Nox2衍生活性氧在脓毒症后认知功能障碍发展中的作用

摘要

背景

脓毒症相关脑病（SAE）是严重感染的早期常见特征。氧化应激是SAE的病理生理机制之一。本研究的目的是研究NADPH氧化酶在神经炎和脓毒症幸存者长期认知功能障碍中的作用。

方法

WT和gp91中诱导败血症^{凤凰（phox）}敲除小鼠（gp91^{凤凰（phox）-/-})盲肠结扎穿孔（CLP）诱发粪便性腹膜炎。我们测量了氧化应激，否2和第4个脓毒症后6小时、24小时和5天海马的基因表达和神经炎症。小鼠还接受了一种NADPH氧化酶抑制剂——罗布青素的治疗。在败血症后15天，用抑制性回避试验和Morris水迷宫对对照和罗布麻素处理的WT小鼠的行为结果进行评估。

结果

海马的急性氧化损伤可通过4-HNE表达的增加以及否2脓毒症后的基因表达。用罗布青素对Nox2进行药理学抑制可完全抑制脓毒症动物的海马氧化应激。药物抑制或gp91中无Nox2^{凤凰（phox）-/-}小鼠阻止了胶质细胞激活，这是与SAE相关的中枢机制之一。最后，在败血症急性期用罗布麻素治疗和抑制海马氧化应激可以防止长期认知障碍的发展。

结论

我们的结果表明，Nox2是参与SAE海马氧化损伤的活性氧（ROS）的主要来源，而Nox2衍生的ROS是脓毒症后认知损伤的决定因素。这些发现突出了Nox2衍生活性氧作为SAE相关神经炎症发展的中心机制的重要性。

介绍

脓毒症和全身炎症影响脑功能的临床观察并不新颖[1——三]. 然而，直到最近才证明急性脑功能障碍是脓毒症患者发病和死亡的独立原因[4]. 急性脑功能障碍的存在是脓毒症幸存者长期认知功能障碍的决定因素。临床研究表明，高达60%的脓毒症幸存者表现出永久性认知缺陷和记忆丧失[5].

脓毒症相关脑病（SAE）及其对认知功能的长期影响尚不清楚。相关临床前模型的使用有助于阐明中枢机制，如线粒体和血管功能障碍、神经传递障碍、炎症和细胞死亡[6——8]. 一些研究涉及实验性脓毒症中活性氧（ROS）的参与、抗氧化能力的降低和氧化应激标记物的积累[9——11]和患者[12——17]. 线粒体是细胞内活性氧的主要来源，最近的研究支持线粒体活性氧对免疫细胞功能的重要性[18,19]. 然而，线粒体产生活性氧的程度体内仍有争议[20]. 脑中ROS的另一个主要来源是NADPH氧化酶。

NADPH氧化酶是一类通过分子氧还原产生ROS（O2·-）的酶[21,22]. NADPH氧化酶家族的成员包括Nox1至5以及双氧化酶1和2（Duox 1和Duox 2）。在神经系统中，主要的亚型是Nox1、Nox2和Nox4[23]. 这些亚型已在不同类型的细胞中鉴定出来，包括神经元、内皮细胞和胶质细胞[24]. 此外，NADPH氧化酶亚型被各种刺激物激活，包括损伤相关和病原体相关分子模式（DAMP和PAMP）、炎症介质和神经毒素。依赖NADPH氧化酶产生O2^·-已被确定为脑缺血脑损伤的主要原因[25——27]，兴奋毒性[28]阿尔茨海默病、帕金森病和其他神经系统疾病[29].

在这里，我们探讨了NADPH氧化酶在SAE病理生理学不同方面的作用。我们研究了NADPH氧化酶在神经炎和脓毒症幸存者长期认知功能障碍中的作用。我们的方法包括用罗布青素对NADPH氧化酶活性的药理抑制，以及使用基因缺陷（敲除）小鼠治疗gp91^{凤凰（phox）}（gp91^{凤凰（phox）-/-})，Nox2的催化亚单位。我们确定Nox2是SAE中胶质细胞激活的必要步骤，也是脓毒症幸存者氧化应激和认知功能障碍的主要来源。

材料和方法

动物

成年雄性C57BL/6（野生型（WT））（8至10周龄，25至30 g）从奥斯瓦尔多·克鲁兹基金会（FIOCRUZ）和圣保罗大学生物医学科学研究所育种单位获得。集团91^荧光粉-/-小鼠取自Jackson Laboratories（美国缅因州巴尔港）。这些动物可以自由获得食物和水，并在12:12小时的光-暗循环中进行饲养。实验对象是年龄和体重匹配的动物。所有程序均由圣保罗大学生物医学科学研究所和巴西里约热内卢FIOCRUZ的机构动物护理委员会批准。

脓毒症模型

脓毒症是由盲肠结扎和穿刺（CLP）引起的，如前所述，这一过程会产生急性多菌性腹膜炎[30]. 用氯胺酮（100 mg/kg）和甲苯噻嗪（10 mg/kg）腹腔注射（ip）麻醉小鼠，并在腹部开一个1 cm的切口。盲肠暴露并结扎在回盲连接处下方。使用22号针头进行双重穿刺，以诱发轻度脓毒症。假手术动物（对照组）接受了相同的剖腹手术，但没有CLP。或者，通过ip注射粪便浆液诱发实验性脓毒症，这会诱发急性多菌性腹膜炎和类似CLP的脓毒症综合征。两种模型在死亡率、血液细胞因子和神经炎症方面显示出相似的炎症反应特征（数据未显示）。选择腹腔内注射粪便浆液模型进行行为研究，以避免手术和使用可能影响脓毒症所致认知损伤通路的麻醉剂。所有小鼠在脓毒症诱导后6小时开始接受皮下注射厄他培南或美罗培南（20 mg/kg）的抗生素治疗（美国新泽西州怀特豪斯站默克研究实验室），然后每12小时注射一次，直到第四天。脓毒症诱导后，动物接受1ml无菌盐水皮下注射（sc）作为液体复苏。

Apocynin治疗

Apocynin已被广泛用作抑制NADPH氧化酶活性的药理工具[31,32]. 其作用机制包括阻断细胞溶质亚单位p47的移位^{凤凰（phox）}到质膜，从而抑制Nox2激活[33]. Apocynin治疗在一些炎症疾病模型中显示了抗炎作用，例如类风湿关节炎[34]、帕金森氏病[32]、肌萎缩侧索硬化[35]和脑缺血[36]以及我们的脓毒症模型（数据未显示）。为了了解Nox2衍生ROS在海马胶质细胞激活中的作用，在败血症诱导前30分钟向WT小鼠注射20 mg/kg的罗布青素（西格玛-阿尔德里奇，圣路易斯，密苏里州，美国）。在败血症后6小时、24小时和5天收集组织样本，进行免疫印迹、免疫组织化学和实时PCR分析。为了测试Nox2抑制对行为结果的影响，在脓毒症发作后1小时以及脓毒症发生后6、24和48小时，给假小鼠和脓毒症小鼠服用5 mg/kg的罗布青素sc。Apocynin对治疗小鼠的死亡率或严重程度评分没有影响（数据未显示）。

实时PCR

将来自假手术（n=8）和脓毒症（n=8）小鼠的海马在1ml三唑（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）中直接匀浆，并按照制造商建议的方案分离总RNA。使用科贝特研究系统（澳大利亚悉尼科贝特生命科学公司）执行、记录和分析PCR反应。熔点分析证实了SYBR®绿色分析的特异性。使用ΔCt法从周期阈值（Ct）值计算表达数据以进行量化[37]. 使用GAPDH mRNA的基因表达（意义：5′-GTGGCAGTGCCAGCCTCTCC-3′；反义：5′-CAGGCCCAATACGCCAA-3′）进行归一化。结果以增加百分比表示。本研究方案中使用的所有寡核苷酸和试剂均从美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市英维特罗根购买。使用的序列为：否2（意义：5'-TCAAGACACATTGCAAGGAACAC-3'；反义：5'-TCAGGGCACACAGGAAAA-3'）和第4个（意义：5'-TGGGCGTTCCTCGGTGGAAAACT-3'；反义：5'-TGGGTCCACAGAAACTCA-3'）。

氧化应激的测量

通过4-羟基壬醛（组织氧化应激的标志物）的Western blotting评估氧化应激[38]. 用异氟醚对小鼠进行深度麻醉；在脓毒症诱导后的不同时间点采集海马，并立即冷冻于干冰中。组织在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒（Complete，Roche，Indianapolis，in，USA）的冰镇Tris–HCl缓冲液中均质。使用BCA蛋白质分析试剂盒（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科学公司）测量蛋白质浓度。在聚丙烯酰胺4至15%梯度凝胶中进行蛋白质电泳（Pre-cast、BioRad、Hercules、CA、USA），并将蛋白质转移到PVDF Immobillon-FL膜（Millipore，MA，USA）。用Odyssey Blocking Buffer试剂（Li-Cor Biosciences，Lincoln，NE，USA）封闭膜，并用小鼠单克隆抗体抗HNE（1:500，Abcam，Cambridge，MA，USA，）和兔多克隆抗亲环素B（1:5000；Pierce Biotechnology，Inc.Rockford，IL，USA；后者被用作其他地方描述的加载控制[39]. 用PBS清洗后，用IRDye二级抗体（Li-Cor Biosciences）培养细胞膜一小时。使用奥德赛红外成像系统（美国东北部林肯市Li-Cor Biosciences）对免疫反应性进行可视化。该系统允许使用不同物种的初级抗体对一个膜中的抗原进行多重检测，而无需膜剥离。

免疫组织化学

用异氟醚对小鼠进行深度麻醉，然后用生理盐水经心灌注，然后用4%的多聚甲醛（PFA）溶解在pH 7.4的0.1 M PBS中。收集大脑，在PFA中后固定过夜，并转移到20%蔗糖溶液中48小时，以确保冷冻保护。为了进行胶质细胞形态学研究，在低温恒温器（德国莱卡微系统公司，型号CM1850）中获得大脑切片（40μm），并将其漂浮在PBS中。切片与含有0.3%Triton X-100、2%正常山羊血清和1%BSA的封闭缓冲液孵育2小时。然后用兔IgG抗电离钙结合接合器分子1（1:200；Iba1；Wako Chemicals Inc.，Richmond，VA，USA）或在封闭缓冲液中稀释的兔IgG-抗胶质纤维酸性蛋白（1:1000；GFAP；Millipore，MA，US）孵育切片过夜。在用PBS进行三次洗涤后，用二级抗体Alexa 488山羊抗兔IgG在封闭缓冲液中稀释1:1000培养切片两小时。在洗净二级抗体后，用Vectashield安装介质将切片安装在载玻片上，用4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）进行荧光（Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA）进行核染色。共焦图像是使用共焦激光扫描显微镜（德国徕卡微系统公司，型号TCS SP5 AOBS）和63x油浸物镜获得的。

为了进行定量研究，将30μm的脑切片与抗OX42（CD11b/c，Biosciences，San Jose，CA，USA）和抗GFAP（Immunon，Pittsburgh，PA，USA，1:1000）在含有0.05%正常山羊血清的0.3%Triton X-100中自由漂浮培养12至16小时。用PBS洗涤三次，每次10分钟后，将切片与生物素化的第二抗体（驴抗小鼠IgG，Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA，USA，1:200）一起孵育两小时，然后是抗生物素-生物素复合物（1:100；ABC Elite试剂盒，Vector Labs，Burlingame，CA，USA）。清洗后，切片在PBS中与0.05%的3,3-二氨基联苯胺和0.01%的过氧化氢反应。在水中用0.05%的四氧化锇进行强化。这些部分被安装在涂胶的载玻片上，经过脱水、清理和盖上盖子。免疫染色的控制包括省略一级抗体并用其替代正常山羊血清，从而完全消除染色。使用光学显微镜对材料进行分析，并使用ImageJ软件（美国国立卫生研究院）对数字图像进行半定量分析。OX42和GFAP免疫染色根据0.4 mm内的光密度进行评估²CA1、CA3和DG区域的区域。将标记区域的平均光密度与相同截面中相邻非标记区域的均值密度进行比较，以获得反映平均信噪比的标记指数，如前所述[40].

行为测试

在脓毒症发作15天后评估行为结果。如前所述，进行了降压抑制回避试验[41]. 在训练试验中，将动物放在一个平台上，用一个自动装置测量它们用四只爪子在网格上行走的潜伏期。动物们一踏上电网，立即受到0.6毫安/3.0秒的足部电击。在训练24小时后进行保留测试，记录网格上的持续时间（截止180秒）。莫里斯水迷宫被广泛用于检测许多神经疾病模型中的学习和记忆缺陷。海马损伤导致水迷宫中空间记忆功能受损[42]. 对动物进行为期四天的60秒试验，以找到平台，并测量它们找到平台的时间。第五天，在没有平台的情况下进行试验，测量之前有平台的象限中的探索时间，并将其表示为延迟时间。

MCP-1和IL-1测量

通过ELISA法测定血浆和腹腔内单核细胞趋化蛋白（MCP）-1和IL-1的水平，评估脓毒症诱导的炎症反应。脓毒症发作6小时后，在二氧化碳室中杀死小鼠，打开腹腔并用3毫升PBS溶液冲洗。收集腹膜液以测定细胞因子水平。从外周静脉采集血液样本，并将其保存在冰上。在4°C下，通过800 g离心15分钟收集血浆，进行校准，并在-70°C下保存至分析日。所有测量均按照制造商的说明进行（研发系统Duo-set套件，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国）。

统计分析

结果显示为平均值±标准误差（SEM）。使用GraphPad Prism 3.02版（美国加利福尼亚州圣地亚哥GraphPadSoftware Inc.）生成数据的统计分析。使用方差分析（ANOVA）对两组以上患者进行统计比较，并由Mann-Whitney进行分析U型-测试或Kruskal-Wallis测试。在所有情况下，P（P） ≤ 0.05被认为具有统计学意义。

结果

海马体中的氧化应激与否2表达

为了评估脓毒症小鼠海马的氧化损伤，我们测量了脂质过氧化副产物4-羟基壬醛（4-HNE）的表达。我们观察到脓毒症后早期海马中4-HNE水平逐渐升高，伴随着否2基因表达。在败血症后6小时、24小时和5天内检测到4-HNE（图1A） ●●●●。实时PCR分析显示否224小时和5天时，海马中的基因表达显著诱导，而第4个没有显著变化，表明否2与SAE中的脑氧化应激有关（图1B、 C）。为了阐明Nox2在SAE氧化损伤中的作用，我们用罗布青素治疗小鼠。用apocynin治疗可以阻止脓毒症引起的海马区4-HNE增加（图2A） 表明Nox2一定是SAE中海马ROS生成的主要贡献者。

图1

海马体中的氧化应激与 否2 脓毒症诱导后表达。在脓毒症发作后6小时、24小时和5天从WT小鼠中获得海马。（A）通过测量4-羟基壬醛（4-HNE）水平评估组织氧化应激，以假手术组增加的百分比表示。下图显示了一个具有代表性的Western blot，每个实验条件有两条带。（B） 否2和（C） 第4个脓毒症诱导后海马mRNA表达。白色条代表假发，黑色条代表脓毒症。统计显著性表示为：*P（P） < 0.05与假手术。每组n=5至7。Cyc：亲环素B。

图2

Apocynin治疗可预防脓毒症后早期海马区的氧化应激和星形胶质细胞增生。（A）在败血症发作后1小时用罗布麻素治疗WT小鼠。在脓毒症发作6小时后测量脑氧化应激。数值是4-HNE/亲环素B（低分子量负载控制）密度测定的比值，表示为平均值±SEM（每组n=4）。下图显示了Sham、Sham+Apo、Sepsis和Sepsis+Apo的两个代表性谱带。统计显著性表示为：*P（P） < 0.05和***P（P） < 0.001.（B）CA1区Iba-1免疫反应性的代表性数字图像（绿色）表明罗布麻素治疗不影响小胶质细胞的激活。（C）CA1区GFAP（绿色）免疫反应的典型数字图像显示星形胶质细胞突起增厚，尤其是血管周围；apocynin治疗可减少脓毒症后星形胶质细胞增生。核4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色显示为蓝色。图像代表了三个独立实验（每个实验组6个）。载脂蛋白：载脂蛋白。比例尺：20μm。

罗布麻素通过抑制星形胶质细胞增生调节败血症相关脑病（SAE）的神经炎症

脓毒症发作6小时后，WT动物的星形胶质细胞和小胶质细胞已经显著活化。活化的小胶质细胞表现出Iba1免疫反应增强和肥大形态（图2B） ●●●●。星形胶质细胞活化表现为细胞突起增厚和GFAP表达增加（图2C） ●●●●。apocynin对星形胶质细胞和小胶质细胞有不同的影响。载脂蛋白抑制星形胶质细胞活化，而小胶质细胞活化不受影响（图2).

脓毒症发作五天后，小胶质细胞和星形胶质细胞的激活更为明显，因此我们在此时间点对海马不同区域的胶质细胞激活进行量化，以确认形态学发现。小胶质细胞激活在CA1和DG区域（CA1大约146%; CA3类大约73%; 和DG大约151%). Apocynin治疗不能阻止CA1、CA3和DG中脓毒症诱导的小胶质细胞活化（图三A、 B、C和4A） ●●●●。脓毒症小鼠的活化星形胶质细胞数量显著增加，突起高度分枝且较厚（CA1大约87%; CA3类大约163%; 和DG大约166%与对照组相比）。罗布青素治疗逆转了所有分析海马区域的星形胶质细胞活化（CA1大约56%; CA3类大约63%; 和DG大约56%，数字三D、 E、F和4B） ●●●●。

图3

Apocynin治疗可选择性抑制脓毒症后星形胶质细胞的活化。脓毒症诱导对CA1中OX42样免疫反应的影响（A），CA3（B）和DG（C）CA1中的GFAP免疫反应（D），CA3（E）和DG（F）败血症发作后，允许动物在海马中存活五天。这些图表描述了光密度数据。在A、B和C中，统计显著性表示为：***P（P） < 0.001和**P（P） < 0.01与假手术。在D中**P（P） < 0.01与假手术**P（P） < 0.01与败血症。在E和F中***P（P） < 0.001与sham和***P（P） < 0.001与脓毒症。n=每种情况下5至6。DG：齿状回。

图4

Apocynin抑制海马齿状回的星形胶质细胞增生。OX42样免疫反应的典型数字图像（A）和GFAP样免疫反应（B）在脓毒症发病后5天，对WT-Sham、WT-Sham-罗布青素、WT脓毒症、WT-脓毒症罗布青霉素组的齿状回（DG）进行分析。

在Nox2基因敲除小鼠中，脓毒症相关脑病（SAE）诱导的神经炎症受损

为了进一步研究Nox2在胶质细胞激活中的作用，我们使用gp91^{凤凰（phox）-/-}并在脓毒症五天后评估海马不同区域星形胶质细胞和小胶质细胞的活化。我们观察到假gp91之间CD11b或GFAP免疫染色无明显差异^{凤凰（phox）-/-}和脓毒症gp91^{凤凰（phox）-/-}鼠标（图5). 这些结果表明，尽管apocynin治疗不能阻止小胶质细胞的激活，但功能性Nox2对SAE中的小胶质细胞激活是必要的。脓毒症诱导的星形胶质细胞活化在gp91中也受损^荧光粉-/-小鼠，表明星形胶质细胞完全依赖Nox2才能被激活（图5).

图5

Nox2的缺失可阻止gp91中的胶质细胞激活 ^{凤凰（phox）-/-} 老鼠。脓毒症诱导对CA1中OX42样免疫反应的影响（A），CA3（B）和DG（C）CA1中的GFAP免疫反应（E），CA3（F）和DG（G）gp91的^{凤凰（phox）-/-}败血症发作后，动物海马中的小鼠存活5天。这些图表显示了光密度数据。n=每种情况下5至6。（D）gp91中齿状回OX42样免疫反应的典型数字图像^{凤凰（phox）-/-}sham和gp91^{凤凰（phox）-/-}脓毒症小鼠。（H）gp91中DG中GFAP样免疫反应的典型数字图像^{凤凰（phox）-/-}sham和gp91^{凤凰（phox）-/-}脓毒症小鼠。

急性apocynin治疗预防脓毒症后长期认知功能障碍

为了验证诺克斯衍生氧化应激决定脓毒症幸存者行为结果的假设，我们在脓毒症急性期给动物服用低剂量的罗布青素（5 mg/kg），并进行行为测试，以评估脓毒症发作15天后幸存者的认知功能。脓毒症幸存小鼠在抑制回避试验中的潜伏期显著缩短，但用罗布青素治疗的脓毒症小鼠在该试验中没有表现出任何记忆缺陷（图6A） ●●●●。在莫里斯水迷宫测试中，脓毒症幸存者发现平台的时间增加（图6B） 并且在右象限花费的时间更少（图6C） ，而假动物和经apocynin处理的小鼠在这两项测试中都有更好的表现（图6). 这些结果表明，海马体的Nox2源性氧化损伤是与脓毒症相关的长期认知功能障碍相关的一个重要因素。

图6

Apocynin治疗可预防脓毒症后的认知功能障碍。WT小鼠（n=5～10/组）经腹腔接种粪浆诱发脓毒性脑病。对照组注射生理盐水（0.9%）。小鼠分为两组，分别在粪便注射后1小时和每24小时注射一次apocynin（5 mg/kg体重），连续治疗3天。所有动物在感染后6小时接受亚胺培南（10毫克/千克体重）治疗，每24小时接受一次，持续3天。（A）降压抑制回避试验。训练后24小时，通过记录平台上的延迟时间（截止时间为180秒）来测试厌恶性记忆。数据表示为单个值，水平线表示以秒为单位的平均延迟；假手术组小鼠与感染组小鼠之间存在显著差异（Mann–WhitneyU型-测试*P<0.05). 用Morris水迷宫评估空间记忆损伤。（B）是时候找到平台了。学生t吨-测试*P（P） < 0.05.（C）在没有平台的情况下进行试验。延迟表示移除平台之前所在象限上的探索。学生t吨-测试*P（P） < 0.05.

由败血症引起的全身炎症不会因Nox2的药理学抑制而减少

为了研究药物抑制Nox2对氧化应激、神经炎症和长期认知功能障碍发展的保护作用是否继发于全身炎症的减少，用罗布青素治疗动物，并在脓毒症诱导后测量细胞因子水平。我们专门研究了在脓毒症发作6小时后，载脂蛋白降低血浆和腹膜液中MCP-1和IL-1水平的能力。如图所示7A和B，我们观察到脓毒症发作后血浆和腹膜液中MCP-1水平显著升高，而这并没有被罗布青素治疗所抑制。IL-1水平仅在腹膜液中显著升高（图7C和D）。同样，罗布青素治疗不能显著抑制IL-1水平的升高。这些结果表明，与中心效应相反，罗布青素治疗不能预防脓毒症引起的全身炎症。

图7

脓毒症引起的全身炎症不受Nox2药理抑制的影响。脓毒症诱导对用罗布青素治疗的WT动物血浆和腹腔液中MCP-1和IL-1水平的影响。脓毒症发作后，允许小鼠存活6小时。所有浓度均以pg/ml表示。统计显著性表示为：***P（P） < 0.001; 每个试验组的n=6至10。

讨论

本研究的结果提供了证据，证明Nox2是参与SAE海马氧化损伤的活性氧的主要来源，并且Nox2衍生的活性氧是脓毒症后认知损伤的决定因素。有许多实验结果支持这些结论。首先，海马体存在渐进性氧化损伤，表现为4-HNE表达增加，与否2脓毒症后第1天的基因表达。其次，用罗布青素对Nox2进行药理学抑制可完全抑制脓毒症动物海马的氧化损伤。第三，药物抑制或gp91中无Nox2^{凤凰（phox）-/-}小鼠阻止胶质细胞激活，这是与SAE和其他神经退行性疾病相关的中枢机制之一[43——45]. 最后，在脓毒症急性期用罗布青素治疗可以防止幸存者出现长期认知功能障碍。我们的结果证实了先前的研究结果，即海马体的氧化损伤与SAE认知损伤的发展有关。这些结果还强调了Nox2衍生活性氧作为胶质细胞激活的中心机制的重要性，并确定Nox2是未来治疗SAE的潜在靶点。

脓毒症诱导的器官功能障碍被归因于组织对全身炎症的适应，包括线粒体功能障碍、氧化应激和生物能量学损伤[46,47]. 文献证据支持线粒体功能改变可能增加O2的假设^·-作为电子传输链副产品的生成，尤其是O2^·-源自复合物I[48——50]. 然而，在缺乏呼吸链抑制剂的情况下，复合物I作为完整线粒体中ROS生成的主要场所的作用仍然存在争议。我们小组以前的研究表明，在CLP小鼠模型中，脓毒症发作24小时后，脑组织中的氧化磷酸化效率和复合物IV活性降低。在这项研究中，我们无法检测到线粒体ROS的产生[47]这表明其他途径可能与脓毒症啮齿动物脑组织中观察到的氧化应激有关[9].

NADPH氧化酶活性增加与多种神经退行性疾病有关，如帕金森病和阿尔茨海默病（由[23,29]). 越来越多的证据表明，在脂质过氧化过程中内源性生成的醛分子，如4-HNE，与氧化应激相关的大多数病理生理效应都有因果关系体内[38]. 因此，我们假设来自NADPH氧化酶的ROS是脓毒症后氧化应激和脑功能障碍的主要原因。为了验证这个假设，我们使用了NADPH氧化酶的药理抑制和催化亚单位gp91的基因缺失^{凤凰（phox）}评估脓毒症的急性和长期预后。我们的数据显示，脓毒症小鼠大脑中的4-HNE水平在脓毒症后6小时至5天内开始升高。实时PCR分析表明否2，但不是第4个mRNA在脓毒症24小时后在海马中被诱导表达，而在6小时前检测到氧化应激，表明NADPH氧化酶活性在基因表达增加之前被诱导。罗布麻素处理在6小时时抑制了氧化应激，表明这可能是由Nox2酶活性增加引起的。Apocynin与p47的半胱氨酸残基反应^{凤凰（phox）}，一种复合物的细胞溶质成分，抑制其与Nox2-p22的关联^{凤凰（phox）}异二聚体及其酶活性。在其他急性脑损伤模型中，NADPH氧化酶活性早期增加，随后基因表达增加[51]. 因此，我们的数据补充了之前的观察结果，即线粒体不是脓毒症诱导后神经系统ROS的主要来源，脓毒症条件下海马ROS生成的很大一部分可归因于Nox2。

研究表明，Nox2可以调节小胶质细胞内的细胞内活性氧水平，并导致促炎细胞因子的产生和小胶质细胞对额外刺激的启动[52].体外研究表明，在6-羟基多巴胺和脂多糖（LPS）-帕金森病模型中，Nox2产生的活性氧对小胶质细胞的形态激活也至关重要[53——55]. 我们的免疫组化数据显示gp91中没有小胶质细胞激活^{凤凰（phox）-/-}脓毒症诱导后，与Nox2在信号小胶质细胞激活中的重要作用一致。然而，NADPH氧化酶抑制剂apocynin并没有阻止小胶质细胞的激活。解释这一发现的一种可能性是，正如Choi及其同事最近证明的那样，apocynin治疗并不抑制小胶质细胞的激活，而是将其表型改变为抗炎M2样表型[56].

相反，单剂量罗布麻素显著抑制了败血症后星形细胞的活化，这表明Nox2衍生的ROS在导致败血症后星形细胞活化的信号事件中发挥了作用。同样，有研究表明，与未经处理的组相比，经罗布青素处理的缺血动物的反应性星形胶质细胞显著减少[57]. 星形胶质细胞中NADPH氧化酶的激活可能导致氧化应激、谷胱甘肽耗竭和神经元死亡[58,59].

慢性肉芽肿病（CGD）患者，一种由编码NADPH氧化酶亚基的基因失活突变引起的免疫缺陷综合征[60,61]，对真菌和细菌感染的敏感性增加。使用NADPH氧化酶缺乏小鼠的临床前模型[62,63]在控制炎症方面显示出固有缺陷。汉族等（2013）证明p47^{凤凰（phox）-/-}LPS滴注后小鼠肺部炎症加重，这种效应是由于NF-κB与DNA结合增加所致[64]. 因此，抑制NADPH氧化酶可能对中枢神经系统有保护作用，但在控制全身炎症和/或感染方面可能有有害影响。值得注意的是，在我们的研究中，情况似乎并非如此，因为我们没有观察到经脱细胞素治疗的动物（数据未显示）和脓毒症诱导的炎症反应（如促炎细胞因子水平评估所示）的死亡率增加；这种结果可能是因为在我们的条件下，低剂量的NAPDH氧化酶被阻断。

虽然从文献中有足够的证据表明脓毒症幸存者会出现认知障碍，但脓毒症认知障碍的分子机制尚不清楚。一些假说被创建来解释与脓毒症相关的脑功能障碍，包括神经炎症、神经递质紊乱、细胞凋亡和氧化应激。来自动物研究的证据表明氧化损伤与长期认知障碍有关。巴里切罗等（2007年）证明，在败血症急性期给予抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸加去铁胺的组合可以防止长期的氧化损伤[65]. 在我们的研究中，我们证明Nox2衍生的活性氧是神经炎症和长期认知功能障碍发展的决定因素。调节Nox2活动的策略在未来可能有助于防止SAE的发展（图8).

图8

主要调查结果摘要。该图突出了Nox2参与与脓毒症相关脑病（SAE）相关的脑功能障碍及其长期后果。罗布青素抑制Nox2的激活，阻止活性氧的产生，而不影响小胶质细胞的激活。集团91^{凤凰（phox）}基因缺失损害脓毒症后小胶质细胞的激活。

结论

本研究的结果表明，Nox2对胶质细胞活化至关重要，并强调氧化损伤和Nox2衍生活性氧的关键作用是脓毒症后急性和长期脑功能障碍的中心因素。