小鼠植入前胚胎的血统鉴定

受精卵如何从单个细胞发育成复杂的多细胞生物是发育生物学中的一个基本问题。哺乳动物植入前的发育是独特的，因为哺乳动物的合子没有明显的极性，这可能与以后的发育事件有关。特别是，小鼠植入前胚胎对各种实验扰动具有高度耐受性，表现出高度的可塑性和自组织性。虽然哺乳动物胚胎如何在植入前胚胎发生过程中发育的大致轮廓早已为人所知，但这种可塑性和自组织的机制才刚刚开始被了解。

小鼠着床前发育涉及几个不同的细胞事件(图1). 受精后，三轮卵裂产生8细胞胚胎。然后在8细胞期发生极化和致密化，随后发生不对称分裂轮，产生两种不同的细胞类型：滋养层（TE）和内细胞团（ICM）细胞。随后，随着胚胎发育成一个被称为胚泡的中空细胞球，ICM分化为产生所有胎儿细胞的外胚层（EPI）和主要形成胚外卵黄囊的原始内胚层（PE）。尽管所有胚胎都是通过相同的过程发育的，但胚胎之间的事件发生频率和时间差异很大。此外，许多分子和细胞事件并不是完全同步的，无论是在胚胎内的卵裂球之间还是在同卵胚胎之间，但所有合子都会形成外观相当相似的囊胚。这就提出了一个问题，即早期卵裂球是如何平等的，以及早期胚胎是否可以被视为同质群体。鉴于最近对干细胞中各种多能状态的认识在体外(Wu和Izpisua Belmonte，2015年)对小鼠胚胎植入前发育和自组织的全面了解对于进一步研究细胞重编程方法非常重要。这些研究也对理解人类早期发育和理解人类的多潜能状态具有重要意义，因为小鼠和人类的植入前发育之间存在明显的相似性，尽管存在一些差异（参见方框1).

近年来，随着实时成像、计算模型和单细胞转录组学方法的进步，研究人员得以探索小鼠胚泡形成的机制。在这里，我们回顾了这些最新进展，描述了小鼠胚胎中发生的导致前三个胚胎细胞系分化的分子事件和细胞行为。

一般认为，在8细胞期之前，每个卵裂球都保持全能性，即生成所有三个谱系（TE、EPI和PE）的能力。一项经典研究表明，通过将一个或两个供体卵裂球与一个遗传上不同的宿主胚胎聚集在一起，早期的卵裂球具有全能性(凯利，1977年). 在这项研究中，发现来自4细胞和8细胞胚胎的许多供体卵裂球对嵌合体胚胎和幼崽中的所有三种谱系衍生物都有贡献，这表明它们是全能的，尽管有些表现出倾斜贡献。利用Cre-loxP重组技术开发长期细胞标记策略，有可能检测早期卵裂球在完整植入前胚胎中的作用，直至中期妊娠(藤森等人，2003年). 使用这种方法，结果表明，虽然单个2-细胞卵裂球的后代几乎总是对TE和ICM衍生物都有贡献，但在54个标记胚胎中，16个（30%）的单个4-细胞卵裂片的后代只对TE衍生物有贡献。最近，使用彩虹报告小鼠评估了单个4细胞胚胎中所有卵裂球的贡献，在彩虹报告小鼠中，单个细胞可以用不同的颜色进行独特标记(Tabansky等人，2013年). 在这项研究中，在4细胞期标记的囊胚中，30%的囊胚显示出具有统计学意义的TE/ICM偏差。虽然很难控制Cre介导的DNA切除的精确时间，因此也很难控制标记细胞的确切发育时间点（如标记子代大小不均所反映的那样），但这些研究表明早期卵裂球并不总是对所有三个谱系的贡献相等，但却表现出了扭曲的血统贡献。这提出了一个有趣的问题：偏斜的血统贡献是由于非等效效力吗？或者，在卵裂球中偶然产生的扭曲模式是否表现出同等效力？

许多研究旨在确定是否所有早期卵裂球都是相同的。初步研究检查了卵母细胞的极性和胚泡中的极性之间是否存在联系，旨在确定是否有任何卵裂球子代优先占据胚泡中特定的位置(加德纳，2001;Piotrowska-Nitsche和Zernicka-Goetz，2005年). 然而，这些结果是有争议的，因为它们依赖于使用第二极体作为参考点(Hiiragi和Solter，2004年)以及不同实验室使用不同鼠种的不成功重复性(Motosugi等人，2005年;Hiiragi等人，2006年;Alarcon，2010年). 尽管争议尚未完全解决，但其中一些研究表明，在2细胞期后由独特的分裂模式产生的4细胞胚胎子集（～40%）中，卵裂球的发育潜能和组蛋白甲基化模式存在异质性(图2A）(Piotrowska-Nitsche和Zernicka-Goetz，2005年;Torres-Padilla等人，2007年). 在这部分胚胎中，其中一个卵裂球只继承卵母细胞的植物部分。有趣的是，尽管这种卵裂球是全能的（因为它对所有三个谱系都有贡献），但当只有这种类型的卵裂球通过聚集而产生嵌合体胚胎时，它们不能在原肠胚形成之后发育，可能是因为它们在囊胚阶段含有较少数量的EPI细胞(Piotrowska-Nitsche等人，2005年;莫里斯等人，2012年). 与同一个4细胞胚胎的其他三个卵裂球相比，这种“效力有限”的卵裂球组蛋白H3（H3R26me）精氨酸26残基的甲基化水平最低(Torres-Padilla等人，2007年)，并且这种分子异质性仅在这一胚胎亚群中观察到。此外，通过过度表达母体表达的H3精氨酸甲基转移酶CARM1（PRMT4），增加H3R26me水平，诱导多能性因子NANOG和SOX2的早熟表达，并最终增加卵裂球对ICM的贡献(Torres-Padilla等人，2007年). 尽管H3R26me水平调节特定基因表达的机制尚不清楚，但这种有偏见的ICM贡献是由于不对称分裂频率增加以及分裂后与极性蛋白表达水平调节相关的向内细胞运动增强(帕菲特和泽尼克-戈茨，2010年).

还观察到PRDM14表达的异质性(图2B） ●●●●。PRDM14是一种表观遗传学修饰因子，后来在ICM中富集，可以直接与CARM1相互作用(Burton等人，2013年).项目14mRNA表达在2细胞期最高，到8细胞期逐渐下降。到4细胞期晚期，其mRNA和蛋白质水平出现异质性：4细胞胚胎的两个胚泡球显示PRDM14 mRNA/蛋白质表达，而其余两个胚珠没有或极低表达；不幸的是，这两组细胞是否是姊妹对尚未被检测。通过微量注射项目14mRNA增加了注射卵裂球中H3R26me的水平，其子代更频繁地参与ICM，与CARM1过度表达后观察到的情况类似。然而，PRDM14的无表达或低表达是否与完整胚胎中的低H3R26me相关，以及这些异质性在4细胞期是暂时的还是在8细胞期及以后维持，尚不清楚。

OCT4（POU5F1）是参与早期发育和多能性的关键转录因子，其动力学的异质性也已被报道(图2C） ●●●●。尽管OCT4在早期卵裂球中表达均匀，但在所有卵裂球的细胞核中其运动性并不相同(Plachta等人，2011年). 因此，16细胞期的外细胞比内细胞具有更高的OCT4运动能力。OCT4活力低下可能是由于OCT4与DNA结合所致；缺乏DNA结合同源结构域的OCT4的截短突变形式仅显示出高运动性(Plachta等人，2011年;Kaur等人，2013年). 令人惊讶的是，在4细胞和8细胞胚胎的卵裂球中已经可以区分OCT4运动能力的高低(Plachta等人，2011年). 在8细胞胚胎中，OCT4活力低的卵裂球在8至16细胞分裂期间倾向于不对称分裂（71%不对称分裂），而OCT4活性高的卵裂片倾向于对称分裂（18%不对称分裂）。因此，上述谱系追踪研究中早期卵裂球的谱系贡献偏斜可能是某些卵裂球对称分裂频率偏倚的结果，这限制了它们参与ICM的机会。OCT4运动性是否与PRDM14的表达或H3R26me的水平相关仍是一个令人着迷的问题。

最近的单细胞转录组学研究也强调了早期卵裂球中基因表达的异质性(Biase等人，2014年;邓等人，2014;Piras等人，2014年;Shi等人，2015). 早在2细胞期就观察到基因表达异质性。由于合子转录开始于小鼠胚胎的晚期2-细胞期之后，这种异质性被认为是由于早期细胞分裂期间发生的“分割错误”，即在分裂期间mRNA的不均匀分布造成的。进一步研究表明，低水平表达的基因更容易受到这种分割错误的影响(Biase等人，2014年). 此外，尽管数十个蛋白编码基因在姐妹卵裂球中的表达水平上显示出可重复的双峰模式（即一个高表达，另一个低表达），但一些双峰表达基因与其他基因显示出相关或反相关，这表明异质性不是由随机转录噪声引起的。例如，8细胞胚胎中的大多数卵裂球主要由汽车1或通过Cdx2(Shi等人，2015).这种异质性是否足以控制随后的细胞行为需要在未来进行测试。

尽管上述研究表明早期卵裂球在分子上是异质性的，但值得注意的是，这些研究大多是描述性的，只有少数研究在相关的过表达实验中测试了异质性的重要性(Plachta等人，2011年;Torres-Padilla等人，2007年;Burton等人，2013年). 此外，这些异质性尚未得到其他实验室的独立确认，可能是由于技术困难或小鼠菌株的潜在差异。此外，无论异质性模式是在所有胚胎中还是仅在胚胎的一个子集中都是可复制的，还没有得到充分的探索。单个胚胎可能在其表现出的异质性程度、模式和多样性方面是独特的。直接监测活胚胎中的这种异质性(Plusa等人，2005年;Dietrich等人，2015年;Xenopoulos等人，2015年)开发更复杂的基因操作策略对于全面了解早期卵裂球异质性的功能后果至关重要。

在8细胞阶段，发生了两个关键的形态发生过程：压实和极化。早期的8细胞卵裂球是球形的，在压实之前在形态上可以区分。通过压实，它们相互压扁，使胚胎的总表面积最小化，使每个卵裂球在形态上无法区分(Ducibella和Anderson，1975年). 研究表明，E-钙粘蛋白和β-连环蛋白对致密化和胚泡形成至关重要(Ducibella，1980年;Hyafil等人，1980年;Shirayoshi等人，1983年;Larue等人，1994年;de Vries等人，2004年). 胚胎完全缺乏E-cadherin编码基因加拿大存托凭证1可以指定TE谱系，但不能形成TE上皮或ICM(de Vries等人，2004年;Stephenson等人，2010年). 鉴于E-钙粘蛋白在细胞粘附中起作用，经典观点认为压实是由细胞粘附的变化启动的，以增加细胞间的接触(图3A） ●●●●。尽管发生这种情况的确切细胞机制尚不清楚，但最近的两项研究已开始阐明我们对压实过程的看法(图3A） ●●●●。利用8细胞胚胎的实时成像技术，一项研究发现CDH1依赖性丝状体的形成与细胞扁平化密切相关(Fierro-González等人，2013年). 这项研究还表明，肌球蛋白X的过度表达足以触发CDH1依赖性丝状伪足的形成，从而诱导4细胞期的早熟致密化。激光烧蚀这些丝状伪足可以阻止卵裂球变平，从而阻碍致密化，这表明丝状伪劣在致密化过程中产生机械力改变细胞形状。相比之下，另一项研究表明，压实主要是由细胞-介质界面（即胚胎表面）张力的增加驱动的(Maìtre等人，2015年)与先前的模型不同，该模型假设粘附分子产生驱动压实的初始力。相反，这项研究表明，CDH1介导的细胞与细胞接触可以阻止细胞与细胞之间接触时表面收缩性的增加(图3A） 以便于压实(Maìtre等人，2015年).

在8细胞期，卵裂球也发生极化，从而建立顶端结构域。来自8细胞胚胎的胚泡可以在没有细胞间接触的情况下极化，这与组织培养细胞形成鲜明对比(Johnson和Ziomek，1981年b;Stephenson等人，2010年;Anani等人，2014年). 顶端结构域富含微绒毛、F-actin和进化上保守的顶端蛋白复合物，其中包含PAR3（PARD3）、PAR6（PARD6）和非典型蛋白激酶C（aPKC）(Yamanaka等人，2006年). 这种顶端蛋白复合体在卵裂球顶端结构域的形成中起着重要作用(Plusa等人，2005年;Alarcon，2010年). Rho GTPase活性和微管动力学也是启动顶端结构域形成所必需的，但它们如何与顶端蛋白复合体联系尚不清楚(Clayton等人，1999年;Houliston等人，1989年;Kono等人，2014年).

在极化和致密化后，8细胞胚胎中的每个卵裂球可以对称分裂（这样两个子细胞继承部分顶端结构域，形成两个极性细胞），也可以不对称分裂（这样只有一个子细胞继承顶部结构域，产生一个极性和一个非极性细胞。虽然最初对分离的8细胞卵裂球的研究将分裂类型定义为顶端结构域的遗传(Johnson和Ziomek，1981年，b条)由于当时在分裂后鉴定姊妹对的技术限制，未在完整胚胎中直接检查。由于顶端结构域形成于胚胎表面，因此简单地提出，分裂角度调节顶端结构域的遗传，从而调节子细胞的命运，即如果分裂是平面的，沿着胚胎表面排列，那么它将是对称的，而如果它是正交的，那么除法将是不对称的(约翰逊和麦康奈尔，2004年;Yamanaka等人，2006年). 利用实时成像显微镜技术，最近的几项研究检查了分裂角和细胞位置之间的关系(萨瑟兰等人，1990年;Watanabe等人，2014年;McDole等人，2011年;Yamanaka等人，2010年). 这些研究的总体结论是，完整胚胎的分裂角不仅是平面或正交的，而且相对于胚胎表面也是倾斜的，因此不是对称分裂与不对称分裂或最终细胞位置的简单预测。

有趣的是，在8细胞分裂后放置在胚胎表面的一些细胞可以内化到内部位置(萨瑟兰等人，1990年;Watanabe等人，2014年;McDole等人，2011年;Yamanaka等人，2010年). 最近，两项研究表明，这种内在化是由活跃的细胞行为介导的(Anani等人，2014年;Samarage等人，2015年). 一项研究集中于8细胞分裂后顶端结构域的遗传，并证明在完整胚胎或分离的卵裂球中，外层非极性细胞实际上是内部化的，而不是采用极性(Anani等人，2014年). 在外胚层细胞的非接触表面观察到磷酸肌球蛋白的富集，这表明内化过程是由皮质肌动球蛋白收缩力的增加调节的。第二项研究直接观察了完整胚胎的内化过程，并证明了顶端收缩是这种内化的驱动力，尽管内化细胞的身份没有明确规定(Samarage等人，2015年). 总之，这些研究表明，在这种情况下，对称/非对称分裂应通过顶端结构域的遗传而不是分裂角度来定义，外无极细胞非接触表面的顶端收缩引发无极细胞内化，从而建立极/无极细胞的内外构型(图3B） ●●●●。

最后，虽然很明显，不对称分裂的频率决定了胚胎中TE/ICM细胞的比例，但这种频率是如何调节的尚不清楚。在8到16个细胞的转变过程中，不对称分裂的频率变化很大(弗莱明，1987年;Anani等人，2014年). 在一些8细胞胚胎中，所有卵裂球不对称分裂，在16细胞期产生8个极性细胞和8个非极性细胞(Anani等人，2014年)而其他胚胎可能只表现出一到两次不对称分裂。在孤立或成对的8细胞卵裂球中，频率可以改变(Johnson和Ziomek，1981年;约翰逊等人，1986年;Pickering等人，1988年)，建议对不对称分割和对称分割之间的选择进行上下文相关的调节（例如通过细胞间接触），而不是预先确定的。各种相互依赖的因素，如顶端结构域的大小、核位置和细胞间的接触，似乎也会影响不对称分裂的频率(Johnson和Ziomek，1983年;约翰逊等人，1986年;Anani等人，2014年;Ajduk等人，2014年). 有趣的是，众所周知，胚胎具有补偿机制：如果在8到16细胞的转变过程中不对称分裂的数量较低，那么在下一次分裂中，更多位于16细胞阶段的外部细胞不对称分裂，以补偿内部细胞的数量(弗莱明，1987年). 因此，不对称分裂频率的调节以及胚胎内细胞数量的随后调节是未来研究的开放性问题。

CDX2是一种在TE中特异表达的关键转录因子，对功能性TE的形成至关重要(Strumpf等人，2005年). 在Cdx2合子突变体，形成形态正常的早期囊胚，ICM特异基因，如10月4日和纳米在TE中外显表达，提示CDX2依赖性转录抑制10月4日和纳米此外，CDX2在早期TE形成期间直接与OCT4相互作用以抑制其转录活性(Niwa等人，2005年). 由于CDX2在胚胎干细胞（ESCs）中的过度表达足以将其转化为滋养层干细胞，许多研究旨在确定是什么控制CDX2的表达。

顶端结构域的存在与CDX2表达增强密切相关(Ralston和Rossant，2008年;Stephenson等人，2010年). 根尖定位Cdx2mRNA及其在不对称分裂期间由极性细胞进行的不对称遗传被认为与建立TE-特异性CDX2表达有关(Jedrusik等人，2010年;Jedrusik等人，2008年;斯卡马基等人，2013年). 然而，CDX2的确切作用时间尚不清楚：一些研究表明，母体CDX2是正常细胞周期进展和细胞存活所必需的(Jedrusik等人，2015年); 然而，另一项研究表明，母体CDX2对谱系规范没有明确的贡献，母体CDX2对植入前发育是不可或缺的(Blij等人，2012年). 造成这两项研究差异的原因尚不清楚，但小鼠菌株和/或在体外胚胎培养条件可能会影响他们的实验结果。

数据还表明，Hippo/YAP信号级联在TE/ICM谱系规范中起着核心作用，尤其是在TE特异性基因表达中(图4). Hippo/YAP信号级联最初在果蝇属作为一种生长控制途径，它现在被认为是哺乳动物中非常保守的途径(潘，2010年;Yu等人，2015年). 这种信号级联用于感知细胞环境，如细胞密度、位置和细胞外基质的硬度。这种信号级联在TE/ICM规范中的参与是首次在缺乏TE/ICM的胚胎中发现的Tead4公司，其编码TEAD家族DNA结合蛋白。在Tead4公司无胚胎，未形成功能性TE，CDX2表达严重下调(Yagi等人，2007年;Nishioka等人，2008年). 随后的研究表明，YAP（YAP1）作为TEAD4的转录激活剂，上调TE-特异性基因(Nishioka等人，2009年). YAP能以磷酸化依赖的方式在细胞核和细胞质之间穿梭。在TE中，YAP易位到细胞核以激活TE特异性基因，如Cdx2和加塔3(Nishioka等人，2009年;Ralston等人，2010年)而在ICM中，YAP被LATS激酶磷酸化，导致其细胞质隔离和从细胞核挤出。YAP/Hippo信号的这种差异活性只需要在短时间内建立TE和ICM中稳定、独特的基因表达模式(Lorthongpanich等人，2013年). 此外，尽管YAP/Hippo信号级联的调制足以使CDX2表达从外部TE细胞中分离出来，但它不会改变细胞位置和细胞极性状态。

最近的研究已确定NF2（Merlin）在确定TE命运中的作用，NF2是河马路径的另一个组成部分。NF2是一种FERM域蛋白，作用于LATS激酶上游，如果蝇属(Maitra等人，2006年;Hamalatoglu等人，2006年). 母体合子编号2突变胚胎、核YAP定位和CDX2表达不仅限于外/TE细胞，而且在内/ICM细胞中也很明显(Cockburn等人，2013年). 尽管NF2均匀分布在所有细胞的细胞皮层/膜上，但只有在内部/ICM细胞中才有必要激活Hippo信号，即YAP磷酸化。

类似地，连接相关支架血管生成素（AMOT）家族蛋白也需要在内部/ICM细胞中激活Hippo信号，但在外部/TE和内部/ICM中显示出不同的亚细胞定位(Hirate等人，2013年;Leung和Zernicka-Goetz，2013年). 在外/TE细胞中，AMOT定位于顶端结构域，但被排除在基底外侧结构域之外，而在内细胞中，AMOT的丝氨酸176（S176）被磷酸化，并且AMOT分布在整个质膜上(Hirate等人，2013年). S176上AMOT的磷酸化阻止其与F-actin的结合在体外组织培养细胞中的生化检测(Mana-Capelli等人，2014年;Chan等人，2013年). 研究还表明，AMOT的一种磷酸类似物形式作为组成活性形式分布在细胞质中，具有强烈的点状信号，而非磷酸化形式的AMOT与富集的F-actin共定位，激活Hippo信号的能力很弱(Hirate等人，2013年). S176磷酸化增强AMOT与LATS激酶的相互作用以促进YAP磷酸化。这些结果表明，在外细胞中，AMOT被隔离在顶端结构域，而内细胞中的S176磷酸化AMOT可以在细胞-细胞连接处与LATS激酶（可能与NF2）形成活性复合物。

有趣的是，YAP/Hippo信号级联不仅调节TE特异性基因，还调节SOX2的ICM限制表达，SOX2是最早的内细胞标记物之一。事实上，阻止YAP核在外TE细胞中定位足以诱导异位SOX2表达(Wicklow等人，2014年). TE中SOX2表达的抑制与CDX2无关，因此与NANOG和OCT4的调节不同(Strumpf等人，2005年). 这表明YAP在外细胞中激活了一种独特的抑制机制，用于调节SOX2的表达(Wicklow等人，2014年).

虽然Hippo/YAP信号级联似乎在TE/ICM规范中起着核心作用，但在以下情况下，可以绕过TE形成期间对TEAD4的要求Tead4公司空胚在低氧条件下培养₂减少氧化应激并模拟体内形势(Kaneko和DePamphilis，2013年). 这表明YAP可以有不同的DNA结合伙伴来激活靶基因(Imajo等人，2015年)或者并行信号级联可以补偿低O时TEAD4的损失₂条件。TE-特异性增强子的分析Cdx2揭示了Notch信号传导与Hippo/YAP信号传导协同作用(Rayon等人，2014年)用于完全激活Cdx2表达式。研究Notch信号是否可以补偿低O时的TEAD4功能将很有趣₂条件或是否涉及其他机制。

ICM细胞内化后不久，分化为EPI和PE谱系。这是一个多步骤的过程，从二元EPI/PE规范开始，然后是谱系成熟（即在每个谱系内建立特定的基因网络和分化）和细胞分选，形成两个不同的隔室——EPI簇和PE上皮。

转录因子NANOG和GATA6分别是EPI和PE的最早标记(Chazaud等人，2006年;Kurimoto等人，2006年). 两者都存在于8细胞期的所有卵裂球中，但从～32细胞期开始，ICM细胞选择表达NANOG，导致EPI命运，或GATA6，导致PE命运(Plusa等人，2008年;郭等，2010). 这导致NANOG和GATA6在胚胎期（E）3.75出现相互排斥的“盐和胡椒”表达模式。细胞谱系追踪和活细胞追踪分析(Chazaud等人，2006年;Kurimoto等人，2006年;Plusa等人，2008年;Meilhac等人，2009年;Xenopoulos等人，2015年)表明该过程在单个ICM细胞中异步发生，范围从～E3.0-E3.75(Gerbe等人，2008年;Plusa等人，2008年;Bessonnard等人，2014年). 因此，在一些胚胎中，仍然可以在~E3.75处鉴定出一些共表达这两种转录因子的细胞，并且NANOG的出现⁺/GATA6协议⁻EPI细胞是目前已知的规范过程的第一个标志。

自纳米和Gata6公司从8细胞期开始表达水平相对较高(郭等，2010)控制规范过程的机制可能通过选择性mRNA衰变而不是通过选择性增加转录来起作用。事实上，在蛋白质水平上，EPI/PE规范可以通过一种转录因子的增加表达和另一种转录因素的衰退相结合来可视化(郭等，2010;Bessonnard等人，2014年)揭示了RNA和蛋白质之间略有不同的动力学。然而，两种转录因子之间的相互抑制似乎也存在：Gata6公司突变体，所有ICM细胞一致表达NANOG，无任何PE标记，表明获得EPI命运(Bessonnard等人，2014年;Schrode等人，2014年)相反，在纳米突变体所有ICM细胞都表达GATA6(Frankenberg等人，2011年). NANOG和GATA6可能会直接抑制彼此的转录，正如ESCs染色质免疫沉淀研究中确定的它们的结合位点所表明的那样(Singh等人，2007年)和诱导的胚胎外内胚层（iXEN）细胞(Wamaitha等人，2015年).

一系列研究表明，FGF信号在PE谱系形成过程中起着重要作用(图5A） ●●●●。Fgf4型在胚泡形成过程中特异性标记EPI细胞(Kurimoto等人，2006年;郭等，2010;Frankenberg等人，2011年;Ohnishi等人，2014年)并且不表示为纳米突变体(Frankenberg等人，2011年).第二层在E3.5限制PE细胞之前，E3.25在所有早期ICM细胞中表达，表明所有早期ICM细胞都能够对FGF配体作出反应(Ohnishi等人，2014年;Boroviak等人，2015年). 阻断FGF信号足以使所有ICM细胞接受EPI命运(Chazaud等人，2006年;Nichols等人，2009年;Yamanaka等人，2010年;Kang等人，2013年;Krawchuk等人，2013年)而添加过量的FGF4足以将所有ICM细胞分化为PE(Yamanaka等人，2010年). 有趣的是，GATA6一直表达到胚胎早期Fgf4型突变体(Kang等人，2013年;Krawchuk等人，2013年)这意味着FGF4是盐和胡椒图案所必需的，但其他因素调节GATA6的初始表达。此外，给予FGF4可以在没有GATA6的情况下抑制NANOG的表达(Bessonnard等人，2014年)而阻断FGF信号可以在没有NANOG的情况下抑制GATA6的表达(Frankenberg等人，2011年). 然而，这些抑制必须在NANOG和GATA6开始表达之前启动，即在压实阶段前后，因为它们的表达在后期变得不敏感(Frankenberg等人，2011年;Bessonnard等人，2014年;Schrode等人，2014年). 总之，这些发现强调了FGF信号、NANOG和GATA6形成了一个驱动规范过程的监管网络。因此，ICM内EPI/PE单元的比例由单个单元中网络组件的相对水平调节(Yamanaka等人，2010年;Kang等人，2013年;Krawchuk等人，2013年;Bessonnard等人，2014年;Schrode等人，2014年;Schröter等人，2015年). 例如，降低Fgf4型表达增加了NANOG表达的EPI细胞的数量(Kang等人，2013年;Krawchuk等人，2013年). 在Gata6公司杂合胚胎，指定的PE细胞数量减少，并由同等数量的EPI细胞进行补偿(Bessonnard等人，2014年;Schrode等人，2014年).Gata6公司杂合子胚胎也表现出EPI细胞的早熟特性，这可能是由于对纳米表达式(Bessonnard等人，2014年;Schrode等人，2014年)，虽然只删除了纳米不影响PE/EPI规范(Frankenberg等人，2011年;Miyanari和Torres-Padilla，2012年）。最近，一项研究使用在体外可调谐的GATA表达系统也揭示了PE命运的GATA剂量依赖性二元选择(Schröter等人，2015年).

EPI/PE基因调控网络最近被转换为一个数学模型(Bessonnard等人，2014年)研究如何在ICM中建立互斥的盐和胡椒模式。该模型考虑了NANOG和GATA6的相互抑制与自激活耦合，以及FGF信号在抑制NANOG的同时正向调节GATA6。在这些初始设置条件下，该模型足以概括体内发展过程。模拟结果表明，ICM早期的一个或几个细胞促进NANOG表达，导致FGF4分泌增加。这种较高的细胞外FGF4局部浓度在邻近细胞中诱导PE命运，表明单个ICM细胞可以根据其局部FGF4浓度异步采用EPI或PE命运。因此，在胚胎中观察到的非同步EPI/PE规范事件可以用FGF4旁分泌活性的异质繁殖来解释。此外，ICM细胞在E3.25均表达FGFR2(Ohnishi等人，2014年)这表明ERK（MAPK）活性的差异是由局部FGF4可用性的差异引起的，随后通过NANOG介导的EPI细胞中FGFR2的下调而放大。基于在体外食管鳞癌中GATA异位表达系统(Schröter等人，2015年). 该模型考虑了NANOG和GATA6的相互抑制，但没有正反馈执行回路，以及FGF信号对NANOG表达的唯一抑制。事实上，在这个ESC系统中Gata6公司转录报告基因对GATA4诱导的ERK抑制不敏感(Schröter等人，2015年). 因此，确定FGF4在RNA和蛋白质水平上是仅作用于NANOG还是也作用于GATA6表达将是一件有趣的事情体内.

两个数学模型都预测，一旦ICM细胞做出选择，它们在完整胚胎中的命运不会改变(Bessonnard等人，2014年;Schröter等人，2015年). 这是细胞谱系追踪实验之前提出的(Chazaud等人，2006年;Meilhac等人，2009年)并通过使用纳米-GFP公司记者(Xenopoulos等人，2015年). 然而，有趣的是，它显示了(Xenopoulos等人，2015年)一些细胞表达低水平的纳米GFP直到相对较晚的囊胚期可以强烈上调纳米GFP最终表达，暗示命运逆转。本研究未检测NANOG和GATA6的相对水平，重要的可能是这两种转录因子之间的平衡，而不是它们的绝对量。因此，尚不确定这些细胞是否真的经历了命运逆转或对应于在～E3.75之前表现出低NANOG水平的晚期指定细胞(Bessonnard等人，2014年). 还应该注意的是，尽管大多数ICM细胞是由E3.75指定的，但它们仍然保持可塑性，通过调节FGF信号传导而转变为另一种命运(Nichols等人，2009年;Yamanaka等人，2010年)或者通过细胞移植改变它们的邻居(Grabarek等人，2012年). 这种可塑性在～E4.0时异步消失(Yamanaka等人，2010年;Grabarek等人，2012年)并首先在EPI细胞中丢失(Grabarek等人，2012年)，可能反映了他们早期的规范(Bessonnard等人，2014年).

尽管对FGF-NANOG-GATA6网络有这些见解，但引发ICM细胞早期差异的事件尚不清楚。ICM细胞中最早观察到的异质性是双峰的Fgf4型E3.25时的表达(Kurimoto等人，2006年;郭等，2010;Ohnishi等人，2014年). 已经提出了几个假设来解释这种盐和胡椒模式的诱导（由Hermitte和Chazaud，2014年)：（1）FGF分泌和信号的细胞间差异增强了基因表达的随机激活(迪特里希和希拉吉，2007年;Ohnishi等人，2014年); （2） 少数细胞中磷酸化ERK减少或其他因子的存在/缺失促进NANOG表达，促进FGF4分泌(Bessonnard等人，2014年); （3） 细胞分裂历史偏差，基于第二层表达式(莫里斯等人，2010年，2013;Mihajlović等人，2015年)或表达FGF4的内细胞聚集(Krupa等人，2013年). 这些假设中没有一个被抛弃或赞成；然而，模拟所有核心因子的高转录噪声的数学模拟表明，这种内部噪声不太可能是启动机制(Bessonnard等人，2014年;DeMot等人，2016年). 因此，虽然已知最初的步骤是一个或几个ICM细胞在～E3.0时参与EPI命运，但始终先于其他细胞的PE规范(Bessonnard等人，2014年;Xenopoulos等人，2015年)，我们仍然不知道为什么FGF4和/或NANOG的表达仅在少数ICM细胞中增加。

规范后，PE细胞打开成熟的PE标记，如SOX17、GATA4、DAB2和PDGFRα。在这个阶段，任何减少PE细胞数量的实验条件或操作都不会被EPI细胞的增加所补偿，反之亦然，因为EPI和PE细胞都已经被指定，即它们的命运已经“锁定”。许多研究表明，尽管GATA6在PE规范中起着关键作用，但在PE成熟的后续阶段，它似乎与其他信号因子和途径协同作用(图5A） ●●●●。例如，尽管GATA6在以下所有ICM细胞中表达纳米突变胚胎，SOX17和GATA4的表达严重下调(Mitsui等人，2003年;Silva等人，2009年;Messerschmidt和Kemler，2010年)证明仅表达GATA6不足以启动PE成熟。SOX17和GATA4的下调可能是由于FGF4的可用性降低(Messerschmidt和Kemler，2010年;Frankenberg等人，2011年). 的确，Fgf4型在纳米突变的EPI细胞和补充FGF4可以挽救SOX17和GATA4的表达(Frankenberg等人，2011年). 因此，无论是PE的初始规范，还是NANOG和GATA6之间的平衡，还是其进一步成熟，都需要FGF信号。这两个步骤是相伴的还是连续的？目前还没有明确的答案，但这提出了一个问题：纳米无效胚胎应被视为PE细胞或缺乏NANOG表达且仅表达GATA6的祖细胞。此外，FGF4给药不能诱导SOX17和GATA4在Gata6公司突变体(Bessonnard等人，2014年;Schrode等人，2014年)强调FGF信号的激活和GATA6的表达是成熟PE标记表达所必需的。

另一种EPI特异性标记物SOX2对PE成熟也是必需的，但EPI/PE规范不需要。的确，Sox2系统突变胚胎能够以正确的比例生成NANOG表达细胞和GATA6表达细胞；然而，GATA6表达水平较低，在E3.75表达SOX17的细胞较少(Wicklow等人，2014年). 到E4.25，SOX17表达细胞的数量恢复，这表明SOX17在这些突变体的PE细胞中的表达只是延迟了。给予FGF4可以挽救这种表型，这意味着FGF4在Sox2系统突变体。这些突变体中SOX17的延迟表达可能是FGF4缓慢积累的结果，FGF4最终达到诱导SOX17所需的水平。这也可能是由于GATA6的低水平，其表达需要FGF4维持在高水平。Sox2系统空白胚胎也说明了PE分化的顺序步骤，从PE规范（NANOG的下调）开始，然后是PE成熟（PE特异基因的诱导，如索克斯17).

多能性因子OCT4在ICM细胞中均匀表达，但随后在～E4.5的PE细胞中下调，而在EPI细胞中维持到原肠胚形成期间分化。OCT4需要维持ESC的多能性并防止其分化为TE，而高水平的OCT4可以促进ESC分化为PE(Niwa等人，2000年). 在10月4日突变胚胎、NANOG表达细胞和GATA6表达细胞以正确的比例出现，但GATA6的表达没有得到维持，并且很少有细胞表达SOX17，部分原因是FGF4的产生受损(Frum等人，2013年;乐斌等，2014). SOX2-OCT4复合物可直接激活Fgf4型表达在体外(Ambrosetti等人，2000年)强调SOX2、OCT4和NANOG之间的合作，以生成足够的FGF4，以便在时间和数量上正确生产成熟PE细胞。此外，嵌合体实验表明，通过维持SOX17和SOX7的表达，OCT4是细胞自主维持PE细胞所必需的。令人惊讶的是，给予FGF信号抑制剂或FGF410月4日突变体分别无法抑制GATA6或NANOG的表达(Frum等人，2013年). 由于OCT4可以被ERK磷酸化(Brumbaugh等人，2012年)很容易推测磷酸化的OCT4会阻止PE细胞中NANOG的表达，而非磷酸化的OPT4会抑制EPI细胞中的GATA6。因此，OCT4将与FGF信号合作，自动增强每个谱系的身份(图5A）(Frum等人，2013年). OCT4与SOX2或SOX17的伙伴关系也证明了这一点，以每个谱系中的特定基因为靶点(Aksoy等人，2013年).

BMP是另一种参与早期谱系分化的信号通路。BMP4在早期胚泡的EPI中表达(库库瓦尼斯和马丁，1999年;郭等，2010;Graham等人，2014年;Boroviak等人，2015年). 在2细胞期的一个卵裂球中，BMPR2显性负性形式的过度表达降低了该卵裂球子代的PE贡献。用特定抑制剂（如NOGGIN和多索吗啡）阻断BMP信号传导，可通过细胞死亡严重减少PE细胞数量(Graham等人，2014年). 由于NANOG表达细胞的数量没有改变，EPI/PE规范没有受到影响，这表明在这种情况下，指定PE细胞的存活存在缺陷。PE中的细胞存活似乎也受PDGF信号的控制。最近的单细胞转录组分析表明，与FGF4和BMP4一样，PDGFA是由EPI细胞特异性产生的(Boroviak等人，2015年). 相反，PDGFRα在PE细胞中特异表达，其缺失导致PE细胞死亡(Artus等人，2013年).

总之，这些研究强调了几种信号通路与PE的成熟和存活有关，并且似乎同时起作用，可能提供稳健性。此外，尽管其中一些途径影响细胞存活，但细胞死亡在多大程度上积极促进谱系分化仍不清楚。植入前很少发生凋亡，但在～E3.75-E4.0的短时间窗内除外。在此期间，当细胞分选发生时（如下所述），约10%的ICM细胞被清除(El-Shershaby和Hinchliffe，1974年;科普，1978年). EPI或PE细胞后的实时成像电影显示，这两种细胞类型在此时间窗内均可发生凋亡(Plusa等人，2008年;Xenopoulos等人，2015年). 目前，由于报告系之间的不相容性，无法在单个胚胎中同时检测EPI和PE细胞，但研究单个胚胎中每个谱系的凋亡时间和比例将是一件有趣的事情。正如一个数学模型中提出的那样，死亡细胞可能是在同等水平上表达NANOG和GATA6的非特定前体细胞(Bessonnard等人，2014年). 或者，在PE和EPI分类/分离后，可能发生凋亡以消除错位的细胞(Plusa等人，2008年).

由于其特殊机制（盐和胡椒图案），EPI和PE细胞必须经过细胞分选才能形成两种不同的组织(图5B） ●●●●。这个过程还没有被很好地理解，但研究已经开始为调节排序的因素提供见解。例如，如层粘连蛋白1和IV型胶原在PE细胞中的特异性表达所示，谱系特异性转录因子已被证明可以调节细胞类型特异性的机械特性，包括粘附特性(Gerbe等人，2008年;Niakan等人，2010年). 极性的获得也可能影响细胞的位置和分类。DAB2和LRP2的顶端定位是PE细胞表面细胞极化的第一个标志(Gerbe等人，2008年). 随后观察到根尖aPKC定位(Saiz等人，2013年). 通过aPKC和DAB2通路建立细胞极性是上皮形成的必要条件，也是防止细胞重新混合的必要条件(Yang等人，2002年;Saiz等人，2013年). 因此，极性依赖性锚定机制可能导致PE细胞从EPI簇中分离(Moore等人，2009年). 然而，由于一些PE细胞需要穿过两层或三层细胞才能到达ICM表面，因此可能需要其他机制，例如定向运动，以促进分类(Meilhac等人，2009年). 事实上，混合使用未分化和分化ESC的实验表明，差异粘附可能不是细胞分选的驱动力(Moore等人，2009年). 数学模型还表明，在这种情况下，仅凭差异粘附不足以对细胞进行分类(Krupinski等人，2011年).

虽然抑制微管活性并不能阻止分选，但细胞松弛素D处理会影响肌动蛋白聚合，会干扰细胞运动(Meilhac等人，2009年). 肌动蛋白网络是皮层张力的主要贡献者，皮层张力可能因细胞类型而异，并产生细胞分选，如斑马鱼所示(Krieg等人，2008年). 分选的方向性可能受到胚泡腔和极性TE之间的压差的影响，这将促进弹性较大或粘附性较小的细胞向最低张力极移动(Krupinski等人，2011年). 因此，由于皮层张力和/或差异粘附导致的细胞分选，结合通过细胞极化进行的上皮锚定，可以提供一个工作模型来解释胚泡发育过程中的细胞分选及其维持。

尽管本综述中描述了这些进展，但我们仍不完全理解早期卵裂球中观察到的最初差异是如何出现的，它们是否能够控制随后的分子和细胞事件，以及它们是否能够调节基因表达以控制谱系规范。缺乏定型模式，以及观察到的异步性，使一些分析的解释复杂化，并对我们的理解提出了挑战。此外，不能忽视产妇的贡献。然而，越来越明显的是，小鼠植入前发育的复杂性不能仅通过简单的静态分析进行分析。理想情况下，监测活胚胎中单个细胞的转录组动力学，结合跟踪单个细胞行为，将为了解小鼠胚胎的自组织特性提供最有用的信息。虽然我们还远远没有达到这种方法，但成像技术和生物物理方法的最新发展大大增加了我们的知识。计算模拟也被证明是一种强大的方法，但需要进一步调整以考虑正在发生的分子和细胞相互作用的复杂性。将先进的新技术与传统遗传方法和胚胎操作相结合，有望将我们带到理解哺乳动物植入前发育的新水平。

我们感谢Aaron Kwang和Deepak Saini的批判性阅读和英语更正。