神经毛蛋白-1调节脑微血管内皮细胞中γ-干扰素刺激的信号

血脑屏障（BBB）功能障碍是许多中枢神经系统（CNS）炎症性疾病的早期特征，包括多发性硬化症，与负面临床结果相关(Minagar和Alexander，2003年;齐瓦迪诺夫和利斯特，2005年). 作为血脑屏障的重要组成部分，内皮细胞表达趋化因子和粘附分子，促进循环白细胞渗入中枢神经系统实质，从而显著增加血脑屏障通透性、炎症脱髓鞘、代谢失衡和其他后果，加剧神经炎症疾病的进展(Brück等人，1997年;Larochelle等人，2011年). 外周血单个核细胞和血清中炎症介质水平的增加，如干扰素-γ（IFNγ），以及浸润白细胞和活化的常驻CNS细胞，包括星形胶质细胞和小胶质细胞，已被证明会导致内皮功能障碍(Eng等人，1996年;Larochelle等人，2011年;鲁比奥和卡帕，1993年;瑟伦森等人，1999年a). 尽管内皮细胞在维持血脑屏障完整性方面具有重要作用，但在神经炎症疾病的发病机制中，介导内皮细胞炎症反应的分子机制尚不清楚。

多发性硬化症是发达国家年轻人非创伤性残疾的最常见原因(古丁，2014年). 多发性硬化是一种慢性神经炎症性疾病，其病理特征是中枢神经系统中髓鞘特异性T细胞、B细胞和抗体介导的脱髓鞘、可变炎症、轴突损伤和胶质增生(Gerhard等人，1985年;Ryberg，1978年;Traugott等人，1979年). 复发-缓解型多发性硬化症是多发性硬皮病最常见的临床表现，其特征是急性或亚急性发作的临床功能障碍，随后症状缓解，继发继发进行性疾病。复发被认为是急性局灶性炎性脱髓鞘的临床表现(Giesser，2011年;Lucchinetti等人，2000年). 限制多发性硬化症复发严重程度的治疗方法有限(韦纳，2009)目前临床上对急性多发性硬化症的抗炎治疗，如干扰素-β，仅在某些情况下有效，而其他治疗，如那他珠单抗，具有更强的抗炎作用，但与致命的进行性多灶性白质脑病风险增加有关(林德等人，2009年). 因此，迫切需要了解急性多发性硬化的病理生理学，并确定新的治疗靶点。

Neuropilin-1（NRP1）是一种单通道跨膜蛋白，其作为信号3A受体在发育过程中引导轴突生长以及作为血管内皮生长因子a（VEGF-a）受体在内皮细胞中诱导血管生成方面的作用已被广泛研究(Chen等人，1997年;Kolodkin等人，1997年). NRP1缺陷小鼠的胚胎致死性、颅神经生长紊乱和胚胎中枢神经系统血管化严重受损，突显了NRP1在中枢神经系统发育中的重要作用(Gu等人，2003a;川崎等人，1999年;Kitsukawa等人，1997年). 进一步的研究支持其在脑神经嵴细胞的分化、发育和交感神经系统的模式形成中的作用(川崎等人，2002年;施瓦兹等人，2009年，2008). 虽然NRP1在发育中神经元的特定亚群中高度表达(藤泽等人，1989年;Takagi等人，1991年，1987)，由于NRP1的表达在神经元回路建立后很快就会丢失，因此在正常的CNS中表达水平相对较低(Fujisawa等人，1995年;Kawakami等人，1996年;Takagi等人，1995年). 有证据表明，NRP1蛋白水平在神经元缺血和机械损伤的动物模型中诱导，表明NRP1可能参与神经疾病的发病机制(Skold等人，2000年;Zhang等人，2001年). 最近的研究表明，用ATWLPPR肽抑制NRP1在CD8+-T细胞诱导的BBB破坏小鼠模型中产生有益的效果(隋丹等，2012). 虽然在小鼠多发性硬化模型中研究了NRP1在免疫细胞中的作用(Solomon等人，2011年)，内皮细胞特异性NRP1在神经炎症性疾病，特别是内皮细胞炎症反应的发病机制中的重要性尚不清楚。

在本研究中，我们首次报道了NRP1的敲低以Rac1–STAT1依赖性方式抑制IFNγ诱导的人脑微血管内皮细胞（HBMVEC）中趋化因子的表达，包括CXCL10的表达。内皮细胞特异性NRP1在炎症细胞浸润、血脑屏障破坏和神经元脱髓鞘中的重要性在使用VECad-Cre-ERT2/NRP1的小鼠神经炎症疾病模型中得到了证实^{flox/flox公司}（VECad/NRP1^−/−)老鼠。此外，在人类活动性多发性硬化病变的微血管内皮细胞中观察到NRP1水平升高，表明内皮NRP1参与人类神经炎症疾病的发病机制。我们的结果首次证实，NRP1介导神经炎症疾病中大脑内皮细胞的促炎症作用。

首先，为了检测NRP1对BBB内皮细胞炎症反应的影响，对人脑微血管内皮细胞（HBMVEC）进行培养并用IFNγ刺激，IFNγ是神经炎症性疾病中升高的促炎细胞因子之一(Hohnoki等人，1998年;Minagar和Alexander，2003年). 我们的结果表明，NRP1的敲低显著减弱了干扰素γ诱导的HBMVEC中的趋化因子，包括CXCL10和CXCL11(图1A；图S1A、B). 在人皮肤微血管内皮细胞（HMVEC）中也观察到抗NRP1的siRNA（NRP1-siRNA）对CXCL10水平的抑制作用(图S1C). 值得注意的是，NRP1的敲除也显著减弱了肿瘤坏死因子α（TNFα）在HBMVEC中诱导的CXCL10(图S1D–F). 此外，NRP1的敲除抑制了IFNγ刺激的HBMVEC中STAT1和STAT3的磷酸化(图1B类；图S2A). 针对NRP1的不同siRNA（siRNA_8#）对HBMVEC中CXCL10的表达和STAT1的激活具有相同的抑制作用(图S1G–I和S2B型). 这些结果支持NRP1特异性控制HBMVEC中IFNγ和TNFα刺激的炎症反应。

为了进一步研究NRP1如何调节STAT1的激活，对Rac1的活性进行了检测，因为有报道称Rac1可以调节最大的STAT1激活(Park等人，2004年). 如所示图1C和图S2C，NRP1的敲除减弱了IFNγ诱导的HBMVEC中Rac1的激活。此外，Rac1抑制剂NSC 23766显著抑制IFNγ诱导的HBMVEC中CXCL10的表达，表明Rac1在IFNγ诱发的促炎效应中起着重要作用(图1D） ●●●●。为了进一步明确Rac1在NRP1-siRNA-介导的STAT1磷酸化抑制中的作用，Rac1的一种组成性激活形式Rac1 61L在对照组和NRP1-敲低HBMVEC中过度表达。如所示图1E、 在控制HBMVEC（LacZ过度表达细胞）中，NRP1的敲低显著抑制IFNγ刺激的STAT1磷酸化；然而，在Rac1-61L过度表达的HBMVEC中，这种对STAT1磷酸化的抑制作用减弱。对照组和NRP1敲低的HBMVEC中Rac1 61L的表达水平相似(图S2D). 综上所述，这些结果表明NRP1以Rac1依赖的方式控制HBMVEC中IFNγ诱导的CXCL10表达和STAT1激活。

内皮细胞特异性他莫昔芬诱导NRP1基因敲除小鼠，命名为VECad/NRP1^−/−在血管内皮钙粘蛋白（VECad）启动子与NRP1的调控下，将表达他莫昔芬诱导的Cre重组酶（Cre-ERT2）的小鼠系杂交产生^{flox/flox公司}老鼠。与TEK受体酪氨酸激酶（Tie2）/NRP1不同^−/−小鼠，通过将Tie2-Cre小鼠与NRP1杂交产生^{flox/flox公司}小鼠和表现出胚胎致死性(Gu等人，2003a)、VECad/NRP1^−/−服用三苯氧胺后，小鼠表现出正常的生存能力。我们还将VECad-Cre-ERT2小鼠与ROSA26R报告小鼠杂交，以检查三苯氧胺给药后Cre活性的特异性和效率。如所示图S3A服用三苯氧胺可诱导成人组织（包括大脑和脊髓）内皮细胞的有效重组。

为了研究内皮NRP1在神经炎症疾病中的作用，在VECad/NRP1中建立了实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型^−/−老鼠。因为之前的研究已经表明三苯氧胺在小鼠EAE模型中的潜在作用(Elloso等人，2005年)，两个VECad-Core⁻/尼泊尔卢比1^{flox/flox公司}（VECad/NRP1^+/+)指定为野生型（WT）组的小鼠和VECad/NRP1^−/−给小鼠（敲除组）注射三苯氧胺，然后用髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白肽片段35-55（MOG_35–55)10点诱发EAE 周龄。我们首先检测了服用MOG后脊髓中STAT1的激活和CXCL10的表达_35–55。如所示图2A和图S3B在WT小鼠脊髓中观察到STAT1和STAT3磷酸化增加，但VECad/NRP1未观察到^−/−诱导EAE后的小鼠。巧合的是，CXCL10在正常脊髓中的表达极低；然而，在EAE诱导后，其在脊髓，包括脊髓内皮细胞中的表达被诱导(图S3C)表明内皮细胞衍生的趋化因子有助于炎症细胞浸润和EAE疾病进展。MOG后还观察到脊髓中NRP1的诱导_35–55管理(图2B） ●●●●。EAE诱导后，内皮NRP1的缺失导致脊髓内皮细胞CXCL10的表达受到抑制(图2C类；图S3D). 这些结果表明，服用MOG后，内皮细胞NRP1的缺失抑制了脊髓中STAT1–CXCL10通路_35–55.

然后进行流式细胞术分析脊髓中的免疫细胞浸润13 EAE诱导后第天，小鼠出现疾病进展迹象。与同时接受治疗的年龄匹配的同卵双胞胎对照组相比，VECad/NRP1^−/−在CD45+脊髓滤过性白细胞（SCIL）中，小鼠的NK1.1+CD3+自然杀伤T（NKT）或NKT样细胞数量显著减少；图2D） ●●●●。出乎意料的是，在这个时间点，我们观察到脊髓浸润中CD4+CD8−、CD4+CD8+或CD4−CD8+T细胞的百分比没有差异(图S3E). 进一步评估脊髓组织的炎症反应17 服用MOG后天_35–55当小鼠达到疾病呈现的高峰时。中的结果图2E、 在WT小鼠中，F表现出炎症细胞的广泛浸润并伴有局部组织破坏，而在VECad/NRP1的脊髓中观察到炎症细胞的有限浸润^−/−老鼠。在WT小鼠中观察到局灶性脱髓鞘，表现为髓鞘染色缺失区域（蓝色），但在VECad/NRP1中减弱^−/−老鼠。通过对脑实质脱髓鞘和脑膜炎性细胞浸润的评分进一步证实了这一结果(图2G；图S3F). 脊髓T细胞标记物的半定量实时（q）PCR分析表明，VECad/NRP1脊髓中T细胞，尤其是CD8+T细胞的蓄积减少^−/−小鼠17 EAE诱导后天数(图2H） ●●●●。

为了评估血脑屏障的完整性，在两个VECad/NRP1中检测了在正常条件下无法在血脑屏障中迁移的FITC-标记白蛋白的积累^−/−小鼠和Tie2/NRP1^+/−EAE诱导后的小鼠。如所示图3A、 WT小鼠脊髓的代表性图像显示白蛋白扩散分布，而VECad/NRP1脊髓^−/−小白鼠的血管系统中白蛋白的积累较为有限。WT小鼠的脊髓出现紧密连接结构破坏（闭塞素染色），伴有FITC-标记白蛋白的血管周围渗漏；然而，在VECad/NRP1中^−/−小鼠，紧密连接结构得到了更好的保存，并且伴随着更少的FITC-白蛋白泄漏(图3B） ●●●●。使用钆增强T1加权分子共振成像（MRI）在轴向和冠状面MRI图像中也可以观察到WT小鼠小脑中存在BBB泄漏(图S4). 此外，Tie2/NRP1^+/−小鼠（内皮细胞NRP1杂合缺失）在EAE诱导后也表现出BBB完整性的保持，这表现为FITC-标记的白蛋白的少量积累(图3C） ，总荧光强度降低(图3D） 减少紧密连接结构的破坏(图3E） 在脊髓中。这些结果表明，内皮NRP1的缺失导致EAE中炎症细胞浸润的调节和BBB完整性的维持。

为了确定NRP1在EAE诱导后疾病进展中的作用，监测小鼠的临床评分和体重。如所示图4A–C，EAE诱导导致对照组小鼠出现进展性疾病，其特征是体重减轻和上升性瘫痪（尾巴无力，后肢无力，最后完全后肢瘫痪）。然而，VECad/NRP1^−/−小鼠的发病率较低(图4C） （风险比率=0.67，P（P）=0.007（通过Fisher精确测试），保持体重(图4B）(P（P）双向方差分析<0.001），延迟疾病发作和临床评分降低(P（P）WT和淘汰赛之间的双向方差分析<0.001）(图4A） ●●●●。

此外，使用T2加权MRI扫描评估大脑中的病变14 EAE入职后第天。如所示图4D、 在WT小鼠小脑中观察到与炎症、脱髓鞘和轴突丢失相对应的高强度区域，但在VECad/NRP1中没有^−/−老鼠。

为了进一步证实NRP1在人类神经炎性疾病中的作用，在正常和多发性硬化影响的CNS组织中进行免疫组化，以确定NRP1的表达模式。首次在人类正常扁桃体组织中对NRP1染色方案进行优化，以确认NRP1抗体的特异性（Sigma，目录号HPA030278）(图5A） ●●●●。正常人脑和脊髓在幕下区的胶质细胞中NRP1染色有限(图5B） ●●●●。正常CNS内皮细胞中未检测到明显的NRP1免疫反应(图5C） ●●●●。然而，在多发性硬化症早期活动性脱髓鞘病变中，巨噬细胞大量浸润（使用泛巨噬细胞标记物KIM1P鉴定；图5D、 F），存在破坏性脱髓鞘损伤，其特征是髓磷脂染色缺失(图5E） 巨噬细胞吞噬髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(图5G） –NRP1免疫反应性在微血管内皮细胞和活性星形胶质细胞中均增加，如膜细胞质染色所示(图5H） ●●●●。这些结果支持内皮NRP1在人类多发性硬化的发病机制中发挥作用。

在本研究中，我们通过从人类多发性硬化病变、小鼠EAE模型和培养的人类大脑内皮细胞获得证据，确定NRP1在神经炎性疾病中作为BBB内皮细胞炎症反应的先前未知介质发挥作用。我们的研究结果表明，NRP1的缺失抑制了HBMVEC中促炎细胞因子IFNγ和TNFα的作用。此外，我们的研究结果揭示了内皮NRP1缺失在小鼠EAE模型中的有益作用，以及内皮NRP1在人类急性多发性硬化病变中的诱导作用。总之，我们的结果表明靶向内皮NRP1信号可能是抑制炎症反应和维持BBB功能的潜在途径，这可能有助于减少神经炎症疾病的进展。

多发性硬化患者的中枢神经系统实质和血清中炎性细胞因子升高，并与疾病进展相关(Larochelle等人，2011年). 我们的结果首次显示了NRP1在脑内皮细胞中的促炎症作用，这可以通过给药后内皮细胞-NRP1缺失小鼠中趋化因子表达减弱和淋巴细胞浸润调节来证明_35–55NRP1在人类免疫系统中的作用已被广泛报道(库马诺戈和基库塔尼，2013年); 然而，NRP1在内皮细胞促炎细胞因子刺激效应中的作用和机制尚不清楚。NRP1是浆细胞样树突状细胞的特异性标记物(Dzionek等人，2000年)，并介导树突细胞刺激的T细胞活化(Tordjman等人，2002年)和单核吞噬细胞募集(Dejda等人，2014年). NRP1中和抗体减弱病毒诱导的浆细胞样树突状细胞产生IFN-α(Grage-Griebenow等人，2007年). 我们的研究结果首次表明，NRP1通过Rac1–STAT1依赖性途径介导IFNγ刺激的脑内皮细胞趋化因子的表达。此外，我们已经确定Rac1作为NRP1的下游介体激活HBMVEC中的STAT1，这与之前的报告一致，即NRP1过度表达会增强肝星状细胞中Rac1的激活(曹等人，2010). 然而，我们目前的结果并不排除NRP1依赖性Rac1激活参与IFNγ刺激的炎症反应的可能性。

T细胞对髓磷脂抗原的反应被认为是多发性硬化脱髓鞘的最大原因之一(Fife等人，2001年). 以前的研究表明，NRP1在某些T调节（T-reg）细胞亚群中表达，并与信号蛋白4a相互作用，以维持这些细胞的稳定性和免疫抑制功能(Lalor和Segal，2013年;Stiles等人，2009年). 此外，在小鼠EAE模型中，CD4+T细胞中NRP1的缺失导致优先的T辅助因子（Th）-17谱系承诺、T调节细胞功能降低和疾病严重性增强。相反，接受过表达NRP1的CD4+T细胞的小鼠通过包括TGFβ(Argaw等人，2012年). 我们的研究证实，NRP1作为一种中枢介质，参与内皮细胞中VEGF-a、IFNγ等的信号传导，促进小鼠EAE模型中淋巴细胞浸润和疾病进展。这些研究表明，NRP1信号在与神经炎症疾病相关的不同细胞类型中可能具有不同的作用。

我们的研究表明，内皮细胞中NRP1的选择性缺失可减弱EAE，并改变内皮细胞对IFNγ刺激的CXCL10生成。最初报道CXCL10在急性脱髓鞘事件期间在人脑脊液（CSF）中升高，并伴有其受体C-X-C基序受体3在活动性多发性硬化病变血管周围浸润性炎症细胞中的表达(Sörensen等人，1999年b). 后来的一项研究报告称，内皮细胞是典型吉兰-巴雷综合征（急性炎症性脱髓鞘性多神经根神经病）患者腓肠神经活检中CXCL10的主要来源(Kieseier等人，2002年). 在这项研究中，我们观察到NRP1的敲低减弱了HBMVEC中CXCL10的表达，并有助于EAE诱导后CXCL10表达的抑制和小鼠脊髓的炎症反应(图2). 因为HBMVEC很难转染，所以我们仅达到～30%编号1击倒(图S1B、F、I). 即使有这种水平的敲除，IFNγ刺激的CXCL10表达也被证明减少了30–50%(图1A；图S1A、D、G)表明NRP1是CXCL10表达的重要调节因子。然而，我们目前的结果并不排除涉及CXCL10的NRP1依赖性调节的可能性。值得注意的是，在EAE诱导后的WT小鼠和内皮细胞NRP1被敲除的小鼠中，我们还观察到炎症细胞中CXCL10的阳性染色(图2C） 表明非内皮细胞衍生CXCL10也参与神经炎症疾病的进展。我们的研究与先前的研究一致，这些研究表明，抗CXCL10抗体治疗可以降低临床和组织学疾病的严重程度，并防止活化的CD4+T细胞向髓磷脂蛋白（PLP）EAE模型中的CNS实质募集(Fife等人，2001年). 同样，尽管我们在13岁时没有测量CD4+或CD8+T细胞负荷的差异 诱导后第天，我们确实观察到17岁时脊髓中的T细胞标记物显著减少 诱导后第天，与CXCL10在CNS中保留T细胞的作用一致(Lalor和Segal，2013年;Stiles等人，2009年). 此外，我们的发现反映了在MOG诱导的CXCL10星形胶质细胞特异性缺失小鼠EAE期间观察到的临床严重程度降低(Mills-Ko等人，2014年). 事实上，CXCL10在脊髓血管周围间隙CD4+T细胞积聚中的明显作用，但在T细胞向这些空间的募集中没有明显作用，加上观察到CXCR3控制T细胞的实质分布(Muller等人，2007年)，表明在13 诱导后的第天可能被困在血管周围间隙而不是薄壁组织中，从而限制了组织损伤和脱髓鞘。在这方面，值得注意的是，我们观察到NK1.1+CD3+NKT或NKT样细胞在13 入职后天数。鉴于该细胞群产生IFNγ，脊髓NKT细胞数量的早期减少可能会减弱保持致病性T细胞的持续内皮反应，从而降低整体疾病严重程度。未来，确定这些NKT细胞的T细胞受体限制可能是合理的，以确定它们是发病的直接原因还是免疫调节。仔细评估在病程早期时间点效应T细胞和调节T细胞的相对血管周和实质分布，并确定CXCL10是否是介导NRP1缺乏对内皮细胞影响的关键趋化因子，也是有用的。此外，C-X-C趋化因子的诱导，如CXCL10，可能直接导致EAE中的BBB内皮细胞功能障碍，这在一些研究中被报道抑制增殖并诱导内皮细胞凋亡(Luster等人，1995年;Wilson等人，2013年). 总之，我们当前的研究结果支持了中枢神经系统内皮细胞中NRP1依赖性信号的新作用，该作用可能与CXCL10介导的淋巴细胞运输、血管周滞留和实质浸润的控制有关。

先前的研究表明，NRP1是VEGF-a的共同受体，并且是VEGF-a诱导内皮细胞通透性所必需的(Becker等人，2005年;Soker等人，1998年). VEGF-A在神经元中的表达增加(Suidan等人，2010年)和星形胶质细胞(Argaw等人，2012年)先前已经在不同的小鼠神经炎症性疾病模型中报道过，重要的是，给药一种肽，它选择性地抑制VEGF-a与NRP1的结合(Starzec等人，2007年)，在CD8+-T细胞引发的血脑屏障破坏的小鼠模型中显示出治疗效果(隋丹等，2012). 与这些研究一致，我们的结果表明，内皮细胞NRP1的缺失可以减少FITC白蛋白从CNS实质的泄漏，并保持紧密连接结构。此外，浸润的炎性细胞，尤其是CD8+淋巴细胞，可以刺激驻留的CNS细胞，包括星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元，释放因子以增加BBB的通透性；此外，这些细胞分泌多种细胞因子，如TNFα、活性氧和基质金属蛋白酶，直接作用于BBB内皮细胞，破坏BBB完整性(Larochelle等人，2011年). 我们还观察到VECad/NRP1中淋巴细胞浸润较少^−/−我们的结果表明，在VECad/NRP1的中枢神经系统中，BBB通透性介质的表达和积累也可能减少^−/−EAE诱导后的小鼠。

本研究的另一个重要贡献是，我们确定了NRP1在人类早期多发性硬化病变和正常CNS中的表达模式。我们的结果表明，正常CNS中NRP1的基础水平相对较低，但它是在早期多发性硬化病变中诱导的，其病理特征是存在活跃的脱髓鞘、皮质和脑膜炎症(Lucchinetti等人，2011年). 有趣的是，在早期多发性硬化病变的活动星形胶质细胞中也观察到NRP1的诱导表达，其在免疫反应和神经元脱髓鞘中起双重作用(Nair等人，2008年). 最近的一项研究也报道了NRP1在人类多发性硬化病变的小胶质细胞和巨噬细胞中表达(Costa等人，2015年)表明NRP1参与神经炎症疾病中星形胶质细胞、小胶质细胞和巨噬细胞的活化。

综上所述，我们的研究结果确定了NRP1在脑内皮细胞中的双重促炎作用，并提供了证据表明，在小鼠中内皮NRP1的缺失维持了BBB功能，并减轻了EAE诱导后的疾病进展。此外，人类多发性硬化症样本的染色显示NRP1表达与人类早期多发性动脉粥样硬化病变的临床相关性。我们的研究结果增加了NRP1在神经炎症性疾病期间作为BBB内皮功能障碍的中心介质的可能性，并可能成为潜在的治疗靶点。

三苯氧胺诱导的内皮细胞特异性NRP1基因敲除小鼠是通过培育VECad-Cre-ERT2（C57BL/6背景；德国慕尼黑蒙斯特大学Ralf H.Adams赠送的礼物）产生的(Sörensen等人，2009年)带NRP1^{flox/flox公司}小鼠（C57BL/6背景；来自马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学亚历克斯·L·科洛金教授的礼物）(顾等人，2003b). 将VECad-Cre-ERT2小鼠与ROSA 26R小鼠（C57BL/6背景）杂交，生成VECad-ROSA小鼠。为了诱导内皮细胞NRP1的缺失，将他莫昔芬（西格玛化学品）溶解在玉米油（15 毫克 毫升⁻¹)并通过灌胃给4周龄小鼠（100 µl）连续五天，在梅奥诊所的动物设施进行。进行口服灌胃的研究人员对小鼠的基因型一无所知。Tie2-Cre小鼠（C57BL/6背景）与NRP1杂交^{flox/flox公司}小鼠产生Tie2/NRP1^+/−老鼠。动物样本量是根据机构动物护理和使用委员会（IACUC）的限制和EAE实验的以往经验确定的。没有一只小鼠被排除在本研究之外。根据预先确定的动物类型，将动物分配到实验组，不使用随机分组。根据梅奥诊所IACUC批准的方案进行动物护理和实验程序。

对来自正常CNS对照组和经临床和病理诊断为患有多发性硬化症的尸检个体的存档福尔马林固定石蜡包埋CNS组织进行人体组织的神经病理学研究。该手术获得了所有受试者的书面或口头同意。这项研究得到了明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所机构审查委员会的批准。苏木精和伊红、鲁索尔-法斯特-蓝和周期酸-希夫染色以及贝尔肖夫斯基银浸渍法用于染色5µm厚的切片，以进行常规病理学评估。采用亲和素-生物素技术，利用抗MOG（1:1000，Abcam，cat no.ab109746）、KIM1P（1:5000；德国哥廷根大学Wolfgang Brück博士赠送）和NRP1（1:200，Sigma，HPA030278）的一级抗体进行免疫组化。如前所述，脱髓鞘活动被描述为活动性脱髓鞘、非活动性脱髓、再髓鞘和斑块周围白质和/或灰质(Popescu和Lucchinetti，2012年).

这些小鼠被安置在梅奥诊所的一个传统设施中，以12-h的光照和12-h的暗循环进行饲养随意获得食物和水。所有行为实验均在白天进行。进行EAE诱导、行为评分和体重测量的研究人员对小鼠的基因型一无所知。为了诱导疾病，用100只10至12周龄雄性小鼠在两侧皮下接种 毫克MOG_35-55在完全弗氏佐剂中乳化的肽，含有结核分枝杆菌H37Ra（400 mg/小鼠）。百日咳毒素（Sigma Chemicals；200 ng），然后在免疫后第0天和第2天腹膜内注射。通过根据标准EAE分级系统测量疾病严重程度，以盲法每日监测临床疾病：0，正常；1、尾音丢失；2、后肢无力；3、后肢麻痹；4、后肢麻痹和前肢麻痹或无力；5、垂死或死亡。

EAE诱导后处死的小鼠灌流PBS，然后灌流4%多聚甲醛。使用标准方法将脊髓切割成10至12个横向板，并嵌入石蜡(1996年海啸和Fujinami). 切片用苏木精、曙红、鲁索尔-法斯特-蓝色和周期酸-希夫染色。

如前所述，对脊髓中的炎症细胞浸润和脱髓鞘进行半定量(Miller等人，1997年). 以盲法评估脑膜炎和实质脱髓鞘。进行半定量分析的研究人员对群体信息一无所知。简单地说，对同一只小鼠每个横切面的每个象限进行检查，以确定是否存在病理异常。最高分数为100表示脊髓切片的所有四个象限都存在病理异常。得分为0表示没有象限显示异常。

为了检测EAE诱导后的BBB渗透性，将FITC–白蛋白（Sigma Chemicals）溶解在PBS（10 毫克 毫升⁻¹)并在处死前2小时通过100微升尾静脉注射给小鼠。然后收集脊髓和血清。将一半的脊髓在RIPA缓冲液中匀浆并离心，收集上清液。荧光强度为100 测量µl裂解物，将其标准化为血清的荧光强度，并表示为对照组的相对倍数。另一半脊髓在最佳切割温度（OCT）复合包埋介质中快速冷冻，并用抗闭塞素抗体（1:100；N个-圣克鲁斯生物技术）。用DAPI对细胞核进行复染。

使用RNeasy Mini Kit（德国希尔登Qiagen）从细胞和组织中分离出总mRNA，并使用iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad）通过寡核苷酸（dT）启动进行反转录。qPCR分析使用ABI 7500实时PCR系统（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统）和SYBR Green PCR Master Mix（英国沃灵顿应用生物系统公司）进行。将结果归一化为18S核糖体RNA（小鼠）或β-肌动蛋白基因（人类）。引物序列如所示表S1.

主要HBMVEC从Cell System（华盛顿州柯克兰）购买，并使用带有血清和CultureBoost的完整经典培养基试剂盒（Cell Systems，4Z0-500）进行培养。HMVEC（购自Lonza（Allendale，NJ），并在EBM-2培养基中与EGM-2 MV Bulletkit（Lonza）一起培养。没有使用错误识别细胞系数据库中列出的细胞系（由国际细胞系认证委员会维护）。通过检测von Williebrand因子VIII的表达和乙酰化低密度脂蛋白的细胞质摄取，验证HBMVEC和HMVEC。所有细胞支原体均为阴性。对于siRNA介导的NRP1敲除，NRP1 siRNA（Hs_NRP1_7 FlexiTube siRNA，Hs_NRP 1_8 FlexiTubesiRNA）和对照siRNA（AllStars阴性对照siRNA）购自Qiagen。使用Oligofectamine（Life Technologies）作为转染试剂。从Cell Signaling Technology购买重组干扰素γ和肿瘤坏死因子α以及抗STAT1（#9172；1:1000）、磷酸化STAT1、STAT3（#4904；1:100）和磷酸化STAT3的抗体。他莫昔芬和抗β-肌动蛋白抗体（A2228；1:5000）购自Sigma-Aldrich。用于western blotting（#3725；1:1000）的NRP1抗体购自Cell Signaling Technology，用于人类多发性硬化组织免疫组织化学染色的抗NRP1（HPA030278；1:200）抗体购自Sigma-Aldrich。CXCL10抗体（orb10277；1:100）购自Biorbyt（加利福尼亚州旧金山）。根据制造商的协议（马萨诸塞州沃尔瑟姆热电科学公司），使用活性Rac1下拉和检测试剂盒对HMBVEC中的Rac1活性进行定量。Rac1抑制剂NSC 23766购自Tocris Bioscience（英国布里斯托尔）。

采集新鲜组织，在OCT中进行snap冷冻，并在5 微米。按照前面描述的方法进行染色(Ji等人，2008年). 简单地说，冷冻切片用0.25%戊二醛在PBS中固定，然后用冲洗液（0.1 M磷酸盐缓冲液，pH 7.3，0.1%脱氧胆酸，0.2%NP-40和2 mM氯化镁₂). X-gal染色是通过在染色缓冲液（2.5 毫克毫升⁻¹X加仑，5 mM铁氰化钾和5 mM亚铁氰化钾）在37°C下过夜，然后用核固红进行复染。

对于所有实验，如前所述，流式细胞术缓冲液中含有1%的牛血清白蛋白和0.02%的PBS叠氮化钠(Howe等人，2012年). 简言之，阻断缓冲液包含流式细胞仪缓冲液、2.4G2杂交瘤上清液（Fc阻断；抗CD16和-CD32；美国型培养收集，编号HB-197）和胎牛血清，比例为10:5:1。分离后，将细胞悬浮液在4°C的封闭缓冲液中孵育30 在1:200时将抗体添加到封闭的细胞中，并孵育30分钟 4°C时最小值。然后在流式细胞术分析之前，将染色的细胞在流式细胞术缓冲液中洗涤三次。使用FlowJo 7.5（Windows版本；Tree Star，Inc.，Ashland，OR）离线分析文件。CD45用抗体克隆30-F11（BD Biosciences no.557235）检测。用克隆M1/70（BD Biosciences no.553312）检测到CD11B。用抗体RB6-8C5的克隆Gr1（BD Biosciences no.553128）检测Ly6C和Ly6G（淋巴细胞抗原）。用克隆1A8（BD Biosciences no.560599）检测到Ly6G。用克隆A20（BD Biosciences no.553776）检测到CD45.1。鸡尾酒1:FITC–抗CD45、藻红蛋白（PE）–抗TCRγδ、周苷叶绿素（PerCP）–Cy5.5–抗CD8、APC–抗CD4抗体；鸡尾酒2:FITC–抗CD45、PE–抗TCRβ、PerCP–Cy5.5–抗CD8、APC–抗CD4抗体；鸡尾酒3:FITC–抗CD3、PE–抗CD1d、PerCP–Cy5.5–抗CD11b、APC–抗NK1.1抗体；鸡尾酒4、FITC–抗CD3、PE–抗TCRγδ、PerCP–Cy5.5–抗CD11b、APC–抗NK1.1抗体；鸡尾酒5:FITC–抗CD69、PE–抗CD62L、PerCP–Cy5.5–抗CD8、APC–抗CD4抗体。

用于图像采集的成像系统是Bruker Avance II 7特斯拉垂直孔小动物MRI系统（Bruker Biospin）。小鼠通过吸入异氟烷进行麻醉，并保持在3-4%的异氟烷下。在MRI采集过程中监测每只小鼠的呼吸频率，使用的监测系统是SA Instruments，Inc.（纽约州Stony Brook）1030型。以以下方式采集三维T2*加权图像[梯度回波快速成像脉冲序列：重复时间（TR）=150 ms，回波时间（TE）=10 ms，翻转角度=15°，视野=4×2.5×2.5 cm，矩阵：256×128×128，激励次数=4](Johnson等人，2012年). 使用分析功能（明尼苏达州罗切斯特梅奥诊所生物医学成像资源）分析T2*加权图像。以重量为基础的剂量为100的钆腹膜内注射 毫克 公斤⁻¹给每只小鼠体重的%，标准延迟时间为15天后 min，使用体积采集T1加权自旋回波序列（TR=150 毫秒，TE=8 ms，矩阵：256×256×18，平均数=1），获得T1加权图像。我们没有动物死亡，动物在麻醉和图像采集后恢复。

所有分析均使用GraphPad Prism 5（GraphPad-Software）进行。实验通常重复至少三次，次数根据效应大小或样本变化而增加。中的值图2D、，4A、 B和图S3E表示为平均值±95%置信区间，所有其他值表示为平均数±s.e.m。非参数分析用于图1，图S1和S2。统计差异在P（P）<0.05。一个未配对的双尾学生的t吨-测试针对图2B、 G、H和三D.疾病发病率图4C采用Fisher精确检验进行分析。EAE诱导后的临床行为和体重变化图4A、 B采用双向方差分析。对于小样本(n个<5）英寸图1D、 E、，三D、图S1和S2，散点图代替条形图用于表示数据。

我们感谢Alex Kolodkin博士（约翰·霍普金斯大学）和Ralf H.Adams博士（马克斯·普朗克研究所）为NRP1^{flox/flox公司}小鼠和VECad-Cre-ERT2小鼠。我们感谢杰克逊维尔组织病理学梅奥诊所的布兰迪·艾登菲尔德女士和劳拉·刘易斯·塔芬博士的亲切帮助。我们感谢Marcus Fruttiger博士（伦敦大学学院眼科研究所）提供的三苯氧胺诱导方案。我们感谢凯莉·维奥拉女士为撰写本文提出的有益建议。