跨膜GTPase Fzo的哺乳动物同源物丝裂原融合蛋白的膜拓扑结构和线粒体靶向性

线粒体是一个管状和分支膜系统，其形态和细胞内分布在不同组织和细胞类型之间有显著差异，并进一步受到代谢条件和发育阶段的影响(Bereiter-Hahn和Voth，1994年;Smiley等人，1991年;扎戈洛夫，1982年). 线粒体是动态的并经历融合和裂变反应的观察(Nunnari等人，1997年;Rizzuto等人，1998年)由此产生了线粒体网络代表单个细胞器的概念。这应该能够在携带不同有害突变的线粒体DNA分子之间进行互补，但现有的研究在软骨间互补的频率和/或效率方面存在矛盾(Enriquez等人，2000年;Nakada等人，2001年;Ono等人，2001年). 由于这一原因和其他原因，哺乳动物线粒体融合的程度和频率仍然存在争议。

与其他细胞膜相比，对线粒体膜动力学的控制因素知之甚少。在芽殖酵母中，线粒体分裂是由一种动力相关蛋白（Dnm1p）和其他最近发现的蛋白（由Yoon和McNiven，2001年). 另一种与动力相关的蛋白质，Mgm1p，是维持线粒体融合能力所必需的(Wong等人，2000年). Dnm1p的裂变活性被线粒体跨膜蛋白（预测的GTPase Fzo）的裂变活性所拮抗(Bleazard等人，1999年;Sesaki和Jensen，1999年). 酵母Fzo是组成性表达的，定位于线粒体外膜，对线粒体融合和生物发生至关重要(赫尔曼等人，1998年;Rapaport等人，1998年). 动力相关蛋白Dnm1p（Drp1）和Mgm1p（OPA1）的哺乳动物同源物普遍表达，并有助于线粒体的分布和功能(Deletere等人，2000年;Smirnova等人，1998年). 的表达式果蝇属Fzo同源物在线粒体融合发生的短时间内仅限于精子细胞，其缺失会导致雄性不育(Hales和Fuller，1997年). 最近发现了两种人类Fzo同源物，称为丝裂原融合蛋白Mfn1和Mfn2。他们的表达模式仍然未知。它们似乎与融合有关，因为它们可以对抗人类Drp1的裂变活性，就像Fzo在酵母中的作用一样(桑特尔和富勒，2001年).

相对较大的Fzo/Mfn蛋白（90-100 kDa）的序列分析揭示了包含GTP结合和跨膜结构域的多域结构，以及跨膜结构区上游和下游的两个预测线圈区域。人Mfn2的跨膜结构域对线粒体靶向是必要的(桑特尔和富勒，2001年)酵母Fzo以受体依赖的方式进入外膜(Rapaport等人，1998年). 然而，Fzo/Mfn的线粒体靶向和膜插入的机制和基序尚不清楚。保守GTP结合基序的突变破坏了酵母Fzo介导线粒体融合的能力(赫尔曼等人，1998年)暴露于膜间空间的一个小区域的改变会干扰其调节融合的能力(Fritz等人，2001年). 然而，Fzo在融合过程中的确切作用尚不清楚。

在本研究中，我们发现丝裂原融合蛋白Mfn1和Mfn2是普遍存在的线粒体蛋白。我们确定了Mfn2的膜拓扑结构及其C末端结构域在膜靶向中的作用。此外，我们发现Mfn2的卷曲螺旋结构域相互作用，这些相互作用对线粒体靶向很重要。最后，我们证明Mfn2可以改变线粒体形态，使线粒体膜紧密接触。

用TMPRED预测跨膜结构域、线圈区域和线粒体前序列(霍夫曼和斯托菲尔，1993年)，线圈(Lupas等人，1991年)和MitoProt(克拉罗斯和文森斯，1996年)分别是。使用CLUSTAL W进行蛋白质比对和树状图(汤普森等人，1994年)和穆塔林(Corpet，1988年).

使用寡核苷酸作为引物，用Superscript II（Gibco/BRL）逆转录总RNA，并通过PCR扩增所选择的cDNA片段。对于RT-PCR的半定量分析，凝胶用溴化乙锭染色，用CCD相机拍照，条带的染色强度用NIH图像定量。使用扩展高保真聚合酶（Roche Molecular Biochemicals）从人类皮肤成纤维细胞总RNA中通过RT-PCR扩增出人类Mfn1的开放阅读框（由重叠的cDNA序列AK000700和U95822推导而来）。编码人Mfn2[KIAA蛋白0214的cDNA(长濑等人，1996年)]由Kazusa DNA研究所提供。根据标准程序进行克隆，并通过测序验证所有PCR产物。用带有限制性位点的引物扩增编码Mfn2、NG（残基1-405）和CT（残基648-757）两个片段的cDNA，并将其插入Xho公司我和巴姆pET15b载体（Novagen）的HI位点。通过连接编码Kozak序列和菌丝体的退火引物，生成编码Kozak序列下游myc表位的哺乳动物表达载体（pCB6-myc）。用带有限制性位点的引物扩增Mfn1、Mfn2和截短的Mfn 2分子（MF2-NT、MF2-TMCT、MF2-ΔC2、MF2-IYFFT），PCR产物插入pCB6(Rojo等人，2000年)或pCB6-MYC。Mfn2的GTP结合基序的单个残基用Quikchange（Stratagene）诱变（K109A、S110N和R259L）。不含GTP结合域（MF2-ΔGB:残基97-264缺失）或第一个线圈域（MF2ΔC1:残基390-439缺失）的Mfn2分子由含有序列重叠的引物对上游和下游区域的单独扩增产生。这些PCR产物通过融合PCR连接(Ho等人，1989年)，并将最终PCR产物克隆到PCB6-MYC中。靶向线粒体基质的GFP分子（mtGFP）的构建如下所述(Rizzuto等人，1998年)并克隆到pCB6中。

HeLa细胞按照所述进行维护和转染(Rojo等人，2000年). 小鼠肌源性细胞系C2[C27C4的允许克隆(Pinset等人，1988年)]保存在补充有20%胎牛血清、50 IU/ml青霉素和50μg/ml链霉素的DMEM（4.5 g Glc/l）中。如前所述，对细胞进行荧光显微镜处理(Rojo等人，1997年). 使用蔡司Axiophot显微镜观察细胞，并用CCD摄像机或Ilford HP5 Plus胶片记录图像。使用Metaview和Adobe Photoshop处理缩微照片。共焦激光扫描显微镜和电子显微镜按所述进行(Bakker等人，2000年).

JC-1是从分子探针中获得的，诺卡唑是从钙生物化学中获得的；FITC-Phalloidin、细胞松弛素B和羰基氰化物间氯苯腙（cccp）是从Sigma中获得的。JC-1储备液（水中5 mg/ml）保持在4°C；所有其他储备溶液（DMSO中的10 mM诺卡唑、DMSO的0.2 mg/ml FITC-柱状肽、乙醇中的1 mg/ml细胞松弛素B、DMSO中的20 mM cccp）保持在-20°C。His标记的Mfn2片段NG或CT在大肠杆菌应变C41（DE3）(Miroux和Walker，1996年). 将含有NG和CT的包涵体溶解在含有6 M尿素的缓冲液中，并用Ni-NTA琼脂糖（Qiagen）纯化。在兔子体内产生针对NG和CT混合物（质量比1:1）的抗血清。为了亲和纯化抗体，NG和CT在Ni-NTA柱上以降低尿素浓度的梯度重新折叠。将重新折叠的NG和CT分别与Affi-Gel 10（Bio-Rad）偶联，并按所述纯化抗体(Rojo等人，1997年). 按说明进行蛋白质分析（蛋白质测定、SDS-PAGE和western blot(Rojo等人，1997年). 对于western blot分析，在每个通道中加载等量的蛋白质（20μg），并通过膜的Ponceau蛋白染色确认等量加载。使用了针对以下抗原和/或腔室的抗体：ATP/ADP载体(Rojo和Wallimann，1994年)细胞色素c氧化酶[COX2和COX4的亚基(Bakker等人，2000年)]，calnexin（StressGen生物技术公司），未知Golgi特异性抗原[CTR433(Jasmin等人，1989年)]、α-微管蛋白（Amersham Pharmacia Biotech）、Hsp60（Sigma）、细胞色素c（BD-PharMinen）和菌丝体[9E10(Evan等人，1985年)].

大鼠组织中的线粒体按所述进行富集(Rojo和Wallimann，1994年)但省略了Percoll渐变步骤。将粘附培养细胞在Hepes蔗糖培养基（HS）中匀浆，如所述(Rojo等人，1997年). 为了沉淀细胞核，匀浆在200℃下离心两次5分钟克（西格玛台式离心机）。为了沉积线粒体，核后上清液在5000℃下离心10分钟克（西格玛台式离心机）。为了分离微粒体和胞浆，线粒体后上清液在100000℃下离心1小时克（贝克曼TLA-45转子）。在0°C下，在0.5%Triton X-100存在或不存在的情况下，用蛋白酶K（10μg/ml）培养新分离的线粒体（HS中为2 mg/ml）。通过添加过量的含有2mM PMSF的HS来停止消化。

使用BLAST搜索哺乳动物Fzo-homolog(Altschul等人，1997年)导致了对预测存在两种哺乳动物同源物的序列的鉴定（单基因簇Hs.197877-Mm.27914和Hs.3363-Mm.24578-Rn.8570）。这些Fzo-homolog与最近描述的丝裂原融合蛋白Mfn1和Mfn2相同(Santel和Fuller，2001年). 用RT-PCR从人RNA中扩增出Mfn1的开放阅读框。编码Mfn2的cDNA已被克隆（KIAA蛋白0214，D86987）。我们用RT-PCR研究了哺乳动物有丝分裂素的表达。作为对照，我们扩增了线粒体转录因子a（Tfam）的转录物，这是一种对线粒体功能至关重要的普遍蛋白质(帕里西和克莱顿，1991年). 如所示图1这两种丝裂原在包括睾丸在内的多种哺乳动物组织中转录水平相似。PCR反应的半定量分析表明，Mfn1和Mfn2的表达水平相似（比值Mfn2/Mfn1=0.91±0.22；n个=24），其转录物比Tfam的转录物更丰富（Mfn1/Tfam=1.97±0,45；n个=21).

这两种哺乳动物有丝分裂素的普遍共表达与限制性表达不同果蝇属Fzo公司(Hales和Fuller，1997年). 这种差异促使我们在DNA数据库中搜索其他Fzo-homolog。我们在以下人群的基因组中鉴定出了Fzo-homologs秀丽隐杆线虫和S.pombe公司(图1C，Ce-Fzo，Sp-Fzo）和新的Fzo-homologD.黑腹果蝇(图1C，Dm-FzoU）。此外，我们发现表达序列标签（EST）来源于秀丽隐杆线虫和D.黑腹果蝇.英寸秀丽隐杆线虫，所有EST(n个=18）与预测蛋白Ce-Fzo相同。在果蝇属，所有EST(n个=10）与新的Fzo同源物Dm-FzoU相同，起源于胚胎、头部和卵巢库。这预示着在果蝇属：Dm-FzoS，其表达仅限于发育中的精子细胞(Hales和Fuller，1997年)和Dm-FzoU，它们的EST在不同的发育阶段和不同的组织中被发现。有趣的是，哺乳动物的有丝分裂素与普遍存在的Dm-FzoU更为相似，而与精子特异性Dm-FzoS更为相似(图1C).

与所有Fzo-homolog一样，线粒体显示出一个多域结构，包括一个GTP-结合域、两个卷曲线圈区域和一个预测的跨膜域(图2A，Mfn2）。为了研究Mfn2的定位，我们制备了一种针对编码蛋白质N端和C端片段的Mfn2-片段的兔抗血清(图2A、天然气、CT）。在western blot中，该抗血清修饰了一条预期表观分子量为Mfn2（86.4 kDa）的条带，该条带在小鼠C2和人类HeLa细胞的线粒体部分高度富集(图2B，箭头）。针对每个片段的亲和纯化抗体在人HeLa细胞、小鼠C2细胞和不同大鼠组织的线粒体部分中鉴定出具有相同表观分子量的多肽(图2C)证明了几种组织线粒体中存在Mfn2。人皮肤成纤维细胞的免疫组织化学分析(图2D)人HeLa细胞和小鼠C2细胞（未显示）用亲和纯化的NG-抗体证实了Mfn2的线粒体定位。值得注意的是，内源性Mfn2分布在整个线粒体网络中(图2D). 亲和纯化的CT抗体太弱，无法通过免疫荧光揭示Mfn2的内源性水平，但在转染的细胞中识别过表达的蛋白质（未显示）。

通过蛋白酶处理分离的线粒体，然后用区域特异性抗体进行western blot分析，研究Mfn2的膜拓扑结构。为了证实亲和纯化抗体的特异性，我们分析了表达myc标记的Mfn1、Mfn2和Mfn2-突变体的细胞提取物，这些突变体不含N末端结构域的C末端(图3A). 中显示的污点图3B在几乎检测不到内源性Mfn2的条件下，可视化高丰度过表达蛋白。支原体特异性抗体(图3B，myc）修饰的Mfn1、Mfn2和不同的Mfn2片段（箭头）。针对N端和C端Mfn2片段（NG和CT，图2A)具有亚型和区域特异性：（1）两种抗体均未修饰Mfn1；（2） NG装饰MF2-IYFFT和MF2-NT，但几乎无法识别MF2-TMCT；（3）CT显示MF2-TMCT，但未修饰MF2-IYFFT和MF2-NT(图3B). NG抗体对TMCT的微弱识别表明，尽管进行了亲和纯化，NG抗体仍被少量CT抗体污染。

接下来，我们在没有或有洗涤剂的情况下，用蛋白酶K处理新分离的线粒体。膜间间隙（Cyt.c）和基质空间（Hsp60）的蛋白质在完整的线粒体中受到保护(图3C)用洗涤剂溶解膜后消化(图3D). 相比之下，在蛋白酶处理完整线粒体的过程中产生了各种Mfn2片段(图3C，星号）。其中一些片段被区域特异性抗体区别标记(图3C，NG，CT），小于MF2-NT(图3C，上箭头）或MF2-TMCT(图3C，下箭头）。这些结果揭示了N端和C端结构域的断裂，并表明它们暴露于含有蛋白酶的外部介质中。这些实验揭示的膜拓扑如所示图3E：Mfn2通过其跨膜结构域锚定在线粒体外膜上，并将N端和C端结构域暴露于胞浆。

Mfn2的跨膜结构域已被证明是线粒体靶向所必需的(桑特尔和富勒，2001年). 为了更好地理解Mfn2的靶向机制，我们分析了在跨膜结构域之前截短的Mfn2-突变体的亚细胞定位(图4A，MF2-NT）和Mfn2分子的N末端结构域缺失(图4A，MF2-TMCT）。MF2-NT的细胞质分布（未显示）证实Mfn2的跨膜结构域对线粒体靶向是必要的。MF2-TMCT分子与线粒体GFP（mtGFP，图4B)证明Mfn2的跨膜和C末端结构域足以用于线粒体靶向。Mfn2和Mfn2-片段的靶向性与尾部锚定蛋白的靶向特性相似，尾部锚定蛋白质将其N末端结构域暴露于胞浆中(Borgese等人，2001年). 尽管它们的靶向机制尚不清楚，但现有数据表明，它们的亚细胞定位是由跨膜结构域下游的侧翼区域指定的：当该侧翼区域包含基本残基时，蛋白质被插入线粒体外膜和内质网（ER）当它含有中性或疏水性氨基酸时(Borgese等人，2001年;Isenmann等人，1998年;Kuroda等人，1998年). 类似的基序也在膜方向相反的蛋白质中起作用(Kanaji等人，2000年).

我们注意到，所有的Fzo-homolog都含有大量的碱性氨基酸，这些氨基酸散布在它们的C末端结构域上。为了研究它们是否指定Mfn2在线粒体外膜中的插入，我们用疏水性氨基酸（IYFFT）取代了Mfn1的C末端结构域，该疏水性氨基酸靶向SNARE蛋白VAMP-1（VAMP-1A）的一个亚型到内质网(Isenmann等人，1998年). MF2-IYFFT(图4A)与ER标记物calnexin共定位，证明其针对ER(图4C). Mfn2的C末端结构域随后被靶向另一种VAMP-1亚型（VAMP-1B）的三个极性残基（RRD）替换为线粒体(Isenmann等人，1998年). MF2-RRD型(图4A)与mtGFP共定位显示，主要靶向线粒体(图4D). MF2-RRD的一小部分靶向ER膜，尤其是高表达水平（未显示）。总之，这些结果表明，Mfn2的线粒体靶向性由C末端结构域通过模体和机制指定，至少部分类似于尾锚定蛋白的模体和机理。MF2-RRD的行为表明Mfn2的C末端结构域中存在进一步的靶向决定因素。

即使是线圈域(图2A，CC1，CC2）在Fzo-family的所有成员中都是保守的(Hales和Fuller，1997年;桑特尔和富勒，2001年)，它们的功能仍然未知。为了研究它们的功能，我们分析了Mfn2分子的局域化，这些分子都没有线圈结构域(图4A，MF2-ΔC2，MF2-△C1）。尽管这两种分子都以线粒体为靶点，但仍有大量的蛋白质留在细胞内(图4E、F).

MF2-ΔC2的靶向效率降低可能是由于移除了C末端靶向决定因素。相比之下，更难理解MF2-ΔC1的靶向效率降低，因为它与全长Mfn2和MF2-TMCT具有相同的C末端结构域。这两个缺失突变体显示出相似的靶向特性，这一事实表明，除了C末端结构域的基序外，线圈-线圈相互作用对于全长Mfn2的有效线粒体靶向是必需的。这些相互作用可以在Mfn2的线圈域之间建立，也可以与其他蛋白质的线圈域建立。为了研究这些可能性，MF2-NT和无myc-tag的Mfn2-TMCT（F2-TMCT）通过共转染同时表达。用抗myctag抗体（MF2-NT）和CT-抗体（F2-TMCT）观察共表达分子。亲和纯化的CT-抗体太弱，无法揭示Mfn2的内源性水平，但可识别F2-TMCT的CT表位(图5). 我们观察到MF2-NT与F2-TMCT在线粒体中共定位(图5A). 相反，尽管共表达F2-TMCT的线粒体定位，但不含卷曲-卷曲结构域（MF2-NTΔC1）的MF2-NT分子仍保持细胞溶质(图5B). 类似地，当MF2-NT与缺乏其线圈结构域的F2-TMCT版本共同表达时，MF2-NT仍保持细胞溶质（F2-TMCT-ΔC2，未显示）。有趣的是，当与F2-TMCT共转染时，MF2-IYFFT也靶向线粒体(图5C、D). 当任何共转染分子中的线圈结构域被删除时，MF2-IYFFT定位于ER（未显示）。有趣的是，共转染Mfn2片段的性质与全长Mfn1片段的性质相似：它们可以在高表达水平下聚集核周区的线粒体(图5D). 对这些实验的定量分析表明，通过F2-TMCT对MF2-NT或MF2-IYFFT进行线粒体定位是高效的，并且在任何共转染分子中的线圈结构域缺失后被消除(图5E). 这些结果证明了Mfn2片段之间的特异性和强相互作用，进一步表明截断的F2-TMCT和MF2-IYFFT的线圈结构域朝向细胞质。虽然Mfn2片段的线圈域可能直接相互作用，但不能排除未知桥联分子介导这些相互作用。跨膜结构域上游和下游结构域之间的相互作用证实了先前通过蛋白酶保护实验建立的膜拓扑结构。

人丝裂原融合蛋白的过度表达导致大量线粒体聚集(Santel和Fuller，2001年). 同样在本研究中，Mfn1（未显示）和Mfn2的过度表达(图6C、D)导致高蛋白表达细胞中线粒体的核周聚集（通常在35-45%的转染细胞中）。使用细胞器特异性抗体的免疫荧光显微镜显示，Mfn2过度表达不会影响内质网和高尔基体（未显示）的形态或细胞内分布，表明Mfn 2特异性作用于线粒体。其预测G1（K109A，S110N）关键残基的突变G4基序（R249L）没有改变多余Mfn聚集线粒体的能力（未显示），证实线粒体聚集不需要功能性GTP结合域(桑特尔和富勒，2001年). 缺乏整个GTP结合域的突变(图4AMF2-ΔGB），有效靶向线粒体，与野生型Mfn2（未显示）相似聚集线粒体。这明确排除了GTP-结合域参与导致线粒体重新分布和聚集的蛋白质-蛋白质相互作用。Mfn2分子缺乏整个C末端结构域（MF2-RRD）或任何一个卷曲-线圈结构域（MP2-ΔC1，MF2-ΔC2），保留了重新分布和群集线粒体的能力(图4D-F)尽管转染细胞的比例较低（15-25%）。值得注意的是，含有GTP-结合域的Mfn2片段的表达，但错误定位于胞浆（MF2-NT）或ER（MF2-IYFFT），似乎不会影响线粒体形态或分布（见下文；图7C).

过量Mfn2引起的线粒体聚集与线粒体向核周区域的重新分布平行(图6C、D). 因为微管和肌动蛋白丝调节线粒体的细胞内分布(Bereiter-Hahn和Voth，1994年;Krendel等人，1998年;莫里斯和霍伦贝克，1995年)，我们研究了过量的Mfn2是否需要线粒体重新分布的功能性细胞骨架。为此，我们使用了严重干扰微管蛋白或肌动蛋白细胞骨架动力学的药物（诺康唑、细胞松弛素B）。在未转染细胞中，细长线粒体的分布(图6A，对照）在微管解聚时受到轻微干扰(图6A，诺卡唑）。相反，肌动蛋白丝的解聚导致出现遍布细胞的点状线粒体(图6B). 在仅编码Mfn2或Mfn2-mtGFP的质粒转染的细胞中，药物治疗在转染后9小时开始。在这个早期阶段，只有少数细胞（≤2%）表达任何转基因。15小时后（转染后24小时），当超过30%的细胞表达可见量的mtGFP时，对细胞进行免疫荧光显微镜检查。在缺乏功能性微管蛋白的情况下，线粒体簇的形成及其向核周区的重新分布也发生了(图6C)或肌动蛋白细胞骨架(图6D). 当在簇形成后（转染24小时后）添加药物时，它们不会影响先前存在的线粒体簇的大小或细胞内分布（未显示）。这些结果排除了微管蛋白和肌动蛋白细胞骨架参与Mfn2介导的线粒体再分配。他们进一步表明，Mfn2介导线粒体间粘附，这导致线粒体从细胞外周收缩，并在核周区域积聚。

接下来，我们用共焦显微镜分析了成簇线粒体的结构。在仅表达mtGFP的对照细胞中，大多数线粒体表现为数微米长、400至450纳米直径的小管。内膜标记物COX2和基质标记物mtGFP广泛共定位，它们在线粒体内的分布仅显示出极小的差异(图7A，控制）。在共表达Mfn2和mtGFP的细胞中，聚集的线粒体呈离散的球形或卵圆形结构，其直径（860±160 nm，n个=34）显著大于对照细胞中的线粒体小管(图7A，+Mfn2）。有趣的是，在增大的球形线粒体中，内膜似乎围绕着基质空间(图7A，+Mfn2）。这强调了尺寸的显著增加，表明内膜和基质部分分离。在表达高水平MF2-IYFFT的细胞中，MF2-IY FFT分子在内质网内分离，并在离散的膜域中富集(图7B). 这些ER亚结构域的球状结构让人想起成簇的线粒体。

然后，我们研究了Mfn2过度表达诱导的成簇线粒体膜的完整性。细胞色素c，当外膜受损和/或渗透时，从线粒体膜间空间释放的蛋白质（有关综述，请参阅Desagher和Martinou，2000年)，留在Mfn2表达诱导的线粒体簇中（未显示）。活性染料JC-1，在线粒体中积累并在高跨膜电位下形成红色荧光聚集体(Smiley等人，1991年)，以类似方式标记正常和聚集线粒体（未显示）。总之，这些实验表明，过量Mfn2引起的线粒体聚集不会影响线粒体内外膜的完整性。

用电子显微镜分析转染空质粒或编码Mfn2质粒的HeLa细胞的超微结构。在对照细胞中，线粒体显示出标准的形态：球形或管状线粒体轮廓（最小直径250-350 nm）由一个具有电子致密基质空间和紧贴嵴膜的双层膜分隔(图8A). 仅在转染Mfn2的培养皿中发现核周区有线粒体簇的细胞(图8B，C). 这些线粒体簇的大小和定位与共焦显微镜观察到的一致。所有线粒体轮廓均为球形/卵圆形，直径显著增加，达到1μm(图8B). 簇状线粒体的内部结构也受到影响：较小线粒体的嵴膜看起来正常，中等大小的线粒体中嵴膜肿胀，在最大的线粒体中难以识别(图8B、C). 尺寸的增加和从管状到球状的形态变化可能导致嵴内膜（可能与内膜连续）重新定位到增大的线粒体的外围。这可以解释为什么在共聚焦显微镜中，增大的线粒体内膜似乎围绕着基质(图7A). 更高的放大倍数图8C表明线粒体内外界膜的结构得到了很好的保护，并列线粒体的双层膜可以紧密接触而不合并(图8C，箭头），证实过量Mfn2调节软骨间粘连的能力。

哺乳动物中Fzo-homologs（丝裂原融合蛋白）的存在意味着所有真核生物的线粒体融合机制之间有很强的相似性。Fzo-proteins参与融合(Hales和Fuller，1997年;赫尔曼等人，1998年)与丝裂原融合蛋白的普遍表达一起，表明线粒体融合并不局限于哺乳动物的某些组织和/或发育阶段。这项工作以及之前的研究(桑特尔和富勒，2001年)，揭示了两种哺乳动物有丝分裂融合蛋白之间的相似性。目前尚不清楚内源性丝裂原融合蛋白在体内是否表现出不同或类似的活性，以及它们是否以独立和/或协同的方式发挥作用。与酵母和线虫相比，苍蝇D.黑腹果蝇似乎有两个Fzo-homolog：Dm-FzoS和Dm-FzoU。虽然Dm-FzoU可能普遍表达，但Dm-FzoS仅在精子细胞发育期间表达(Hales和Fuller，1997年). 在哺乳动物中，如果蝇属，精子细胞线粒体在精子发生的后期广泛融合（综述扎戈洛夫，1982年). 因此，尽管睾丸中普遍存在Mfn1和Mfn2的表达，但哺乳动物中也可能存在精子特异性Fzo-homolog。

Mfn2的膜拓扑结构，N端和C端结构域暴露在细胞液中，这意味着疏水结构域跨越外膜两倍，如酵母Fzo所示(Fritz等人，2001年). Mfn2的N端和C端结构域之间的相互作用证实了这种拓扑结构。考虑到域组织在所有Fzo-homolog之间是保守的(Hales和Fuller，1997年;桑特尔和富勒，2001年)，很可能Fzo-proteins也共享其膜拓扑结构。

研究发现，Mfn2的跨膜和C末端结构域通过类似于线粒体外膜其他跨膜蛋白的基序来确定其靶向性(Borgese等人，2001年;Isenmann等人，1998年;Kanaji等人，2000年;Kuroda等人，1998年). 这些靶向基序足以将Mfn2片段定位到ER（MF2-IYFFT）或线粒体（MF2-TMCT），但不足以定位全长Mfn2。共转染实验表明，Mfn2的卷曲螺旋结构域介导不同Mfn2片段之间的直接或间接相互作用，并且这些相互作用对于全长Mfn2的有效线粒体靶向是必要的。这些实验进一步表明，相互作用Mfn2片段的线粒体靶向性优于MF2-IYFFT的ER靶向性。尽管对蛋白质向线粒体外膜的转运仍知之甚少，但最近的研究表明，线粒体和内质网直接从胞浆中招募尾锚定蛋白质，并能竞争同一多肽(Borgese等人，2001年). 共表达的Mfn2片段可以在胞浆中相互作用，屏蔽MF2-IYFFT的ER靶向信号，由此产生的蛋白复合物随后会转移到线粒体。或者，F2-TMCT可以首先靶向线粒体，从线粒体中招募靶向错误的MF2-NT和MF2-IY FFT。可以合理假设MF2-IYFFT在插入ER膜之前将被F2-TMCT招募。事实上，Mfn2分子中没有任何一个线圈结构域，但仍有部分细胞溶质，这表明线粒体运输机制可以区分有和没有组装线圈的蛋白质。这将证明第一个假设，即在线粒体导入之前，细胞液中的线圈结构域的组装。

过度表达的线粒体融合蛋白在不影响膜完整性的情况下诱导线粒体的核周聚集。据我们所知，仅报道线粒体外膜蛋白OMP25在过度表达时具有聚集线粒体的能力，并且需要其PDZ结构域(内莫托和德卡米利，1999年). 多种外膜蛋白，包括孔蛋白/VDAC亚型(Yu等人，1995年)，SNARE蛋白(Isenmann等人，1998年)，一种细胞色素b亚型(Kuroda等人，1998年)和Tom20(Kanaji等人，2000年)，在哺乳动物细胞中过度表达时不会诱导线粒体聚集。虽然我们不能完全排除线粒体聚集是非特异性引起的，但Mfn2在缺乏功能性细胞骨架的情况下重新分布线粒体的能力表明Mfn1具有调节线粒体间粘附的能力。Mfn2分子的线圈结构域可能通过形成四螺旋束介导软骨间粘附/对接，如SNARE蛋白所示(Sutton等人，1998年). 然而，值得注意的是，缺乏线圈结构域的分子也介导线粒体聚集，尽管效率较低。线圈-线圈突变体的聚集能力降低可能反映了线圈-线圈结构域直接参与粘附，或者是线粒体靶向效率降低的结果。因此，Mfn2可能通过除形成（SNARE样）四螺旋束和/或参与导致膜融合和线粒体融合的其他膜重排之外的机制介导线粒体间粘附。

由于功能GTP绑定域对于Mfn2功能是必要的(Hales和Fuller，1997年;赫尔曼等人，1998年;桑特尔和富勒，2001年)很容易推测，该结构域要么调节Mfn2的活性，要么催化进一步的下游反应。因此，过量Mfn2引起的线粒体聚集可能是由Mfn 2分子过度调节引起的，也可能是由线粒体间粘附增加和下游融合事件缺乏的综合作用引起的。与其他GTP结合蛋白一样，Mfn/Fzo可能需要调节剂和/或效应分子才能发挥正常功能。靶向错误的Mfn2-constructions（MF2-NT，MF2-IYFFT）的表达并不影响线粒体的分布和形态，这一事实表明，假设因素没有被滴定出来。这可能表明它们非常丰富，是膜结合的（不能与靶向错误的分子相互作用），或者它们不存在。Mfn/Fzo及其GTP-结合域的进一步表征，以及进一步蛋白质（包括Mfn/Fzo的假设调节剂）的鉴定和表征，将提高我们对Fzo功能的理解，并有助于揭示线粒体融合的机制。

我们感谢I.Iost和B.Miroux在蛋白质表达和纯化方面的建议和帮助，M.Lombès提供RNA，R.Parton在电子显微镜标本制备方面的建议，P.Frachon提供了卓越的技术援助，C.Barthe-le-my和P.Bausero在RT-PCR方面的帮助，以及M.Fiszman，B.Goud，F.Perez，K。Schwartz和G.van der Goot对手稿进行了批评性阅读。我们感谢K.Schwartz的持续支持和建设性讨论。我们感谢C.Pinset和D.Montaras克隆了肌肉细胞系C2（C27C4），感谢J.Walker克隆了大肠杆菌菌株C41（DE3）、M.Bornens检测抗体CTR433和Kazusa DNA研究所检测编码Hs-Mfn2的cDNA。这项工作得到了法国控制肌病协会（AFM；至A.L.）的资助。M.R.是INSERM和AFM博士后研究金的获得者。