗兔（DyLight 649、Jackson、ImmunoResearch 711-495-152）、抗小鼠IgG和抗山羊IgG。用Hoechst 33342（Invitrogen，H1399）进行DNA染色。

ALFY通过PCR从人类cDNA文库中扩增出四个片段（碱基对1–3028、2256–5425、5123–7570和7355–10581），并克隆到PCR blund II TOPO载体（Invitrogen）中。为了产生LIR和FYVE域突变体，使用QuikChange Lightning Multi-Site-Directed突变试剂盒（Agilent）对含有目标ALFY序列的构建物进行突变。带有或不带有LIR或FYVE突变的ALFY片段通过pENTR1A（Invitrogen）中的Gibson组装连接，生成全长ALFY。通过测序验证得到的全长ALFY插入物。缺乏PH-BEACH或WD40-FYVE结构域的ALFY构建体是通过从全长pENTR-ALFY中进行限制性内切酶克隆而产生的。使用来自pENTR1A-ALFY WT、LIR或FYVE突变体或ΔPH-BEACH-或ΔWD40-FYVE突变的网关重组克隆（Invitrogen）生成pDest-FlpIn-tdNGFlag-ALFY和pDest-FlpIn-EGFP-ALFY。通过将相应的cDNA限制性内切酶亚克隆到pLVX-puro慢病毒主干（Takara Bio）中，生成了用于稳定转染mScarlet-I–RAB5A、mScarlet-I–RAB7A、mScartlet-I-Rab11A、m斯卡勒-I–LC3B、mScaret-I–GABARAP和mScarlet-I–SQSTM1的载体。为了产生表达串联二聚体NeonGreen的Gateway目的地载体（pDestFlpIn-tdNGFlag），合成了编码两个拷贝的NeonGreen的cDNA，其具有3×Flag标签作为连接序列从头开始（ThermoFisher GeneArt基因合成）并将其克隆到pDestFlpInHA载体中，而不是HA标签。pLVX-paxillin-mScarlet-I和pLVX-整合素α5-mScarlet-I由Gibson组装产生。所有结构均通过Sanger测序进行验证。pCMV-VSV-G为Addgene质粒#8454（保藏人Bob Weinberg），psPAX2为Addgene质粒#12260（由Didier Trono存放）。pcDNA3-myc-RAB5-WT和-Q79L质粒是挪威奥斯陆大学医院癌症研究所的Harald Stenmark教授赠送的礼物。

10⁶将HEK-FT细胞置于10 cm培养皿中，次日转染1.6µg pCMV-VSV-g、psPAX2和转移质粒。24小时后更换培养基，在转染后48和72小时收集含慢病毒的培养基并通过Acrodisc 0.45µm Supor膜注射器过滤器过滤。对于细胞感染，10⁵将HeLa或U2OS细胞接种在六孔板的孔中，第二天将细胞培养基与0.5 ml含慢病毒培养基和8µg/ml聚brene（Santa Cruz Biotechnology）的2 ml新鲜培养基交换。感染24小时后，更换含有2µg/ml嘌呤霉素的新鲜培养基。将嘌呤霉素选择的细胞池用于实验。

赫拉霸王龙^重量、ALFY^击倒对手用pOG44 Flp重组酶表达载体（Invitrogen）和pDEST-FlpIN-EGFP-ALFY、LIR联合转染U2OS细胞^{多用途终端}、FYVE^{多用途终端}、ΔPH-BEACH或ΔWD40-FYVE（用于HeLa细胞）或pDest-FlpIN-tdNGFlag-ALFY（用于U2OS细胞），比例为10:1，使用X-tremeGene9 DNA转染试剂（Roche，XTG9-RO）。在转染后24小时，将细胞分成四个10 cm培养皿，并添加含有200µg/ml Hygromycin B（VWR）的培养基，以选择含有稳定整合到基因组中的感兴趣基因的细胞。在选择后2周挑选单个克隆，并通过western blotting和共焦成像检测EGFP–ALFY的表达。mScarlet-I–RAB5A、mScarlet-I–RAB7A、mScaret-I–RAB11A、mScar let-I-LC3B、mScartlet-I—GABARAP、mScarmet-I–SQSTM1和paxillin–mCarlet-I是通过感染慢病毒颗粒产生的，如病毒产生和转导部分所述。Lipofectamine 2000（Invitrogen，11668019）用于瞬时转染。

为了产生ALFY KO细胞系，按照Zhang lab克隆方案制作了CRISPR质粒(Ran等人，2013年). 使用crispr.mit.edu crispr设计工具设计了两个独立的单导向RNA（#1，5′-GATCGGGAGCTTTAGAGG-3′；#2，5′-GCAGAGTGAAGCAGTAG-3′），并从Sigma(图S1D). 将导向物克隆到hSpCas9-2A-Puro V2.0（px459）质粒（Addgene#62988)并根据制造商的协议，使用X-tremeGene9转染试剂（Roche）转染HeLa TRex FlpIN细胞。24小时后，用含有2.0μg/ml嘌呤霉素的选择培养基处理细胞。3天后，通过连续稀释，将耐嘌呤霉素细胞以每孔单细胞密度接种在96 well平板中。测试了几个克隆，并通过蛋白质印迹证实了敲除的克隆。

对于western blot分析，将生长到汇合状态的细胞收集在添加了完整蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche，05056489001）的裂解缓冲液（150 mM NaCl，1%Triton X-100，1 mM EDTA和50 mM Tris-HCl，pH 7.4）中，在冰上放置10分钟。裂解物在15000下离心克在4°C下放置10分钟，使细胞碎片颗粒化。使用BCA蛋白质分析法（Pierce，23225）测量上清液的蛋白质浓度，以确保在SDS-PAGE上加载等量的蛋白质。SDS-PAGE后，使用一级抗体和荧光团或HRP结合的二级抗体进行蛋白质印迹，以便使用Chemidoc™MP成像系统（BioRad）进行检测和分析。在检测之前，将含有HRP结合抗体的膜与Supersignal™West Dura Extended duration底物（Thermo Fisher Scientific，34075）孵育5分钟。

对于EGFR的western blots，在用50 ng/ml EGF（Santa Cruz Biotechnology，sc-4552）处理指定时间点之前，将细胞血清饥饿2 h以诱导EGFR的表达。随后，如上文所述，对细胞进行裂解并制备用于蛋白质印迹。

用于PNGaseF和小牛肠磷酸酶（CIP）治疗，3×10⁵HeLa WT或ALFY KO^2-9细胞在六孔板的孔中进行电镀，第二天在100µl/孔50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、150 mM NaCl、1%Triton X-100中进行裂解。细胞裂解物在12000℃离心分离克用PNGaseF处理5分钟。将9µl细胞裂解液与1µl糖蛋白变性缓冲液（NEB，B1704S）混合，加热至100°C 10分钟，然后在冰上冷却，补充2µl 10×GlycoBuffer2（NEB、B3704S 37°C时为h。对于CIP治疗，向9µl细胞裂解液中添加1.1µl 10×NEBuffer2和1µl CIP（NEB，M0290S），并在37°C下培养1 h。

为了进行免疫沉淀，细胞在含有150 mM NaCl、1%Triton X-100和50 mM Tris-HCl（pH 8.0）的缓冲液中进行溶解，并补充完整的蛋白酶抑制剂混合物（罗氏，05056489001）（500µl/10 cm培养皿）。将裂解产物在4°C下旋转培养30分钟。在16000℃下离心裂解产物克在4℃下培养10分钟，上清液与5µl抗ALFY抗体在4℃旋转培养过夜。通过将20µl蛋白G Dynabeads（Invitrogen，10003D）添加到4°C下旋转的裂解液中1 h来执行免疫沉淀。使用DynaMag磁铁（12321D）收集结合蛋白，并在裂解缓冲液中洗涤三次。在质谱分析或western blot分析之前，用PBS将珠子洗涤两次，并在50µl PBS中重新悬浮。

为了测量Tfn循环，首先将WT和ALFY KO细胞置于冰上10分钟，然后用10µg/ml Alexa Fluor 555结合Tfn（Invitrogen，T35352）处理15分钟。然后用PBS清洗细胞，并在37°C的细胞培养条件下追逐指定的时间段。追逐后，将细胞胰酶化，用4%多聚甲醛（PFA）固定，并在500℃离心3分钟克使细胞颗粒化。细胞在PBS中清洗，然后通过连接在5 ml试管上的细胞过滤帽将其分离成单个细胞（falcon，352235）。使用Acea Biosciences的NovoCyte流式细胞仪通过流式细胞术分析细胞。

在玻璃底部的八个培养箱中生长的细胞在37°C下用50 ng/ml罗丹明–EGF（Invitrogen，E348）处理15分钟，然后用4%PFA（Polysciences，18814-10）在冰上固定15分钟，再进行60、30或0分钟的追踪。将1×PBS添加到每个孔中，并使用Andor Dragonfly 505旋转圆盘共聚焦显微镜使用NIKON Apo TIRF 60×/1.49 NA浸油物镜获取罗丹明–EGF的图像。通过获取一系列轴向距离为0.3µm的z堆叠，对整个细胞体积进行成像。对于罗丹明-EGF的图像分析，z（z）-用叠加最大强度投影法分割细胞中的罗丹明–EGF囊泡。使用CellProfiler定量罗丹明–EGF阳性囊泡的平均计数和大小（面积）（v.4.1.3）(Carpenter等人，2006年).

细胞生长在玻璃盖片上或玻璃底部的8孔室中，并按照所述进行处理，然后在室温下在4%多聚甲醛（PFA；Polysciences，18814-10）中固定15分钟。PFA在0.05M NH中淬火₄氯化10分钟，然后用0.05%皂苷在PBS中渗透5分钟。通过将固定细胞与指定的初级和相应的次级抗体孵育在含有0.05%皂苷的PBS中进行免疫染色。随后，用稀释在PBS中的1g/ml Hoechst 33342对细胞进行染色10分钟。将盖玻片安装在长效钻石防垢贴片（Invitrogen，p36965）中。使用带有63倍物镜的蔡司LSM 710共焦显微镜对细胞进行分析。

使用ImageJ（斐济）生成彩色化直方图，方法是在感兴趣的结构中画一条线，并使用曲线图函数获得每个像素的灰度值（强度）。为了生成图形，绘制了两个重叠通道的强度。

在装有Okolab细胞培养箱的Andor Dragonfly 505高速共焦平台上，在FluoreBrite DMEM培养基（Gibco）中对八孔Lab-Tek II室盖玻璃中生长的细胞进行实时成像，该培养基配备有温度、CO₂和湿度控制，使用NIKON Apo TIRF 60×/1.49 NA油浸物镜。旋转圆盘共焦模式用于所有图形，除了图1B、 右侧面板，其中使用了穿透深度为100 nm的TIRF模式。

细胞接种在96周的ImageLock™板中（Essen Bioscience）。当细胞成为融合的单层时，使用创伤制造工具（Essen Bioscience）进行创伤。为了清除细胞碎片，更换培养基，然后将培养板置于培养箱中^®S3用于成像的活细胞显微镜（Sartorius）。每10分钟拍摄一张图像，持续28小时，以监测细胞向伤口的迁移。使用孵化器量化相对伤口密度^®软件S3（Sartorius），测量每个时间点伤口区域内的空间细胞密度相对于伤口区域外的空间细胞浓度。使用三个独立实验的三个重复孔的平均值，将数据表示为平均相对伤口密度。

使用ImageJ软件和Manual tracking插件以及Chemotaxis and Migration工具（ibidi GmbH）对伤口愈合分析中的细胞进行手动跟踪。通过将欧氏距离除以由ibidi趋化和迁移工具获得的累积距离，计算细胞的持久性。

为了使用免疫荧光对细胞进行定向分析，细胞生长在具有500µm细胞自由间隙（ibidi）的双孔硅树脂插入物中汇合。取下插入物，将细胞在新鲜培养基中培养4-5小时，然后按照上述方法固定并与皮质素染色，以标记前缘。为了通过共焦成像进行分析，从三个独立的实验中采集了5-10张图像。为了进行量化，手动计数前缘为皮质素阳性的细胞，并将其与每个视野中的细胞总数进行比较，同时对每个条件下的60-100个细胞进行计数。

根据制造商的说明，使用细胞增殖和细胞毒性试剂盒（Boster，AR1156），使用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）分析法测量细胞增殖。细胞以不同细胞密度分三次接种在96周的平板中。播种后24小时，将MTT添加到培养基中，并静置4小时，以便活的增殖细胞形成紫色的不溶性甲霜结晶。将晶体溶解过夜，并通过测量560 nm处的光密度来测定所得有色溶液的浓度。

将不同的细胞系进行胰蛋白酶化，并用CellMask™深红色质膜染色剂（Invitrogen，C10046）染色，然后接种到96周的平板中（每个细胞系重复六次）。培养细胞30分钟，使细胞附着在井底，然后在PBS中进行三次清洗，以去除未附着的细胞。使用700激光使用Odyssey CLx成像仪扫描96周板，并使用Image Studio™软件量化每个孔的总强度，作为剩余细胞的测量值。

使用GraphPad Prism 8.0.1和P（P）-值来自于双尾t吨-未配对样本的测试，在P（P）≤0.05（详见图例）。

我们感谢Farhan实验室和Blomhoff实验室（奥斯陆大学基础医学科学研究所）分别在Incucyte和流式细胞术分析的初始设置方面提供的帮助。

同行评审历史记录可在以下网站上获取：https://journals.biologists.com/jcs/article-lookup/doi/10.1242/jcs.259138.